Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een Scientist Development Grant (11SDG5190025) van de American Heart Association (naar A.R.-D.), en door het National Institute of Health R01 verleent AA-023764 (naar A.N.B.), en HL-104631 en R37 AA-11560 (aan A.M.D.

Alle experimentele procedures met dieren werden uitgevoerd op de University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). De verzorging van dieren en experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Comité voor dierverzorging en -gebruik van de UTHSC, een instelling die is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. Verrijking van weefsels en cellen met methyl-β-cyclodextrine verzadigd met cholesterol
<p c...

Methoden om weefsels en cellen van zoogdieren te verrijken en Xenopus-eicellen met cholesterol vormen een krachtig instrument voor het onderzoeken van het effect van verhoogde cholesterolniveaus op individuele moleculaire soorten, op complexe macromoleculaire systemen (bijvoorbeeld eiwitten) en op cellulaire en orgaanfunctie. In dit document hebben we twee complementaire benaderingen beschreven die dergelijke studies vergemakkelijken. Eerst beschreven we hoe we weefsels en cellen kunnen verrijken met cholesterol...

Cholesterol, een belangrijke cellulaire lipide, speelt tal van kritische functionele en structurele rollen1,2,3,4,5,6,7,8,9. Van het reguleren van de fysische eigenschappen van het plasmamembraan tot het waarborgen van de levensvatbaarheid van de cel, groei, proliferatie en het dienen als een signalering en voorlopermolecuul in een overvloed aan biochemische paden, cholesterol is een dwingende component die nodig is voor de normale cel- en orgaanfunctie. Als gevolg daarvan, cholesteroltekort resulteert in ernstige fysieke misvormingen en een verscheidenheid van aandoeningen. Aan de andere kant is zelfs een kleine stijging van cholesterol boven fysiologischniveau (2-3x) cytotox1,2,10 en is geassocieerd met de ontwikkeling van aandoeningen, waaronder cardiovasculaire11,,12,13 en neurodegeneratieve ziekten14,15,16,17. Dus, om de kritische functies van cholesterol te ondervragen en om het effect van veranderingen in het cholesterolgehalte te bepalen, zijn verschillende benaderingen ontwikkeld die het gehalte aan cholesterol in weefsels, cellen en Xenopus-eicellen veranderen.
Wijziging van het cholesterolgehalte in weefsels en cellen van zoogdieren Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt om het cholesterolgehalte in weefsels en cellen te verlagen18. Een benadering omvat hun blootstelling aan statines opgelost in lipoprotaire-deficiënte serum te remmen HMG-CoA reductase, die de snelheid van cholesterolsynthese controles19,20. Echter, deze cholesterolverlagende geneesmiddelen remmen ook de vorming van niet-sterol producten langs de mevalonaat pad. Daarom wordt een kleine hoeveelheid mevalonaat toegevoegd om de vorming van deze producten21 mogelijk te maken en de specificiteit van deze aanpak te verbeteren. Een andere benadering voor het verlagen van het cholesterolgehalte omvat het gebruik van β-cyclodextrines. Deze glucopyranose monomeren bezitten een interne hydrofobe holte met een diameter die overeenkomt met de grootte van sterolen22, die de extractie van cholesterol uit cellen vergemakkelijkt, waardoor ze uit hun eigen cholesterolgehalte23. Een voorbeeld is 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPβCD), een preklinisch geneesmiddel dat momenteel wordt getest voor de behandeling van de Niemann-Pick type C-ziekte, een genetisch erfelijke fatale stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door lysosomale cholesterolopslag24. Het niveau van cholesterol uitputting is afhankelijk van de specifieke afgeleide gebruikt. Zo haalt HPβCD cholesterol met een lagere capaciteit dan het gemethyleerde derivaat, methyl-β-cyclodextrine (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Met name kunnen β-cyclodextrines echter naast cholesterol ook andere hydrofobe moleculen extraheren, wat dan kan leiden tot niet-specifieke effecten31. In tegenstelling tot uitputting kunnen cellen en weefsels specifiek worden verrijkt met cholesterol door behandeling met β-cyclodextrine die is voorverzadigd met cholesterol23. Deze aanpak kan ook worden gebruikt als een controle voor de specificiteit van β-cyclodextrines die worden gebruikt voor cholesteroluitputting31. Uitputting van cholesterol uit weefsels en cellen is eenvoudig en kan worden bereikt door het blootstellen van de cellen voor 30-60 min tot 5 mM MβCD opgelost in het medium dat wordt gebruikt voor het opslaan van de cellen. Deze aanpak kan resulteren in een 50% afname van het cholesterolgehalte (bijvoorbeeld in hippocampalneuronen32, rat cerebrale slagaders33). Aan de andere kant, de voorbereiding van de β-cyclodextrine-cholesterol complex voor cholesterolverrijking van weefsel en cellen is complexer, en zal worden beschreven in het protocol sectie.
