Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen Scientist Development Grant (11SDG5190025) der American Heart Association (zu A.R.-D.) und durch das National Institute of Health R01 Zuschüsse AA-023764 (bis A.N.B.) und HL-104631 und R37 AA-11560 (bis A.M.D.) unterstützt.

Alle experimentellen Eingriffe mit Tieren wurden am University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) durchgeführt. Die Pflege von Tieren und Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des UTHSC überprüft und genehmigt, einer Einrichtung, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiert ist.
1. Anreicherung von Geweben und Zellen mit methyl--cyclodextrin gesättigt mit Cholesterin
HIN...

Methoden zur Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin bilden ein wirksames Werkzeug zur Untersuchung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinwerte auf einzelne molekulare Arten, auf komplexe makromolekulare Systeme (z. B. Proteine) und auf die Zell- und Organfunktion. In diesem Beitrag haben wir zwei komplementäre Ansätze beschrieben, die solche Studien erleichtern. Zuerst beschrieben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem wir mit Cholester...

Cholesterin, ein wichtiges zelluläres Lipid, spielt zahlreiche kritische funktionelle und strukturelle Rollen1,2,3,4,5,6,7,8,9. Von der Regulierung der physikalischen Eigenschaften der Plasmamembran bis hin zur Sicherstellung der Zelllebensfähigkeit, des Wachstums, der Proliferation und der Funktion als Signal- und Vorläufermolekül in einer Vielzahl biochemischer Bahnen ist Cholesterin ein zwingender Bestandteil, der für die normale Zell- und Organfunktion notwendig ist. Als Ergebnis, Cholesterinmangel führt zu schweren körperlichen Fehlbildungen und eine Vielzahl von Störungen. Auf der anderen Seite, auch eine kleine Erhöhung des Cholesterins über physiologischen Niveaus (2-3x) ist zytotoxisch1,2,10 und wurde mit der Entwicklung von Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf11,12,13 und neurodegenerative Erkrankungen14,15,16,17verbunden. Um die kritischen Funktionen des Cholesterins zu hinterfragen und die Wirkung von Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bestimmen, wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die den Cholesteringehalt in Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten verändern.
Veränderung des Cholesterinspiegels in Säugetiergeweben und -zellen Mehrere Ansätze können genutzt werden, um den Cholesterinspiegel in Geweben und Zellen18zu senken. Ein Ansatz beinhaltet ihre Exposition gegenüber Statinen, die in Lipoprotein-defizigem Serum gelöst werden, um HMG-CoA-Reduktase zu hemmen, die die Rate der Cholesterinsynthesesteuert 19,20. Jedoch, Diese Cholesterin senkenden Medikamente hemmen auch die Bildung von Nicht-Sterol-Produkte entlang der Mevalonat-Weg. Daher wird eine kleine Menge Mevalonat hinzugefügt, um die Bildung dieser Produkte zu ermöglichen21 und die Spezifität dieses Ansatzes zu verbessern. Ein weiterer Ansatz zur Senkung des Cholesterinspiegels beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrinen. Diese Glucopyranose-Monomere besitzen eine interne hydrophobe Höhle mit einem Durchmesser, der der Größe der Sterole22entspricht, was die Extraktion von Cholesterin aus Zellen erleichtert und sie dadurch von ihrem nativen Cholesteringehalt23erschöpft. Ein Beispiel ist 2-Hydroxypropyl-Cyclodextrin (HP-CD), ein präklinisches Medikament, das derzeit zur Behandlung der Niemann-Pick-Typ-C-Krankheit getestet wird, einer genetisch vererbten tödlichen Stoffwechselstörung, die durch lysosomale Cholesterinspeicherung gekennzeichnet ist24. Der Grad des Cholesterinmangels hängt von dem verwendeten spezifischen Derivat ab. Zum Beispiel extrahiert HP-CD Cholesterin mit einer geringeren Kapazität als das methylierte Derivat, Methyl-A-Cyclodextrin (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Vor allem aber können neben Cholesterin auch andere hydrophobe Moleküle extrahiert werden, die dann zu unspezifischen Wirkungen führen können31. Im Gegensatz zur Erschöpfung können Zellen und Gewebe durch die Behandlung mit dem mit Cholesterin23vorgesättigten A-Cyclodextrin gezielt mit Cholesterin angereichert werden. Dieser Ansatz kann auch als Kontrolle für die Spezifität von ,,Cyclodextrinen" verwendet werden, die für den Cholesterinmangel verwendet werden31. Der Abbau von Cholesterin aus Geweben und Zellen ist einfach und kann erreicht werden, indem die Zellen für 30-60 min bis 5 mM M'CD in dem Medium, das für die Lagerung der Zellen verwendet wird, gelöst werden. Dieser Ansatz kann zu einer 50%igen Abnahme des Cholesteringehalts führen (z.B. in Hippocampus-Neuronen32, Rattenhirnarterien33). Auf der anderen Seite ist die Vorbereitung des "Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexes" für die Cholesterinanreicherung von Gewebe und Zellen komplexer und wird im Protokollabschnitt beschrieben.
Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit mit Cholesterin gesättigtem X-Cyclodextrin beinhaltet die Verwendung von LDL, das auf LDL-Rezeptoren beruht, die in den Geweben/Zellen18exprimiert werden. Während dieser Ansatz bietet den Vorteil der Verwendung der natürlichen Cholesterin Homöostase Maschinerie der Zelle, Es hat mehrere Einschränkungen. Erstens können Gewebe und Zellen, die den LDL-Rezeptor nicht ausdrücken, mit diesem Ansatz nicht angereichert werden. Zweitens enthalten LDL-Partikel neben Cholesterin auch andere Lipide. Insbesondere besteht LDL aus dem Protein ApoB100 (25%) und die folgenden Lipide (75%): 6-8% Cholesterin, 45-50% Cholesterylester, 18-24% Phospholipide und 4-8% Triacylglycerole34. Daher ist die Abgabe von Cholesterin über LDL-Partikel unspezifisch. Drittens kann der prozentuale Anstieg des Cholesteringehalts durch LDL in Geweben und Zellen, die den LDL-Rezeptor ausdrücken, signifikant niedriger sein als der Mit dem Cholesteringehalt beobachtete Anstieg. Zum Beispiel, in einer früheren Studie, Anreicherung von Nagetier Hirnarterien mit Cholesterin über LDL führte nur zu einem 10-15% Anstieg des Cholesterinspiegels35. Im Gegensatz dazu führte die Anreicherung dieser Arterien mit Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, wie im Protokollabschnitt beschrieben, zu einer >50%igen Erhöhung des Cholesteringehalts (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 1).
Veränderung des Cholesterinspiegels in Xenopus Oozyten Xenopus Oozyten bilden ein heterologes Expressionssystem, das häufig zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Cholesterin-Zu-Phospholipid-Molaren-Verhältnis in Xenopus-Oozyten 0,5 x 0,136beträgt. Aufgrund dieses intrinsischen hohen Cholesterinspiegels ist die Erhöhung des Cholesterinspiegels in diesem System eine Herausforderung, kann aber mit Dispersionen aus Membranphospholipiden und Cholesterin erreicht werden. Die Phospholipide, die wir für diesen Zweck gewählt haben, ähneln denen, die zur Bildung künstlicher planarer Lipid-Doppelschichten verwendet werden, und umfassen L-A-Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), wie im Protokollabschnitt beschrieben. Dieser Ansatz kann zu >50% Anstieg des Cholesteringehalts führen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2).
Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit phospholipidbasierten Dispersionen beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, was der Art und Weise ähnelt, wie Gewebe und Zellen angereichert werden. Wir haben jedoch festgestellt, dass dieser Ansatz von geringer Reproduzierbarkeit und Effizienz ist, mit einem durchschnittlichen Anstieg des Cholesteringehalts um 25 %. Dies ist möglicherweise auf die unterschiedliche Belastbarkeit dieser beiden Ansätze zurückzuführen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 3). Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Cyclodextrin, um Cholesterin aus Xenopus Oozyten zu erschöpfen, zu einer Abnahme des Cholesteringehalts um 40 % führen kann36.
