Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par une subvention pour le développement scientifique (11SDG5190025) de l’American Heart Association (à A.R.-D.), et par les subventions AA-023764 (à A.N.B.), et HL-104631 et R37 AA-11560 (à A.M.D.).

Toutes les procédures expérimentales avec des animaux ont été effectuées à l’Université du Tennessee Health Science Center (UTHSC). Les soins aux animaux et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’UTHSC, qui est une institution accréditée par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. Enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de méthyle-c...

Les méthodes d’enrichissement des tissus et des cellules des mammifères et des oocytes Xenopus avec le cholestérol constituent un outil puissant pour étudier l’effet des taux élevés de cholestérol sur les espèces moléculaires individuelles, sur les systèmes macromoléculaires complexes (p. ex. protéines) et sur la fonction cellulaire et des organes. Dans cet article, nous avons décrit deux approches complémentaires qui facilitent de telles études. Tout d’abord, nous avons décrit comment enri...

Le cholestérol, un lipide cellulaire majeur, joue de nombreux rôles fonctionnels et structurels critiques1,2,3,4,5,6,7,8,9. De la régulation des propriétés physiques de la membrane plasmatique à assurer la viabilité cellulaire, la croissance, la prolifération, et servant de molécule de signalisation et de précurseur dans une pléthore de voies biochimiques, le cholestérol est un composant impératif nécessaire pour la fonction normale de cellules et d’organes. En conséquence, l’insuffisance de cholestérol a comme conséquence des malformations physiques graves et une série de désordres. D’autre part, même une petite augmentation du cholestérol au-dessus des niveaux physiologiques (2-3x) est cytotoxique1,2,10 et a été associée au développement de troubles, y compris cardio-vasculaire11,12,13 et les maladies neurodégénératives14,15,16,17. Ainsi, pour interroger les fonctions critiques du cholestérol et pour déterminer l’effet des changements dans les niveaux de cholestérol, différentes approches qui modifient la teneur en cholestérol dans les tissus, les cellules et les oocytes Xénoopeus ont été développées.
Modification des taux de cholestérol dans les tissus et les cellules des mammifères Plusieurs approches peuvent être exploitées pour diminuer les niveaux de cholestérol dans les tissus et les cellules18. Une approche implique leur exposition aux statines dissoutes dans le sérum lipoprotéine-déficiente pour inhiber la réductase de HMG-CoA, qui contrôle le taux de synthèse de cholestérol19,20. Cependant, ces médicaments abaissant le cholestérol inhibent également la formation des produits non-sterol le long de la voie de mévalonate. Par conséquent, une petite quantité de mévalonate est ajoutée pour permettre la formation de ces produits21 et d’améliorer la spécificité de cette approche. Une autre approche pour réduire le taux de cholestérol implique l’utilisation de 'cyclodextrines. Ces monomers de glucopyranose possèdent une cavité hydrophobe interne avec un diamètre qui correspond à la taille des stérols22, ce qui facilite l’extraction du cholestérol des cellules, les appauvrissant ainsi de leur teneur en cholestérol indigène23. Un exemple est 2-hydroxypropyl-----cyclodextrine (HP-CD), un médicament préclinique actuellement testé pour le traitement de la maladie de type C Niemann-Pick, un trouble métabolique mortel héréditaire génétiquement héréditaire caractérisé par le stockage lysosomal de cholestérol24. Le niveau d’épuisement du cholestérol dépend du dérivé spécifique utilisé. Par exemple, HP-CD extrait le cholestérol avec une capacité inférieure au dérivé méthylé, méthyle--cyclodextrine (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Notamment, cependant, les cyclodextrines peuvent également extraire d’autres molécules hydrophobes en plus du cholestérol, ce qui peut alors entraîner des effets non spécifiques31. Contrairement à l’épuisement, les cellules et les tissus peuvent être spécifiquement enrichis avec le cholestérol par le traitement avec la cyclodextrine qui a été présaturée avec le cholestérol23. Cette approche peut également être utilisée comme un contrôle de la spécificité des cyclodextrines utilisées pour l’épuisement du cholestérol31. L’épuisement du cholestérol des tissus et des cellules est simple et peut être réalisé en exposant les cellules de 30 à 60 min à 5 mM M-CD dissous dans le milieu utilisé pour stocker les cellules. Cette approche peut entraîner une diminution de 50% de la teneur en cholestérol (par exemple, dans les neurones hippocampal32, les artères cérébrales rat33). D’autre part, la préparation du complexe de l’enrichissement du cholestérol et du cholestérol est plus complexe et sera décrite dans la section du protocole.
Une approche alternative à l’enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de la cyclodextrine saturée de cholestérol implique l’utilisation de LDL, qui repose sur les récepteurs LDL exprimés dans les tissus / cellules18. Bien que cette approche offre l’avantage d’utiliser la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule, elle a plusieurs limites. Tout d’abord, les tissus et les cellules qui n’expriment pas le récepteur LDL ne peuvent pas être enrichis en utilisant cette approche. Deuxièmement, les particules LDL contiennent d’autres lipides en plus du cholestérol. Plus précisément, LDL est composé de la protéine ApoB100 (25%) et les lipides suivants (75 %) : 6 à 8 % de cholestérol, 45 à 50 % d’ester de cholestéle, 18 à 24 % de phospholipides et 4 à 8 % de triacylglycerols34. Ainsi, l’administration du cholestérol via les particules LDL n’est pas spécifique. Troisièmement, le pourcentage d’augmentation de la teneur en cholestérol par LDL dans les tissus et les cellules qui expriment le récepteur LDL peut être significativement inférieur à l’augmentation observée à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol. Par exemple, dans une étude précédente, l’enrichissement des artères cérébrales rongeurs avec le cholestérol par l’intermédiaire de LDL a eu comme conséquence seulement une augmentation de 10-15% des niveaux de cholestérol35. En revanche, l’enrichissement de ces artères avec la cyclodextrine saturée de cholestérol tel que décrit dans la section du protocole a entraîné une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (Voir la section des résultats représentatifs, figure 1).