Een alternatieve benadering voor het verrijken van weefsels en cellen met β-cyclodextrine verzadigd met cholesterol omvat het gebruik van LDL, dat is gebaseerd op LDL-receptoren uitgedrukt in de weefsels/cellen18. Hoewel deze aanpak biedt het voordeel van het gebruik van de natuurlijke cholesterol homeostase machines van de cel, het heeft verschillende beperkingen. Ten eerste kunnen weefsels en cellen die de LDL-receptor niet uitdrukken, niet worden verrijkt met deze aanpak. Ten tweede bevatten LDL-deeltjes naast cholesterol ook andere lipiden. LdL bestaat met name uit het eiwit ApoB100 (25%) en de volgende lipiden (75%): ~6-8% cholesterol, ~45-50% cholesterylester, ~18-24% fosfolipiden, en ~4-8% triacylglycerols34. De levering van cholesterol via LDL-deeltjes is dus niet specifiek. Ten derde kan het percentage van de toename van het cholesterolgehalte door LDL in weefsels en cellen die de LDL-receptor uitdrukken aanzienlijk lager zijn dan de waargenomen toename met cyclodextrine verzadigd met cholesterol. Bijvoorbeeld, in een eerdere studie, verrijking van knaagdieren cerebrale slagaders met cholesterol via LDL resulteerde in slechts een 10-15% stijging van het cholesterolgehalte35. Daarentegen resulteerde de verrijking van deze slagaders met cyclodextrine verzadigd met cholesterol zoals beschreven in de protocolsectie in >50% verhoging van het cholesterolgehalte (zie sectie Representatieve resultaten, figuur 1).
Wijziging van het cholesterolgehalte in Xenopus-eicellen Xenopus-eicellen vormen een heterolog expressiesysteem dat vaak wordt gebruikt voor het bestuderen van de cel- en eiwitfunctie. Eerdere studies hebben aangetoond dat de cholesterol tot fosfolipide molaire verhouding in Xenopus-eicellen 0,5 ± 0,136is. Vanwege dit intrinsieke hoge cholesterolgehalte is het verhogen van het cholesterolgehalte in dit systeem een uitdaging, maar kan worden bereikt met behulp van dispersies gemaakt van membraanfosfolipiden en cholesterol. De fosfolipiden die we hiervoor hebben gekozen zijn vergelijkbaar met die welke worden gebruikt voor de vorming van kunstmatige vlakke lipide bilagen en omvatten L-α-phosphatidylethanolamine (POPE) en 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), zoals beschreven in de protocolsectie. Deze aanpak kan resulteren in >50% verhoging van het cholesterolgehalte (Zie representatieve resultaten sectie, figuur 2).
Een alternatieve benadering voor het verrijken van Xenopus-eicellen met op fosfolipiden gebaseerde dispersies omvat het gebruik van cyclodextrine verzadigd met cholesterol, wat vergelijkbaar is met de manier waarop weefsels en cellen worden verrijkt. Echter, we hebben gevonden deze aanpak te zijn van lage reproduceerbaarheid en efficiëntie, met een gemiddelde van ~ 25% toename van het cholesterolgehalte. Dit is mogelijk te wijten aan de verschillende laadcapaciteit van deze twee benaderingen (Zie representatieve resultaten, figuur 3). In tegenstelling, het is aangetoond dat het gebruik van cyclodextrine om cholesterol uit Xenopus eicellen uit te putten kan resulteren in een ~ 40% daling van het cholesterolgehalte36.