Hier konzentrieren wir uns auf die Cholesterinanreicherung von Säugetiergeweben und -zellen durch die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, und von Xenopus Oozyten mit Liposomen. Beide Ansätze können genutzt werden, um die Wirkung eines erhöhten Cholesterinspiegels auf die Proteinfunktion abzuleiten. Die Mechanismen der Cholesterinmodulation der Proteinfunktion können direkte Wechselwirkungen8 und/oder indirekte Effektebeinhalten 9. Wenn Cholesterin die Proteinfunktion über direkte Wechselwirkungen beeinflusst, ist die Wirkung eines Anstiegs des Cholesterinspiegels auf die Proteinaktivität wahrscheinlich unabhängig vom Zelltyp, Expressionssystem oder Anreicherungsansatz. Zum Beispiel nutzten wir diese beiden Ansätze, um die Wirkung von Cholesterin auf G-Protein-Gated-Innen-Rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRK) zu bestimmen, ausgedrückt in Vorhoffnden Myozyten37, Hippocampus-Neuronen32,38, HEK29339 Zellen und Xenopus-Oozyten 32,37. Die in diesen Studien erzielten Ergebnisse waren konsistent: in allen drei Arten von Säugetierzellen und in Amphibien-Oozyten wurde die GIRK-Kanalfunktion von Cholesterin hochreguliert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4, für Hippocampus-Neuronen und die entsprechenden Experimente in Xenopus-Oozyten). Darüber hinaus stimmten die in diesen Studien gemachten Beobachtungen auch mit den Ergebnissen von Studien überein, die an den Vorhofmyozyten37,40 und hippocampalneuronen32,38 frisch isoliert von Tieren, die einer hohen Cholesterindiät ausgesetztwaren, 40durchgeführt wurden. Bemerkenswert ist, dass die Cholesterinanreicherung von Hippocampus-Neuronen mit M-CD die Wirkung der Atorvastatin-Therapie, die zur Bekämpfung der Auswirkungen der hohen Cholesterin-Diät sowohl auf den Cholesterinspiegel als auch auf die GIRK-Funktionverwendetwird, umkehrte. In anderen Studien untersuchten wir die Wirkung von Mutationen auf die Cholesterinempfindlichkeit des nach innen korrigierenden Kaliumkanals Kir2.1 mit Xenopus-Oozyten und HEK293-Zellen41. Auch hier war die Wirkung der Mutationen auf die Empfindlichkeit des Kanals in den beiden Systemen ähnlich.
Die Anwendungen beider Anreicherungsmethoden zur Bestimmung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinspiegel auf die Molekular-, Zell- und Organfunktion sind zahlreich. Insbesondere die Verwendung von Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexen zur Anreicherung von Zellen und Geweben ist aufgrund seiner Spezifität sehr häufig. Jüngste Beispiele für diesen Ansatz sind die Bestimmung der Auswirkungen von Cholesterin auf herG-Kanalaktivierung und zugrunde liegende Mechanismen42, die Entdeckung, dass Cholesterin aktiviert die G-Protein gekoppelt Rezeptor Geglättet, um Hedgehog Signalisierung43zu fördern , und die Identifizierung der Rolle von Cholesterin in Stammzell Biomechanik und Adipogenese durch Membran-assoziierte Linker Proteine44. In unserer eigenen Arbeit nutzten wir die Anreicherung von Säugetiergewebe mit dem M-CD:Cholesterin-Komplex, um die Wirkung der Cholesterinanreicherung auf die Grundfunktion und das pharmakologische Profil von Kalzium- und Spannungskanälen großer Leitfähigkeit (BK, MaxiK) im vaskulären Glattmuskel35,45,46zuuntersuchen. In anderen Studien verwendeten wir den Phospholipid-basierten Dispersionsansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin, um die Rollen verschiedener Regionen in Kir2.1- und GIRK-Kanälen in der Cholesterinempfindlichkeit41,47,48,49, sowie zur Bestimmung vermeintlicher Cholesterinbindungsstellen in diesen Kanälen32,50,51zubestimmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

