Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par une subvention pour le développement scientifique (11SDG5190025) de l’American Heart Association (à A.R.-D.), et par les subventions AA-023764 (à A.N.B.), et HL-104631 et R37 AA-11560 (à A.M.D.).

Toutes les procédures expérimentales avec des animaux ont été effectuées à l’Université du Tennessee Health Science Center (UTHSC). Les soins aux animaux et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’UTHSC, qui est une institution accréditée par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. Enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de méthyle-c...

Les méthodes d’enrichissement des tissus et des cellules des mammifères et des oocytes Xenopus avec le cholestérol constituent un outil puissant pour étudier l’effet des taux élevés de cholestérol sur les espèces moléculaires individuelles, sur les systèmes macromoléculaires complexes (p. ex. protéines) et sur la fonction cellulaire et des organes. Dans cet article, nous avons décrit deux approches complémentaires qui facilitent de telles études. Tout d’abord, nous avons décrit comment enri...

Le cholestérol, un lipide cellulaire majeur, joue de nombreux rôles fonctionnels et structurels critiques1,2,3,4,5,6,7,8,9. De la régulation des propriétés physiques de la membrane plasmatique à assurer la viabilité cellulaire, la croissance, la prolifération, et servant de molécule de signalisation et de précurseur dans une pléthore de voies biochimiques, le cholestérol est un composant impératif nécessaire pour la fonction normale de cellules et d’organes. En conséquence, l’insuffisance de cholestérol a comme conséquence des malformations physiques graves et une série de désordres. D’autre part, même une petite augmentation du cholestérol au-dessus des niveaux physiologiques (2-3x) est cytotoxique1,2,10 et a été associée au développement de troubles, y compris cardio-vasculaire11,12,13 et les maladies neurodégénératives14,15,16,17. Ainsi, pour interroger les fonctions critiques du cholestérol et pour déterminer l’effet des changements dans les niveaux de cholestérol, différentes approches qui modifient la teneur en cholestérol dans les tissus, les cellules et les oocytes Xénoopeus ont été développées.
Modification des taux de cholestérol dans les tissus et les cellules des mammifères Plusieurs approches peuvent être exploitées pour diminuer les niveaux de cholestérol dans les tissus et les cellules18. Une approche implique leur exposition aux statines dissoutes dans le sérum lipoprotéine-déficiente pour inhiber la réductase de HMG-CoA, qui contrôle le taux de synthèse de cholestérol19,20. Cependant, ces médicaments abaissant le cholestérol inhibent également la formation des produits non-sterol le long de la voie de mévalonate. Par conséquent, une petite quantité de mévalonate est ajoutée pour permettre la formation de ces produits21 et d’améliorer la spécificité de cette approche. Une autre approche pour réduire le taux de cholestérol implique l’utilisation de 'cyclodextrines. Ces monomers de glucopyranose possèdent une cavité hydrophobe interne avec un diamètre qui correspond à la taille des stérols22, ce qui facilite l’extraction du cholestérol des cellules, les appauvrissant ainsi de leur teneur en cholestérol indigène23. Un exemple est 2-hydroxypropyl-----cyclodextrine (HP-CD), un médicament préclinique actuellement testé pour le traitement de la maladie de type C Niemann-Pick, un trouble métabolique mortel héréditaire génétiquement héréditaire caractérisé par le stockage lysosomal de cholestérol24. Le niveau d’épuisement du cholestérol dépend du dérivé spécifique utilisé. Par exemple, HP-CD extrait le cholestérol avec une capacité inférieure au dérivé méthylé, méthyle--cyclodextrine (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Notamment, cependant, les cyclodextrines peuvent également extraire d’autres molécules hydrophobes en plus du cholestérol, ce qui peut alors entraîner des effets non spécifiques31. Contrairement à l’épuisement, les cellules et les tissus peuvent être spécifiquement enrichis avec le cholestérol par le traitement avec la cyclodextrine qui a été présaturée avec le cholestérol23. Cette approche peut également être utilisée comme un contrôle de la spécificité des cyclodextrines utilisées pour l’épuisement du cholestérol31. L’épuisement du cholestérol des tissus et des cellules est simple et peut être réalisé en exposant les cellules de 30 à 60 min à 5 mM M-CD dissous dans le milieu utilisé pour stocker les cellules. Cette approche peut entraîner une diminution de 50% de la teneur en cholestérol (par exemple, dans les neurones hippocampal32, les artères cérébrales rat33). D’autre part, la préparation du complexe de l’enrichissement du cholestérol et du cholestérol est plus complexe et sera décrite dans la section du protocole.
Une approche alternative à l’enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de la cyclodextrine saturée de cholestérol implique l’utilisation de LDL, qui repose sur les récepteurs LDL exprimés dans les tissus / cellules18. Bien que cette approche offre l’avantage d’utiliser la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule, elle a plusieurs limites. Tout d’abord, les tissus et les cellules qui n’expriment pas le récepteur LDL ne peuvent pas être enrichis en utilisant cette approche. Deuxièmement, les particules LDL contiennent d’autres lipides en plus du cholestérol. Plus précisément, LDL est composé de la protéine ApoB100 (25%) et les lipides suivants (75 %) : 6 à 8 % de cholestérol, 45 à 50 % d’ester de cholestéle, 18 à 24 % de phospholipides et 4 à 8 % de triacylglycerols34. Ainsi, l’administration du cholestérol via les particules LDL n’est pas spécifique. Troisièmement, le pourcentage d’augmentation de la teneur en cholestérol par LDL dans les tissus et les cellules qui expriment le récepteur LDL peut être significativement inférieur à l’augmentation observée à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol. Par exemple, dans une étude précédente, l’enrichissement des artères cérébrales rongeurs avec le cholestérol par l’intermédiaire de LDL a eu comme conséquence seulement une augmentation de 10-15% des niveaux de cholestérol35. En revanche, l’enrichissement de ces artères avec la cyclodextrine saturée de cholestérol tel que décrit dans la section du protocole a entraîné une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (Voir la section des résultats représentatifs, figure 1).