Hier richten we ons op cholesterolverrijking van zoogdierweefsels en -cellen door de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol, en van Xenopus-eicellen met liposomen. Beide benaderingen kunnen worden gebruikt om het effect van verhoogde niveaus van cholesterol op eiwitfunctie af te bepalen. De mechanismen van cholesterolmodulatie van de eiwitfunctie kunnen directe interacties8 en/of indirecte effecten omvatten9. Wanneer cholesterol de eiwitfunctie beïnvloedt via directe interacties, is het effect van een verhoging van het cholesterolgehalte op eiwitactiviteit waarschijnlijk onafhankelijk van het celtype, expressiesysteem of verrijkingsbenadering. Bijvoorbeeld, we gebruikten deze twee benaderingen om het effect van cholesterol op G-eiwit gated naar binnen gating kalium (GIRK) kanalen uitgedrukt in atrium myocyten37, hippocampal neuronen32,38, HEK29339 cellen, en Xenopus eicellen32,37. De resultaten van deze studies waren consistent: in alle drie de soorten zoogdiercellen en in amfibie-eicellen werd de gereglementeerde GIRK-kanaalfunctie (zie sectie Representatieve resultaten, figuur 4, voor hippocampalneuronen en de overeenkomstige experimenten in Xenopus-eicyten). Bovendien kwamen de waarnemingen in deze studies ook overeen met de resultaten van studies uitgevoerd bij atriummyocyten37,,40 en hippocampalneuronen32,38 vers geïsoleerd van dieren die onderworpen zijn aan een hoog cholesterolgehalte dieet40. Met name, cholesterolverrijking van hippocampal neuronen met behulp van MβCD omgekeerd het effect van atorvastatine therapie gebruikt voor het aanpakken van de impact van het hoog cholesteroldieet zowel op het cholesterolgehalte en GIRK functie38. In andere studies onderzochten we het effect van mutaties op de cholesterolgevoeligheid van het naar binnen gaan corrigerende kaliumkanaal Kir2.1 met behulp van zowel Xenopus-eicellen als HEK293-cellen41. Nogmaals, het effect van de mutaties op de gevoeligheid van het kanaal was vergelijkbaar in de twee systemen.
De toepassingen van beide verrijkingsmethoden voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus op moleculaire, cellulaire en orgaanfunctie zijn talrijk. In het bijzonder, het gebruik van cyclodextrine-cholesterol complexen om cellen en weefsels te verrijken is zeer gebruikelijk grotendeels te wijten aan de specificiteit. Recente voorbeelden van deze aanpak zijn de bepaling van de impact van cholesterol op herg kanaal activering en onderliggende mechanismen42, de ontdekking dat cholesterol activeert de G-eiwit gekoppelde receptor Gladgestreken ter bevordering van Hedgehog signalering43, en de identificatie van de rol van cholesterol in stamcelbiomechanica en adipogenese door middel van membraan-geassocieerde linker eiwitten44. In ons eigen werk gebruikten we weefselverrijking van zoogdieren met het MβCD:cholesterolcomplex om het effect van cholesterolverrijking op de basisfunctie en het farmacologische profiel van calcium- en voltage-gated kanalen van grote geleiding (BK, MaxiK) in vasculaire gladde spier35,45,,46te bestuderen. In andere studies gebruikten we de op fosfolipiden gebaseerde dispersiebenadering voor het verrijken van Xenopus-eicellen met cholesterol om de rollen van verschillende regio's in Kir2.1- en GIRK-kanalen in cholesterolgevoeligheid41,47,,49te bepalen, evenals om vermeende cholesterolbindende plaatsen in deze kanalen32,50,51te bepalen.48