Cholesterin-Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen, einschließlich Xenopus-Oozyten, die zur Untersuchung der Zellfunktion verwendet werden, kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden. Hier beschreiben wir zwei wichtige Ansätze, die zu diesem Zweck verwendet werden. Zunächst beschreiben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem man Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, mit Zerebralen arterienden (Gewebe) und Hippocampus-Neuronen (Zellen) als Beispiele anreichert. Dieser Ansatz kann für jede Art von Gewebe, Zellen oder Zelllinien verwendet werden. Ein alternativer Ansatz für die Cholesterinanreicherung beinhaltet die Verwendung von Low-Density-Lipoprotein (LDL). Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es einen Teil der natürlichen CholesterinHomöostase-Maschinerie der Zelle verwendet. Während jedoch der Cyclodextrin-Ansatz angewendet werden kann, um jede Zellart des Interesses mit Cholesterin zu bereichern, ist der LDL-Ansatz auf Zellen beschränkt, die LDL-Rezeptoren exprimieren (z. B. Leberzellen, Knochenmark-abgeleitete Zellen wie Blutleukozyten und Gewebemakrophagen), und der Grad der Anreicherung hängt von der Konzentration und der Mobilität des LDL-Rezeptors ab. Darüber hinaus enthalten LDL-Partikel andere Lipide, so dass die Cholesterinabgabe unspezifisch ist. Zweitens beschreiben wir, wie Xenopus-Oozyten mit Cholesterin angereichert werden können, indem man eine phospholipidbasierte Dispersion (d. h. Liposomen) verwendet, die Cholesterin enthält. Xenopus Oozyten bilden ein beliebtes heterologes Expressionssystem, das zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Sowohl für den Cyclodextrin-basierten Cholesterinanreicherungsansatz von Säugetiergewebe (Zerebralenarterien) als auch für den phospholipidbasierten Cholesterinanreicherungsansatz von Xenopus Oozyten zeigen wir, dass der Cholesterinspiegel nach 5 min Inkubation ein Maximum erreicht. Dieser Cholesterinspiegel bleibt während längerer Inkubationszeiten (z.B. 60 min) konstant. Zusammen bilden diese Daten die Grundlage für optimierte zeitliche Bedingungen für die Cholesterinanreicherung von Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten für funktionelle Studien, die darauf abzielen, die Auswirkungen der Cholesterinanreicherung zu hinterfragen.

Die Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem Cyclodextrin als Mittel zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit Cholesterin ist etabliert. Hier zeigen wir zunächst die Anwendung dieses weit verbreiteten Ansatzes zur Anreicherung von Rattenhirnarterien mit Cholesterin unter Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem M-CD. Abbildung 1zeigt ein Beispiel für eine abgebildete zerebrale Arterie glatte Muskelschicht und zeigt die konzentratio...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Zwei Methoden der Cholesterinanreicherung werden vorgestellt: die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, um Säugetiergewebe und -zellen anzureichern, und die Verwendung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen) zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten. Diese Methoden sind entscheidend für die Bestimmung der Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in molekularen, zellulären, und Organfunktion.

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Erhöhte Cholesterinwerte sind ein wichtiger Risikofaktor für herz-kreislauf- und neurodegenerative Erkrankungen. Unsere Protokolle bieten wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung sowohl physiologischer als auch mechanistischer Folgen von Hypercholesterinämie. Diese Verfahren können mit grundlegenden Laborgeräten durchgeführt werden und gelten für Zellen, Gewebe und Xenopus-Oozyten.Cholesterin ist ein wichtiger Bestandteil der Zellmembranen im ganzen Körper. Diese Techniken können verwendet werden, um die Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in jedem Zelltyp zu studieren. Die Arterien zu sezieren ist der schwierigste Schritt.Entfernen Sie vorsichtig die Arterie aus dem Gehirn, ohne das Gefäßgewebe zu dehnen oder zu beschädigen. Lipide sind sehr empfindlich, und die Arbeit