Modification des taux de cholestérol chez les oocytes Xenopus Les ocytes Xénoopeus constituent un système d’expression hétérologue couramment utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Des études antérieures ont montré que le taux de cholestérol à la molaire phospholipide chez les oocytes Xenopus est de 0,5 à 0,136. En raison de ce niveau intrinsèque élevé de cholestérol, l’augmentation de la teneur en cholestérol dans ce système est difficile, mais peut être atteint en utilisant des dispersions faites à partir de phospholipides membranaires et le cholestérol. Les phospholipides que nous avons choisis à cette fin sont similaires à ceux utilisés pour former des bilayers de lipides planaires artificiels et comprennent L-phosphatidylethanolamine (POPE) et 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), tel que décrit dans la section du protocole. Cette approche peut entraîner une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (voir la section des résultats représentatifs, figure 2).
Une approche alternative à l’enrichissement des oocytes Xenopus avec des dispersions à base de phospholipid implique l’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol, qui est similaire à la façon dont les tissus et les cellules sont enrichis. Cependant, nous avons constaté que cette approche était de faible reproductibilité et d’efficacité, avec une augmentation moyenne de 25 % de la teneur en cholestérol. Cela est peut-être dû à la capacité de chargement différente de ces deux approches (voir la section des résultats représentatifs, figure 3). En revanche, il a été démontré que l’utilisation de cyclodextrine pour épuiser le cholestérol des oocytes Xenopus peut entraîner une diminution de 40% de la teneur en cholestérol36.
Ici, nous nous concentrons sur l’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules de mammifères par l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol, et des oocytes Xenopus utilisant des liposomes. Les deux approches peuvent être exploitées pour délimiter l’effet de l’augmentation des niveaux de cholestérol sur la fonction protéique. Les mécanismes de modulation de cholestérol de la fonction protéique peuvent impliquer des interactions directes8 et/ou des effets indirects9. Lorsque le cholestérol affecte la fonction protéique par le biais d’interactions directes, l’effet d’une augmentation du taux de cholestérol sur l’activité protéique est probablement indépendant du type cellulaire, du système d’expression ou de l’approche d’enrichissement. Par exemple, nous avons utilisé ces deux approches pour déterminer l’effet du cholestérol sur les canaux de potassium rectifiant intérieurement (GIRK) de G-protéine (GIRK) exprimés dans les myocytes auriculaires37, neurones hippocampiques32,38, HEK29339 cellules, et Oocytes Xenopus 32,37. Les résultats obtenus dans ces études étaient cohérents : dans les trois types de cellules de mammifères et dans les oocytes amphibiens, le cholestérol a augmenté la fonction du canal GIRK (voir la section des résultats représentatifs, figure 4, pour les neurones hippocampiques et les expériences correspondantes dans les oocytes Xenopus). En outre, les observations faites dans ces études étaient également compatibles avec les résultats des études menées dans les myocytes auriculaires37,40 et neurones hippocampiques32,38 fraîchement isolés des animaux soumis à un régime à taux de cholestérol élevé40. Notamment, l’enrichissement du cholestérol des neurones hippocampal à l’aide de M -CD a inversé l’effet de la thérapie d’atorvastatine utilisée pour répondre à l’impact de l’alimentation à taux élevé de cholestérol à la fois sur les niveaux de cholestérol et la fonction GIRK38. Dans d’autres études, nous avons étudié l’effet des mutations sur la sensibilité au cholestérol du canal de potassium rectifiant intérieurement Kir2.1 utilisant les ocytes Xenopus et les cellules HEK29341. Encore une fois, l’effet des mutations sur la sensibilité du canal était similaire dans les deux systèmes.
Les applications des deux méthodes d’enrichissement pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol sur la fonction moléculaire, cellulaire et d’organe sont nombreuses. En particulier, l’utilisation de complexes cyclodextrine-cholestérol pour enrichir les cellules et les tissus est très fréquente en grande partie en raison de sa spécificité. Des exemples récents de cette approche incluent la détermination de l’impact du cholestérol sur l’activation du canal HERG et les mécanismes sous-jacents42, la découverte que le cholestérol active le récepteur couplé à la protéine G Smoothened pour promouvoir la signalisation hérisson43, et l’identification du rôle du cholestérol dans la biomécanique des cellules souches et l’adipogenèse par les protéines linker associées à la membrane44. Dans nos propres travaux, nous avons utilisé l’enrichissement des tissus mammifères avec le complexe de cholestérol M-CD: pour étudier l’effet de l’enrichissement du cholestérol sur la fonction de base et le profil pharmacologique des canaux de grande conductance de calcium et de tension (BK, MaxiK) dans le muscle lisse vasculaire35,45,46. Dans d’autres études, nous avons utilisé l’approche de dispersion à base de phospholipid pour enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol pour déterminer les rôles des différentes régions dans les canaux Kir2.1 et GIRK dans la sensibilité au cholestérol41,47,48,49, ainsi que pour déterminer les sites de liaison de cholestérol putatif dans ces canaux32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