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

Cholesterolverrijking van zoogdierweefsels en -cellen, waaronder Xenopus-eicellen die worden gebruikt voor het bestuderen van de celfunctie, kan worden bereikt met behulp van verschillende methoden. Hier beschrijven we twee belangrijke benaderingen die voor dit doel worden gebruikt. Ten eerste beschrijven we hoe we weefsels en cellen kunnen verrijken met cholesterol met behulp van cyclodextrine verzadigd met cholesterol met behulp van hersenslagaders (weefsels) en hippocampalneuronen (cellen) als voorbeelden. Deze benadering kan worden gebruikt voor elk type weefsel, cellen of cellijnen. Een alternatieve benadering voor cholesterolverrijking omvat het gebruik van low-density lipoprotein (LDL). Het voordeel van deze aanpak is dat het een deel van de natuurlijke cholesterol homeostase machines van de cel gebruikt. Hoewel de cyclodextrinebenadering kan worden toegepast om elk type cel met cholesterol te verrijken, is de LDL-benadering beperkt tot cellen die LDL-receptoren uitdrukken (bijvoorbeeld levercellen, beenmerg-afgeleide cellen zoals bloedleukocyten en weefselmacrofagen), en het verrijkingsniveau is afhankelijk van de concentratie en de mobiliteit van de LDL-receptor. Bovendien, LDL deeltjes omvatten andere lipiden, dus cholesterol levering is niet-specifiek. Ten tweede beschrijven we hoe xenopus-eicellen te verrijken met cholesterol met behulp van een op fosfolipiden gebaseerde dispersie (d.w.z. liposomen) die cholesterol bevat. Xenopus eicellen vormen een populaire heterologe expressie systeem dat wordt gebruikt voor het bestuderen van cel en eiwit functie. Voor zowel de op cyclodextrine gebaseerde cholesterolverrijkingsbenadering van zoogdierweefsel (hersenslagaders) als voor de op fosfolipiden gebaseerde cholesterolverrijkingsbenadering van Xenopus-eocyten, tonen we aan dat het cholesterolgehalte een maximum bereikt na 5 min incubatie. Dit cholesterolgehalte blijft constant tijdens langere incubatieperioden (bijvoorbeeld 60 min). Samen vormen deze gegevens de basis voor geoptimaliseerde temporele omstandigheden voor cholesterolverrijking van weefsels, cellen en Xenopus-eicellen voor functionele studies gericht op het ondervragen van de impact van cholesterolverrijking.

Het gebruik van cyclodextrine verzadigd met cholesterol als middel voor het verrijken van weefsels en cellen met cholesterol is goed ingeburgerd. Hier tonen we eerst de toepassing van deze veelgebruikte aanpak voor het verrijken van de hersenenslagaders van ratten met cholesterol met behulp van MβCD verzadigd met cholesterol. Figuur 1A toont een voorbeeld van een afgebeelde cerebrale slagader gladde spierlaag en toont de concentratie-afhanke...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Twee methoden van cholesterolverrijking worden gepresenteerd: de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol om zoogdierweefsels en -cellen te verrijken, en het gebruik van met cholesterol verrijkte fosforlipidengebaseerde dispersies (liposomen) om Xenopus-eocyten te verrijken. Deze methoden zijn instrumenteel voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus in moleculaire, cellulaire en orgaanfunctie.