mit ihnen ist mehr eine Kunst als eine Wissenschaft. Video-Demonstration bietet eine Anleitung für das Lernen, wie man mit Lipiden vorsichtig umgeht.Um die cholesteringesättigte Methyl-Beta-Cyclodextrin-Lösung vorzubereiten, fügen Sie zunächst 064 Gramm Methyl-Beta-Cyclodextrin zu 10 Milliliter PBS hinzu, wobei die Lösung mit einem Rührstab gerührt wird, um sicherzustellen, dass sich das Methyl-Beta-Cyclodextrin vollständig auflöst. Als nächstes fügen Sie 0024 Gramm Cholesterinpulver in den Kolben, und rühren Sie die Lösung kräftig, mit einem Spachtel, um so viele Cholesterin-Stücke wie möglich zu brechen. Wenn fast das gesamte Cholesterin gelöst ist, versiegeln Sie den Kolben mit mindestens zwei Schichten Paraffinfolie.Und schütteln Sie den Kolben bei etwa 30 Schwingungen pro Minute in einem 37 Grad Celsius Wasserbad über Nacht. Nach acht bis 16 Stunden die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Mischung durch einen 22-Mikrometer-Polyethersulfon-Spritzenfilter in eine Klasseflasche filtern. Für die Anreicherung der Hirnarterie naschen Ernten Sie das Gehirn von einer 250 bis 300 Gramm schweren Sprague Dawley Ratte in ein Becherglas von PBS auf Eis, bevor Sie das Gehirn in eine gewachste Sezierschüssel unter einem Seziermikroskop überführen, das gerade genug PBS enthält, um das Gewebe zu versenken.Sichern Sie das Gehirn mit zwei bis drei Pins, stellen Sie sicher, dass sie nicht in die Blutgefäße eindringen. Und verwenden Sie scharfe Zangen und kleine chirurgische Schere, um die Hirnarterien und ihre Zweige, die den Kreis von Willis an der Basis des Gehirns bilden, sanft zu sezieren. Als nächstes spülen Sie kurz bis zu einem Zentimeter lange Arteriensegmente in PBS ab, bevor Sie die abspülten Segmente in genügend Cholesterinanreicherungslösung eintauchen, um das Gewebe abzudecken.Um Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bestimmen, verwenden Sie eine frische Flasche filipin Pulver, um eine 10 Milligramm pro Milliliter Stocklösung des Farbstoffs in Dimethylsulfoxid vorzubereiten, und waschen Sie das cholesterinangereicherte Gewebe mit drei fünfminütigen Wäschen in frischem PBS. Nach der letzten Wäsche die Arteriensegmente in 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt, vor der Durchlässigung der Proben in 5%Triton in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Gewebe mit drei fünfminütigen Wälzungen in PBS auf einem Shaker waschen, bevor Sie die Proben zu einer 25-Mikrogramm pro Milliliter Endkonzentration der filipin farbstoffen Lösung hinzufügen, für eine Stunde bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.Am Ende der Inkubation die Arterienstücke dreimal waschen, wie gezeigt, gefolgt von einer kurzen Spülung mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie nach der letzten Wäsche ein Laborgewebe, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen, und montieren Sie die Arterien mit einem geeigneten Montagemedium auf einen Schlitten. Bedecken Sie die Arterien vorsichtig mit einem Deckelschlupf, achten Sie darauf, das Rollen oder Verdrehen des Gewebes zu vermeiden, und lassen Sie das Dia 24 Stunden bei Raumtemperatur trocknen, geschützt vor Licht.Wenn das Montagemedium trocken ist, versiegeln Sie die Deckelschlupfkanten mit klarem Nagellack und lassen Sie den Politur 10 bis 15 Minuten trocknen. Dann bilde das Gewebe mit einer Anregung von 340 bis 380 Nanometern und einer Emission von 385 bis 470 Nanometern. Zur Herstellung der phospholipidbasierten Dispersion 200 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Chloroform gelöste Lipidlösung, L-alpha-Phosphatidylethanolamin, 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und Cholesterin in einem 12 Milliliter Glasrohr kombinieren.Verdampfen Sie die Chloroform in der Haube unter einem Stickstoffstrom, bevor Sie die Lipide in 800 Mikroliter gepuffertem 150 Millimolar Kaliumchlorid und 10 Millimolar Tris HEPES-Lösung