Modification des taux de cholestérol chez les oocytes Xenopus Les ocytes Xénoopeus constituent un système d’expression hétérologue couramment utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Des études antérieures ont montré que le taux de cholestérol à la molaire phospholipide chez les oocytes Xenopus est de 0,5 à 0,136. En raison de ce niveau intrinsèque élevé de cholestérol, l’augmentation de la teneur en cholestérol dans ce système est difficile, mais peut être atteint en utilisant des dispersions faites à partir de phospholipides membranaires et le cholestérol. Les phospholipides que nous avons choisis à cette fin sont similaires à ceux utilisés pour former des bilayers de lipides planaires artificiels et comprennent L-phosphatidylethanolamine (POPE) et 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), tel que décrit dans la section du protocole. Cette approche peut entraîner une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (voir la section des résultats représentatifs, figure 2).
Une approche alternative à l’enrichissement des oocytes Xenopus avec des dispersions à base de phospholipid implique l’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol, qui est similaire à la façon dont les tissus et les cellules sont enrichis. Cependant, nous avons constaté que cette approche était de faible reproductibilité et d’efficacité, avec une augmentation moyenne de 25 % de la teneur en cholestérol. Cela est peut-être dû à la capacité de chargement différente de ces deux approches (voir la section des résultats représentatifs, figure 3). En revanche, il a été démontré que l’utilisation de cyclodextrine pour épuiser le cholestérol des oocytes Xenopus peut entraîner une diminution de 40% de la teneur en cholestérol36.
Ici, nous nous concentrons sur l’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules de mammifères par l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol, et des oocytes Xenopus utilisant des liposomes. Les deux approches peuvent être exploitées pour délimiter l’effet de l’augmentation des niveaux de cholestérol sur la fonction protéique. Les mécanismes de modulation de cholestérol de la fonction protéique peuvent impliquer des interactions directes8 et/ou des effets indirects9. Lorsque le cholestérol affecte la fonction protéique par le biais d’interactions directes, l’effet d’une augmentation du taux de cholestérol sur l’activité protéique est probablement indépendant du type cellulaire, du système d’expression ou de l’approche d’enrichissement. Par exemple, nous avons utilisé ces deux approches pour déterminer l’effet du cholestérol sur les canaux de potassium rectifiant intérieurement (GIRK) de G-protéine (GIRK) exprimés dans les myocytes auriculaires37, neurones hippocampiques32,38, HEK29339 cellules, et Oocytes Xenopus 32,37. Les résultats obtenus dans ces études étaient cohérents : dans les trois types de cellules de mammifères et dans les oocytes amphibiens, le cholestérol a augmenté la fonction du canal GIRK (voir la section des résultats représentatifs, figure 4, pour les neurones hippocampiques et les expériences correspondantes dans les oocytes Xenopus). En outre, les observations faites dans ces études étaient également compatibles avec les résultats des études menées dans les myocytes auriculaires37,40 et neurones hippocampiques32,38 fraîchement isolés des animaux soumis à un régime à taux de cholestérol élevé40. Notamment, l’enrichissement du cholestérol des neurones hippocampal à l’aide de M -CD a inversé l’effet de la thérapie d’atorvastatine utilisée pour répondre à l’impact de l’alimentation à taux élevé de cholestérol à la fois sur les niveaux de cholestérol et la fonction GIRK38. Dans d’autres études, nous avons étudié l’effet des mutations sur la sensibilité au cholestérol du canal de potassium rectifiant intérieurement Kir2.1 utilisant les ocytes Xenopus et les cellules HEK29341. Encore une fois, l’effet des mutations sur la sensibilité du canal était similaire dans les deux systèmes.
Les applications des deux méthodes d’enrichissement pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol sur la fonction moléculaire, cellulaire et d’organe sont nombreuses. En particulier, l’utilisation de complexes cyclodextrine-cholestérol pour enrichir les cellules et les tissus est très fréquente en grande partie en raison de sa spécificité. Des exemples récents de cette approche incluent la détermination de l’impact du cholestérol sur l’activation du canal HERG et les mécanismes sous-jacents42, la découverte que le cholestérol active le récepteur couplé à la protéine G Smoothened pour promouvoir la signalisation hérisson43, et l’identification du rôle du cholestérol dans la biomécanique des cellules souches et l’adipogenèse par les protéines linker associées à la membrane44. Dans nos propres travaux, nous avons utilisé l’enrichissement des tissus mammifères avec le complexe de cholestérol M-CD: pour étudier l’effet de l’enrichissement du cholestérol sur la fonction de base et le profil pharmacologique des canaux de grande conductance de calcium et de tension (BK, MaxiK) dans le muscle lisse vasculaire35,45,46. Dans d’autres études, nous avons utilisé l’approche de dispersion à base de phospholipid pour enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol pour déterminer les rôles des différentes régions dans les canaux Kir2.1 et GIRK dans la sensibilité au cholestérol41,47,48,49, ainsi que pour déterminer les sites de liaison de cholestérol putatif dans ces canaux32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