L’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules des mammifères, y compris les oocytes Xenopus utilisés pour étudier la fonction cellulaire, peut être accompli en utilisant une variété de méthodes. Ici, nous décrivons deux approches importantes utilisées à cette fin. Tout d’abord, nous décrivons comment enrichir les tissus et les cellules avec du cholestérol à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol à l’aide d’artères cérébrales (tissus) et de neurones hippocampiques (cellules) à titre d’exemples. Cette approche peut être utilisée pour n’importe quel type de tissu, cellules ou lignées cellulaires. Une approche alternative pour l’enrichissement du cholestérol implique l’utilisation de lipoprotéines de faible densité (LDL). L’avantage de cette approche est qu’elle utilise une partie de la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule. Cependant, alors que l’approche de la cyclodextrine peut être appliquée pour enrichir n’importe quel type d’intérêt cellulaire avec le cholestérol, l’approche LDL est limitée aux cellules qui expriment les récepteurs LDL (par exemple, les cellules hépatiques, les cellules dérivées de la moelle osseuse telles que les leucocytes sanguins et les macrophages tissulaires), et le niveau d’enrichissement dépend de la concentration et de la mobilité du récepteur LDL. En outre, les particules de LDL incluent d’autres lipides, ainsi l’accouchement de cholestérol est non spécifique. Deuxièmement, nous décrivons comment enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol à l’aide d’une dispersion à base de phospholipid (c.-à-d. liposomes) qui comprend le cholestérol. Les ocytes Xenopus constituent un système d’expression hétérologue populaire utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de cyclodextrine du tissu mammifère (artères cérébrales) et pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de phospholipid des oocytes Xenopus, nous démontrons que les niveaux de cholestérol atteignent un maximum après 5 min d’incubation. Ce taux de cholestérol demeure constant pendant les périodes prolongées d’incubation (p. ex., 60 min). Ensemble, ces données fournissent la base pour des conditions temporelles optimisées pour l’enrichissement de cholestérol des tissus, des cellules, et des oocytes de Xénoopus pour des études fonctionnelles visant à interroger l’impact de l’enrichissement de cholestérol.

L’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol comme moyen d’enrichir les tissus et les cellules avec le cholestérol est bien établie. Ici, nous démontrons d’abord l’application de cette approche largement utilisée pour enrichir les artères cérébrales de rat avec le cholestérol utilisant M-CD saturé de cholestérol. La figure 1A montre un exemple d’une couche musculaire lisse de l’artère cérébrale image et dé...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Deux méthodes d’enrichissement du cholestérol sont présentées : l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol pour enrichir les tissus et les cellules des mammifères, et l’utilisation de dispersions à base de phospholipides enrichies de cholestérol (liposomes) pour enrichir les oocytes Xenopus. Ces méthodes sont instrumentales pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans la fonction moléculaire, cellulaire, et d’organe.