aufhängen. Dann versiegeln Sie das Rohr mit Paraffinfolie und beschallen Sie den Rohrinhalt bei 80 Kilohertz 10 Minuten lang, bis sich eine milchige Mischung bildet. Für die Cholesterinanreicherung von Xenopus Oozyten verwenden Sie scharfe Zangen, um den Eierstocksack eines weiblichen Xenopus laevis Froschs in mehreren Regionen zu stören, und legen Sie die Eierstockbrocken in eine 60-Millimeter-Platte mit fünf Millilitern kalziumfreier ND96, ergänzt mit 5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase.Schütteln Sie das Gewebe auf einem Orbital-Shaker bei 60 Schwingungen pro Minute für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation verwenden Sie eine Transferpipette mit einer breiten Spitze, um die Eizelle, die die Lösung enthält, fünf- bis zehnmal kräftig zu pipetten, um die einzelnen Eizellen zu isolieren, und spülen Sie die dunkle Eizellenlösung schnell mit frischem kalziumfreiem ND96 ab, bis die Lösung transparent wird. Als nächstes übertragen Sie 90 Mikroliter der cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersion in einen Brunnen einer 96-Well-Platte und addieren bis zu sechs Eizellen mit möglichst wenig Medium in den Brunnen.Legen Sie die 96-Wellplatte fünf bis zehn Minuten lang auf einen dreidimensionalen Plattformrotator. Dann fügen Sie einen Tropfen ND96 in den Brunnen, und übertragen Sie die Cholesterin angereicherten Eizellen auf eine 35-Millimeter-Platte mit ND96 für ihre sofortige Analyse. Hier zeigt ein Beispiel einer abgebildeten zerebralen Arterie glatte Muskelschicht die konzentrationsabhängige Zunahme der filipinassoziierten Fluoreszenz, die bei Gewebeanreicherung mit zunehmenden Cholesterinkonzentrationen erzielt wird.Vor allem drei Stunden nach der Behandlung mit dem Methyl-Beta-Cyclodextrin-Cholesterin-Komplex sank der Cholesterinspiegel im Vergleich zu ihrem Niveau unmittelbar nach der Anreicherung um ca. 50%. Während eine einstündige Inkubationszeit häufig verwendet wird, um die Gewebe und Zellen mit Cholesterin während dieses Ansatzes zu bereichern, sind fünf Minuten Inkubation in der Regel ausreichend, um eine statistisch signifikante Erhöhung des zerebralen arteriellen Cholesteringehalts zu erreichen, der durch biochemischen Cholesterintest auf Cholesterinoxidase-Basiert bestimmt wird. Während keine signifikante Veränderung des Cholesterinspiegels in Xenopus Oozyten beobachtet wird, die mit Kontroll-Phospholipid-basierten Dispersionen angereichert sind, die nicht auf Cholesterin fehlen, steigt der Cholesterinspiegel nach nur fünf Minuten Behandlung mit den Phospholipid-basierten Dispersionen, die Cholesterin enthalten, und bleiben auf diesem Niveau, wenn die Inkubationszeit auf 60 Minuten erhöht wird.Die Wirksamkeit des Cyclodextrin-basierten Ansatzes zur Anreicherung von Zellen wird auch in Neuronen demonstriert, die frisch aus der CA1-Region des Hippocampus isoliert sind. Tatsächlich führt die Inkubation der Neuronen in Methyl-Beta-Cyclodextrin, das 60 Minuten lang mit Cholesterin gesättigt ist, zu einem mehr als zweifachen Anstieg des Cholesterinspiegels, wie die mit Filipin assoziierte Fluoreszenz beurteilt. Insgesamt sind die beiden wichtigsten Schritte für diese Verfahren die Herstellung der Cholesterinanreicherungsmischung und die Gewährleistung der Integrität des arteriellen Gewebes.Nach der Cholesterinanreicherung kann man die Funktion der Proteine untersuchen, die von Hypercholesterinämie betroffen sind. Die Fähigkeit, Zellen mit Cholesterin anzureichern, erleichterte die Untersuchung erhöhter Cholesterinwerte in Kardiomyozyten und Neuronen. Die Verwendung von Eizellen ermöglichte es uns zu untersuchen, wie Cholesterin an Ionenkanäle bindet.Ein Labormantel und Handschuhe werden sie immer für dieses Protokoll getragen. Chloroform und Paraformaldehyd sollten unter einer Dunstabzugshaube verwendet und als sonderwerter Abfall entsorgt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...