L’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules des mammifères, y compris les oocytes Xenopus utilisés pour étudier la fonction cellulaire, peut être accompli en utilisant une variété de méthodes. Ici, nous décrivons deux approches importantes utilisées à cette fin. Tout d’abord, nous décrivons comment enrichir les tissus et les cellules avec du cholestérol à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol à l’aide d’artères cérébrales (tissus) et de neurones hippocampiques (cellules) à titre d’exemples. Cette approche peut être utilisée pour n’importe quel type de tissu, cellules ou lignées cellulaires. Une approche alternative pour l’enrichissement du cholestérol implique l’utilisation de lipoprotéines de faible densité (LDL). L’avantage de cette approche est qu’elle utilise une partie de la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule. Cependant, alors que l’approche de la cyclodextrine peut être appliquée pour enrichir n’importe quel type d’intérêt cellulaire avec le cholestérol, l’approche LDL est limitée aux cellules qui expriment les récepteurs LDL (par exemple, les cellules hépatiques, les cellules dérivées de la moelle osseuse telles que les leucocytes sanguins et les macrophages tissulaires), et le niveau d’enrichissement dépend de la concentration et de la mobilité du récepteur LDL. En outre, les particules de LDL incluent d’autres lipides, ainsi l’accouchement de cholestérol est non spécifique. Deuxièmement, nous décrivons comment enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol à l’aide d’une dispersion à base de phospholipid (c.-à-d. liposomes) qui comprend le cholestérol. Les ocytes Xenopus constituent un système d’expression hétérologue populaire utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de cyclodextrine du tissu mammifère (artères cérébrales) et pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de phospholipid des oocytes Xenopus, nous démontrons que les niveaux de cholestérol atteignent un maximum après 5 min d’incubation. Ce taux de cholestérol demeure constant pendant les périodes prolongées d’incubation (p. ex., 60 min). Ensemble, ces données fournissent la base pour des conditions temporelles optimisées pour l’enrichissement de cholestérol des tissus, des cellules, et des oocytes de Xénoopus pour des études fonctionnelles visant à interroger l’impact de l’enrichissement de cholestérol.