Verrijking van zoogdierweefsels en Xenopus-eicyten met cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Verhoogde cholesterol is een belangrijke risicofactor voor cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekte. Onze protocollen bieden waardevolle instrumenten voor het bestuderen van zowel fysiologische als mechanistische gevolgen van hypercholesterolemie. Deze procedures kunnen worden uitgevoerd met behulp van basislabapparatuur en zijn van toepassing op cellen, weefsels en Xenopus-eicellen.Cholesterol is een belangrijk onderdeel van cellulaire membranen door het hele lichaam. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de impact van verhoogde niveaus van cholesterol in elk celtype te bestuderen. Ontleden van de slagaders is de moeilijkste stap.Verwijder de slagader voorzichtig uit de hersenen, zonder het vaatweefsel uit te rekken of te beschadigen. Lipiden zijn zeer delicaat, en werken met hen is meer een kunst dan een wetenschap. Video demonstratie biedt een gids voor het leren hoe om te gaan met lipiden zorgvuldig.Om de cholesterolverzadigde methyyl-bèta-cyclodextrine-oplossing voor te bereiden, voegt u eerst 064 gram methyle-bèta-cyclodextrine toe aan 10 milliliter PBS, waarbij de oplossing wordt geroerd met een roerstaaf, om ervoor te zorgen dat het methyl-bèta-cyclodextrine volledig oplost. Voeg vervolgens 0024 gram cholesterolpoeder toe aan de kolf en roer de oplossing krachtig door, met behulp van een spatel om zoveel mogelijk cholesterolbrokken te breken. Wanneer bijna alle cholesterol is opgelost, verzegel de kolf met ten minste twee lagen paraffinefilm.En schud de fles op ongeveer 30 oscillaties per minuut in een 37 graden Celsius waterbad 's nachts. Na acht tot 16 uur koelt u de oplossing af op kamertemperatuur, voordat u het mengsel door een 22 micrometer polyethersulfonespuitfilter in een klassefles filtert. Voor zoogdier cerebrale slagader verrijking, oogst de hersenen van een 250 tot 300 gram Sprague Dawley rat in een beker van PBS op ijs, voordat de overdracht van de hersenen in een gewaxte dissectie kom, onder een ontleden microscoop, met net genoeg PBS om het weefsel te dompelen.Zet de hersenen met twee tot drie pinnen vast en zorg ervoor dat ze geen bloedvaten binnendringen. En gebruik scherpe tangen en kleine chirurgische schaar om zachtjes ontleden de cerebrale slagaders en hun takken die de cirkel van Willis vormen aan de basis van de hersenen. Spoel vervolgens kort tot een centimeter lange slagadersegmenten in PBS, voordat u de gespoelde segmenten in voldoende cholesterolverrijktoplossing uitbroedt om de weefsels te bedekken.Om eventuele veranderingen in het cholesterolgehalte te bepalen, gebruik maken van een verse fles filipin poeder om een 10 milligram per milliliter voorraad oplossing van de kleurstof in dimethyl sulfoxide voor te bereiden, en was het cholesterolverrijkte weefsels met drie vijf minuten wasbeurten in verse PBS. Na de laatste wasbeurt, bevestig de slagader segmenten in 4%paraformaldehyde gedurende 15 minuten op ijs, beschermd tegen licht, voordat permeabilizing de monsters in 5%Triton in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de weefsels met drie vijf minuten wast in PBS op een shaker, alvorens de monsters toe te voegen aan een 25 microgram per milliliter uiteindelijke concentratie van filipin kleurstof oplossing, gedurende een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de slagader stukken drie keer zoals aangetoond, gevolgd door een korte spoeling met gedestilleerd water. Na de laatste wasbeurt, gebruik maken van een lab weefsel om overtollige vloeistof te absorberen, en monteer de slagaders op een dia met behulp van een geschikte montage medium. Bedek de slagaders voorzichtig met een afdeksel, zorg ervoor dat het weefsel niet wordt gerold of gedraaid, en laat de glijbaan 24 uur drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.Wanneer het montagemedium droog is, sluit u de randen van de afdekking af met heldere nagellak en laat u de polijst 10 tot 15 minuten drogen. Beeld vervolgens het weefsel met een excitatie van 340 tot 380 nanometer en een emissie van 385 tot 470 nanometer. Voor de voorbereiding van