Enrichissement des tissus mammifères et des oocytes Xenopus avec du cholestérol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

L’hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Nos protocoles fournissent des outils précieux pour étudier les conséquences physiologiques et mécanistes de l’hypercholestérolémie. Ces procédures peuvent être effectuées à l’aide de l’équipement de laboratoire de base, et sont applicables aux cellules, tissus et ovocytes Xenopus.Le cholestérol est un composant majeur des membranes cellulaires dans tout le corps. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans n’importe quel type de cellule. Disséquer les artères est l’étape la plus difficile.Retirez soigneusement l’artère du cerveau, sans étirer ni endommager le tissu vasculaire. Les lipides sont très délicats, et travailler avec eux est plus un art qu’une science. Démonstration vidéo fournit un guide pour apprendre à gérer les lipides avec soin.Pour préparer la solution de méthyl-bêta-cyclodextrine saturée de cholestérol, ajoutez d’abord 064 grammes de méthyl-bêta-cyclodextrine à 10 millilitres de PBS, en remuant la solution avec une barre de remue-remuer, pour s’assurer que la méthyl-bêta-cyclodextrine se dissout complètement. Ensuite, ajouter 0024 grammes de poudre de cholestérol à la fiole, et remuer la solution vigoureusement, à l’aide d’une spatule pour briser autant de morceaux de cholestérol que possible. Lorsque presque tout le cholestérol a été dissous, sceller le flacon avec au moins deux couches de film de paraffine.Et secouez le flacon à environ 30 oscillations par minute dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après huit à 16 heures, refroidir la solution à température ambiante, avant de filtrer le mélange à travers un filtre à seringue polyethersulfone de 22 micromètres dans une bouteille de classe. Pour l’enrichissement de l’artère cérébrale des mammifères, récolter le cerveau d’un rat Sprague Dawley de 250 à 300 grammes dans un bécher de PBS sur la glace, avant de transférer le cerveau dans un bol de dissection ciré, sous un microscope dissection, contenant juste assez de PBS pour submerger le tissu.Fixez le cerveau avec deux à trois broches, en vous assurant qu’ils ne pénètrent pas dans les vaisseaux sanguins. Et utilisez des forceps pointus et de petits ciseaux chirurgicaux pour disséquer doucement les artères cérébrales et leurs branches qui forment le Cercle de Willis à la base du cerveau. Ensuite, rincez brièvement jusqu’à un centimètre de long segments d’artère dans PBS, avant d’incuber les segments rincés dans suffisamment de cholestérol solution enrichissante pour couvrir les tissus.Pour déterminer toute altération du taux de cholestérol, utilisez une bouteille fraîche de poudre de filipin pour préparer une solution de bouillon de 10 milligrammes par millilitre du colorant dans du sulfoxyde de diméthyle, et lavez les tissus enrichis en cholestérol avec trois lavages de cinq minutes dans du PBS frais. Après le dernier lavage, fixer les segments d’artère en 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes sur la glace, à l’abri de la lumière, avant de perméabiliser les échantillons dans 5%Triton en PBS pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les tissus avec trois lavages de cinq minutes en PBS sur un shaker, avant d’ajouter les échantillons à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre de solution de colorant filipin, pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, laver les œuvres de l’artère trois fois comme démontré, suivie d’un bref rinçage à l’eau distillée. Après le dernier lavage, utilisez un tissu de laboratoire pour absorber tout excès de liquide et montez les artères sur une lame à l’aide d’un support de montage approprié. Couvrez soigneusement les artères d’un glissement de couvercle, en prenant soin d’éviter de rouler ou de tordre le tissu, et laissez sécher la glissade pendant 24 heures à température ambiante, à l’abri de la lumière.Lorsque le milieu de montage est sec, sceller les bords de glissement de couverture avec du vernis à ongles clair, et laisser sécher le vernis pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, imagez le tissu avec une excitation de 340 à 380 nanomètres, et une émission de 385 à 470 nanomètres. Pour préparer la dispersion à base de phospholipide, combinez 200 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de solution lipidique dissoute chloroforme, L-alpha-phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, et cholestérol dans un tube de verre de 12 millilitres.