L’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol comme moyen d’enrichir les tissus et les cellules avec le cholestérol est bien établie. Ici, nous démontrons d’abord l’application de cette approche largement utilisée pour enrichir les artères cérébrales de rat avec le cholestérol utilisant M-CD saturé de cholestérol. La figure 1A montre un exemple d’une couche musculaire lisse de l’artère cérébrale image et dé...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Deux méthodes d’enrichissement du cholestérol sont présentées : l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol pour enrichir les tissus et les cellules des mammifères, et l’utilisation de dispersions à base de phospholipides enrichies de cholestérol (liposomes) pour enrichir les oocytes Xenopus. Ces méthodes sont instrumentales pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans la fonction moléculaire, cellulaire, et d’organe.

Enrichissement des tissus mammifères et des oocytes Xenopus avec du cholestérol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

L’hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Nos protocoles fournissent des outils précieux pour étudier les conséquences physiologiques et mécanistes de l’hypercholestérolémie. Ces procédures peuvent être effectuées à l’aide de l’équipement de laboratoire de base, et sont applicables aux cellules, tissus et ovocytes Xenopus.Le cholestérol est un composant majeur des membranes cellulaires dans tout le corps. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans n’importe quel type de cellule. Disséquer les artères est l’étape la plus difficile.Retirez soigneusement l’artère du cerveau, sans étirer ni endommager le tissu vasculaire. Les lipides sont très délicats, et travailler avec eux est plus un art qu’une science. Démonstration vidéo fournit un guide pour apprendre à gérer les lipides avec soin.Pour préparer la solution de méthyl-bêta-cyclodextrine saturée de cholestérol, ajoutez d’abord 064 grammes de méthyl-bêta-cyclodextrine à 10 millilitres de PBS, en remuant la solution avec une barre de remue-remuer, pour s’assurer que la méthyl-bêta-cyclodextrine se dissout complètement. Ensuite, ajouter 0024 grammes de poudre de cholestérol à la fiole, et remuer la solution vigoureusement, à l’aide d’une spatule pour briser autant de morceaux de cholestérol que possible. Lorsque presque tout le cholestérol a été dissous, sceller le flacon avec au moins deux couches de film de paraffine.Et secouez le flacon à environ 30 oscillations par minute dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après huit à 16 heures, refroidir la solution à température ambiante, avant de filtrer le mélange à travers un filtre à seringue polyethersulfone de 22 micromètres dans une bouteille de classe. Pour l’enrichissement de l’artère cérébrale des mammifères, récolter le cerveau d’un rat Sprague Dawley de 250 à 300 grammes dans un bécher de PBS sur la glace, avant de transférer le cerveau dans un bol de dissection ciré, sous un microscope dissection, contenant juste assez de PBS pour submerger le tissu.Fixez le cerveau avec deux à trois broches, en vous assurant qu’ils ne pénètrent pas dans les vaisseaux sanguins. Et utilisez des forceps pointus et de petits ciseaux chirurgicaux pour disséquer doucement les artères cérébrales et leurs branches qui forment le Cercle de Willis à la base du cerveau. Ensuite, rincez brièvement jusqu’à un centimètre de long segments d’artère dans PBS, avant d’incuber les segments rincés dans suffisamment de cholestérol solution enrichissante pour couvrir les tissus.Pour déterminer toute altération du taux de cholestérol, utilisez une bouteille fraîche de poudre de filipin pour préparer une solution de bouillon de 10 milligrammes par millilitre du colorant dans du sulfoxyde de diméthyle, et lavez les tissus enrichis en cholestérol avec trois lavages de cinq minutes dans du PBS frais. Après le dernier lavage, fixer les segments d’artère en 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes sur la glace, à l’abri de la lumière, avant de perméabiliser les échantillons dans 5%Triton en PBS pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les tissus avec trois lavages de cinq minutes en PBS sur un shaker, avant d’ajouter les échantillons à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre de solution de colorant filipin, pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, laver les œuvres de l’artère trois fois comme démontré, suivie d’un bref rinçage à l’eau distillée. Après le dernier lavage, utilisez un tissu de laboratoire pour absorber tout excès de liquide et montez les artères sur une lame à l’aide d’un support de montage approprié. Couvrez soigneusement les artères d’un glissement de couvercle, en prenant soin d’éviter de rouler ou de tordre le tissu, et laissez sécher la glissade pendant 24 heures à température ambiante, à l’abri de la lumière.Lorsque le milieu de montage est sec, sceller les bords de glissement de couverture avec du vernis à ongles clair, et laisser sécher le vernis pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, imagez le tissu avec une excitation de 340 à 380 nanomètres, et une émission de 385 à 470 nanomètres. Pour préparer la dispersion à base de phospholipide, combinez 200 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de solution lipidique dissoute chloroforme, L-alpha-phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, et cholestérol dans un tube de verre de 12 millilitres.