de fosfor op basis van dispersie, combineren 200 microliters van 10 milligram per milliliter chloroform opgelostlipide oplossing, L-alpha-fosfatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, en cholesterol in een 12 milliliter glazen buis.Verdamp de chloroform in de kap onder een stroom stikstof, voordat u de lipiden opschont in 800 microliter van gebufferde 150 millimolar kaliumchloride en 10 millimolar Tris HEPES oplossing. Sluit vervolgens de buis af met paraffinefilm en sonisch de buisinhoud op 80 kilohertz gedurende 10 minuten, totdat een melkachtig mengsel wordt gevormd. Voor cholesterolverrijking van Xenopus eicellen, gebruik scherpe tangen om de eierstokzak van een vrouwelijke Xenopus laevis kikker in meerdere regio's te verstoren, en plaats de eierstok brokken in een 60 millimeter plaat met vijf milliliter calcium vrije ND96 aangevuld met 5 milligram per milliliter collagenase.Schud het weefsel op een orbitale shaker met 60 oscillaties per minuut gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik aan het einde van de incubatie een transferpipet met een brede tip om de eiceloplossing vijf tot 10 keer krachtig te pipetteen om de afzonderlijke eicellen te isoleren en spoel snel de donkere eiceloplossing af met verse calciumvrije ND96 totdat de oplossing transparant wordt. Breng vervolgens 90 microliters van de cholesterolverrijkte fosfor op basis van dispersie over in een put van een 96-putplaat en voeg maximaal zes eicellen toe aan de put met zo weinig mogelijk medium.Plaats de 96 put plaat op een driedimensionaal platform rotator voor vijf tot 10 minuten. Voeg vervolgens een druppel ND96 toe aan de put en breng de cholesterolverrijkte eicellen over naar een 35 millimeter plaat met ND96 voor hun onmiddellijke analyse. Hier, een voorbeeld van een afgebeelde cerebrale slagader gladde spierlaag toont de concentratie afhankelijke toename van filipin geassocieerde fluorescentie verkregen bij weefselverrijking met toenemende concentraties van cholesterol.Met name drie uur na de behandeling met het methyyl-bèta-cyclodextrine cholesterolcomplex daalde het cholesterolgehalte met ongeveer 50% ten opzichte van hun niveau onmiddellijk na de verrijking. Terwijl een een uur incubatietijd wordt vaak gebruikt om de weefsels en cellen te verrijken met cholesterol tijdens deze aanpak, vijf minuten van incubatie is meestal voldoende om een statistisch significante toename van cerebrale arteriële cholesterolgehalte zoals bepaald door cholesterol oxidase gebaseerd biochemische test te bereiken. Terwijl er geen significante verandering wordt waargenomen in het cholesterolgehalte in Xenopus eicellen verrijkt met controle fosfolipiden gebaseerde dispersies zonder cholesterol, cholesterolgehalte aanzienlijk toenemen na slechts vijf minuten van de behandeling met de fosfolipiden op basis van dispersies die cholesterol omvatten, en blijven op dit niveau wanneer de incubatietijd wordt verhoogd tot 60 minuten.De effectiviteit van de cyclodextrine gebaseerde aanpak voor het verrijken van cellen wordt ook aangetoond in neuronen vers geïsoleerd uit de CA1 regio van de hippocampus. Inderdaad, incubatie van de neuronen in methyl-bèta-cyclodextrine verzadigd met cholesterol gedurende 60 minuten resulteert in een meer dan twee keer toename van het cholesterolgehalte, zoals beoordeeld door de filipin geassocieerde fluorescentie. Globaal, zijn de twee belangrijkste stappen voor deze procedures het voorbereiden van het mengsel van de cholesterolverrijking en het verzekeren van de integriteit van het arteriële weefsel.Na cholesterolverrijking kan men de functie bestuderen van de eiwitten die worden beïnvloed door hypercholesterolemie. De mogelijkheid om cellen te verrijken met cholesterol vergemakkelijkt de studie van verhoogde cholesterolniveaus in cardiomyocyten en neuronen. Het gebruik van eicellen stelde ons in staat om te onderzoeken hoe cholesterol zich bindt aan ionenkanalen.Een lab jas en handschoenen ze altijd worden gedragen voor dit protocol. Chloroform en paraformaldehyde moeten onder een rookkap worden gebruikt en als gevaarlijk afval worden weggegooid.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...