Évaporer le chloroforme dans le capot sous un flux d’azote, avant de suspendre les lipides dans 800 microlitres de chlorure de potassium tamponné de 150 millimlaires et de 10 millimlaires tris HEPES solution. Ensuite, sceller le tube avec du film de paraffine, et sonifier doucement le contenu du tube à 80 kilohertz pendant 10 minutes, jusqu’à ce qu’un mélange laitier soit formé. Pour l’enrichissement en cholestérol des ovocytes Xenopus, utilisez des forceps tranchants pour perturber le sac ovarien d’une grenouille femelle Xenopus laevis dans plusieurs régions, et placez les morceaux d’ovaire dans une plaque de 60 millimètres avec cinq millilitres de ND96 sans calcium complétés par 5 milligrammes par millilitre de collagène.Secouez le tissu sur un shaker orbital à 60 oscillations par minute pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, utiliser une pipette de transfert avec une pointe large pour pipette vigoureusement l’ovocyte contenant la solution cinq à dix fois pour isoler les ovocytes individuels, et rincer rapidement la solution d’ovocyte foncé avec nd96 frais sans calcium jusqu’à ce que la solution devienne transparente. Ensuite, transférez 90 microlitres de la dispersion à base de phospholipide enrichie en cholestérol dans un puits d’une plaque de puits de 96, et ajoutez jusqu’à six ovocytes au puits avec le moins de milieu possible.Placez la plaque de puits 96 sur un rotateur de plate-forme tridimensionnel pendant cinq à dix minutes. Ajoutez ensuite une goutte de ND96 au puits et transférez les ovocytes enrichis en cholestérol dans une plaque de 35 millimètres contenant du ND96 pour leur analyse immédiate. Ici, un exemple d’une couche lisse d’artère cérébrale imaged démontre l’augmentation dépendante de concentration de fluorescence associée de filipin obtenue sur l’enrichissement de tissu avec des concentrations croissantes de cholestérol.Notamment trois heures après le traitement par le complexe de cholestérol méthylique-bêta-cyclodextrine, les taux de cholestérol ont diminué d’environ 50% par rapport à leur niveau immédiatement après l’enrichissement. Tandis qu’un temps d’incubation d’une heure est couramment employé pour enrichir les tissus et les cellules avec le cholestérol pendant cette approche, cinq minutes d’incubation sont habituellement suffisantes pour réaliser une augmentation statistiquement significative de la teneur en cholestérol artérielle cérébral telle que déterminée par l’essai biochimique basé sur l’oxidase de cholestérol. Bien qu’aucun changement significatif ne soit observé dans les niveaux de cholestérol dans les ovocytes Xenopus enrichis de dispersions à base de phospholipide de contrôle manquant de cholestérol, les niveaux de cholestérol augmentent de manière significative après seulement cinq minutes de traitement avec les dispersions à base de phospholipide qui incluent le cholestérol, et restent à ce niveau lorsque le temps d’incubation est augmenté à 60 minutes.L’efficacité de l’approche basée sur la cyclodextrine pour enrichir les cellules est également démontrée chez les neurones fraîchement isolés de la région CA1 de l’hippocampe. En effet, l’incubation des neurones dans le méthyl-bêta-cyclodextrine saturé de cholestérol pendant 60 minutes entraîne une augmentation de plus de deux fois du taux de cholestérol, tel qu’évalué par la fluorescence associée aux filipins. Dans l’ensemble, les deux étapes les plus importantes pour ces procédures sont la préparation du mélange d’enrichissement du cholestérol et d’assurer l’intégrité du tissu artérielle.Après l’enrichissement du cholestérol, on peut étudier la fonction des protéines qui sont affectées par l’hypercholestérolémie. La capacité d’enrichir les cellules avec le cholestérol a facilité l’étude des niveaux élevés de cholestérol dans les cardiomyocytes et les neurones. L’utilisation d’ovocytes nous a permis d’étudier comment le cholestérol se lie aux canaux irionaux.Un manteau de laboratoire et des gants qu’elle porte toujours pour ce protocole. Le chloroforme et le paraformaldéhyde doivent être utilisés sous un capot de fumée et être jetés comme déchets dangereux.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Recherche

Biochimie

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Fluorométrie de tension-serre dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytes utilisant des acides aminés fluorescents non naturels

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Imagerie des tissus amyloïdes colorées avec Luminescent thiol conjugués par Hyperspectral confocale microscopie et imagerie de Fluorescence Lifetime

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting analyse de Translation Initiation complexe formé sur l’ARNm chez les mammifères

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Étudier les Interactiens ARN de la protéine Kinase RNA-activé durant le Cycle cellulaire chez les mammifères

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

Enrichissement de particules de lipoprotéines indigènes avec microRNA et détermination subséquente de leur teneur absolue/relative de microRNA et de leur taux de transfert cellulaire

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Quantification de la coenzyme A dans les cellules et les tissus

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...