Évaporer le chloroforme dans le capot sous un flux d’azote, avant de suspendre les lipides dans 800 microlitres de chlorure de potassium tamponné de 150 millimlaires et de 10 millimlaires tris HEPES solution. Ensuite, sceller le tube avec du film de paraffine, et sonifier doucement le contenu du tube à 80 kilohertz pendant 10 minutes, jusqu’à ce qu’un mélange laitier soit formé. Pour l’enrichissement en cholestérol des ovocytes Xenopus, utilisez des forceps tranchants pour perturber le sac ovarien d’une grenouille femelle Xenopus laevis dans plusieurs régions, et placez les morceaux d’ovaire dans une plaque de 60 millimètres avec cinq millilitres de ND96 sans calcium complétés par 5 milligrammes par millilitre de collagène.Secouez le tissu sur un shaker orbital à 60 oscillations par minute pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, utiliser une pipette de transfert avec une pointe large pour pipette vigoureusement l’ovocyte contenant la solution cinq à dix fois pour isoler les ovocytes individuels, et rincer rapidement la solution d’ovocyte foncé avec nd96 frais sans calcium jusqu’à ce que la solution devienne transparente. Ensuite, transférez 90 microlitres de la dispersion à base de phospholipide enrichie en cholestérol dans un puits d’une plaque de puits de 96, et ajoutez jusqu’à six ovocytes au puits avec le moins de milieu possible.Placez la plaque de puits 96 sur un rotateur de plate-forme tridimensionnel pendant cinq à dix minutes. Ajoutez ensuite une goutte de ND96 au puits et transférez les ovocytes enrichis en cholestérol dans une plaque de 35 millimètres contenant du ND96 pour leur analyse immédiate. Ici, un exemple d’une couche lisse d’artère cérébrale imaged démontre l’augmentation dépendante de concentration de fluorescence associée de filipin obtenue sur l’enrichissement de tissu avec des concentrations croissantes de cholestérol.Notamment trois heures après le traitement par le complexe de cholestérol méthylique-bêta-cyclodextrine, les taux de cholestérol ont diminué d’environ 50% par rapport à leur niveau immédiatement après l’enrichissement. Tandis qu’un temps d’incubation d’une heure est couramment employé pour enrichir les tissus et les cellules avec le cholestérol pendant cette approche, cinq minutes d’incubation sont habituellement suffisantes pour réaliser une augmentation statistiquement significative de la teneur en cholestérol artérielle cérébral telle que déterminée par l’essai biochimique basé sur l’oxidase de cholestérol. Bien qu’aucun changement significatif ne soit observé dans les niveaux de cholestérol dans les ovocytes Xenopus enrichis de dispersions à base de phospholipide de contrôle manquant de cholestérol, les niveaux de cholestérol augmentent de manière significative après seulement cinq minutes de traitement avec les dispersions à base de phospholipide qui incluent le cholestérol, et restent à ce niveau lorsque le temps d’incubation est augmenté à 60 minutes.L’efficacité de l’approche basée sur la cyclodextrine pour enrichir les cellules est également démontrée chez les neurones fraîchement isolés de la région CA1 de l’hippocampe. En effet, l’incubation des neurones dans le méthyl-bêta-cyclodextrine saturé de cholestérol pendant 60 minutes entraîne une augmentation de plus de deux fois du taux de cholestérol, tel qu’évalué par la fluorescence associée aux filipins. Dans l’ensemble, les deux étapes les plus importantes pour ces procédures sont la préparation du mélange d’enrichissement du cholestérol et d’assurer l’intégrité du tissu artérielle.Après l’enrichissement du cholestérol, on peut étudier la fonction des protéines qui sont affectées par l’hypercholestérolémie. La capacité d’enrichir les cellules avec le cholestérol a facilité l’étude des niveaux élevés de cholestérol dans les cardiomyocytes et les neurones. L’utilisation d’ovocytes nous a permis d’étudier comment le cholestérol se lie aux canaux irionaux.Un manteau de laboratoire et des gants qu’elle porte toujours pour ce protocole. Le chloroforme et le paraformaldéhyde doivent être utilisés sous un capot de fumée et être jetés comme déchets dangereux.

Research

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Biochemistry

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