Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק פיתוח מדען (11SDG5190025) מאיגוד הלב האמריקני (ל-ar-D.), ועל ידי המכון הלאומי של בריאות R01 מענקים AA-023764 (כדי A.N.B.), ו-HL-104631 ו R37 AA-11560 (ל-M. D).

כל ההליכים הניסיוניים עם בעלי חיים בוצעו באוניברסיטת טנסי במרכז למדעי הבריאות (UTHSC). הטיפול של בעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים והשתמש של UTHSC, אשר הוא מוסד מוכר על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בחיות מעבדה הבינלאומי.
1. העשרת רקמות ...

שיטות כדי להעשיר את רקמות היונקים ואת התאים ו Xenopus oocytes עם כולסטרול מהווים כלי רב עוצמה לחקירת ההשפעה של רמות כולסטרול גבוהות על מינים מולקולריים בודדים, על מערכות macromolecular מורכבות (למשל, חלבונים), ועל תפקוד הסלולר והעוגב. במאמר זה, תיארנו שתי גישות משלימות המקלות על מחקרים כאלה. ראשית, ת...

כולסטרול, השומנים הסלולר העיקריים, משחק תפקידים קריטיים מבניים רבים1,2,3,4,5,6,7,8,9. מתוך ויסות התכונות הפיזיות של קרום הפלזמה כדי להבטיח את הכדאיות התאית, צמיחה, התפשטות, והגשה כמולקולה איתות ו קודמן בשפע של מסלולים ביוכימיים, כולסטרול הוא רכיב חיוני הכרחי תאים תא נורמלי הפונקציה. כתוצאה מכך, חוסר כולסטרול תוצאות מומים פיזיים חמורים מגוון רחב של הפרעות. מצד שני, אפילו עלייה קטנה בכולסטרול מעל רמות פיזיולוגיות (2-3x) הוא ציטוטוקסי11,2,10 והוא נקשר עם פיתוח של הפרעות, כולל לב וכלי דם11,12,13 מחלות נוירוניווניות14,15,16,17. כך, כדי לחקור את הפונקציות הקריטיות של כולסטרול כדי לקבוע את ההשפעה של שינויים ברמות הכולסטרול, גישות שונות המשנות את התוכן של כולסטרול ברקמות, תאים, ו- Xenopus oocytes פותחו.
שינוי ברמות הכולסטרול ברקמות ובתאים של היונקים מספר גישות ניתן לרתום כדי להקטין את רמות הכולסטרול ברקמות ובתאים18. גישה אחת כרוכה החשיפה שלהם כדי סטטינים התפרקה ליפופרוטאין סרום לקויה לעכב hmg-CoA רדוקטאז, אשר שולטת על שיעור סינתזה כולסטרול19,20. עם זאת, אלה תרופות הפחתת כולסטרול גם לעכב את היווצרות של מוצרים שאינם sterol לאורך השביל mevalonate. לכן, כמות קטנה של mevalonate מתווסף כדי לאפשר היווצרות של מוצרים אלה21 ולשפר את הספציפיות של גישה זו. גישה נוספת להפחתת רמות הכולסטרול כרוכה בשימוש בβ-ציקלודטרינים. אלה ונומרים מונודורים בעלי חלל הידרופובי פנימי עם קוטר המתאים לגודל של תחום ה סטרולים22, אשר מקלה על החילוץ של כולסטרול מתאים, ובכך מכלה אותם מתוכן כולסטרול יליד שלהם23. דוגמה היא 2-הידרוקסיל-β-cyclodextrin (HPβCD), תרופה פרה-קלינית הנבדקת כיום לטיפול במחלת מחלת הבחור הנימן, הפרעת מטבולית קטלנית תורשתית המאופיינת באחסון כולסטרול ליזוזומבית24. רמת המחסור בכולסטרול תלויה בנגזרת הספציפית שבשימוש. לדוגמה, HPβCD מחלצת כולסטרול בקיבולת נמוכה יותר מאשר הנגזרת המתיל, הβ-cyclodextrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. בעיקר, עם זאת, β-ציקלודטרינים יכולים גם לחלץ מולקולות הידרופובי אחרים בנוסף לכולסטרול, אשר עשוי לגרום להשפעות שאינן ספציפיות31. בניגוד דלדול, תאים ורקמות יכול להיות מועשר במיוחד עם כולסטרול באמצעות הטיפול עם β-cyclodextrin כי כבר presaturated עם כולסטרול23. גישה זו יכולה לשמש גם כשליטה על הספציפיות של β-ציקלודטרינים המשמשים למחסור בכולסטרול31. דלדול כולסטרול מן הרקמות והתאים הוא פשוט יכול להיות מושגת על ידי חשיפת התאים עבור 30-60 דקות כדי 5 mM MβCD מומס במדיום המשמש לאחסון התאים. גישה זו יכולה לגרום לירידה של 50% בתוכן כולסטרול (למשל, ב נוירונים בהיפוקמפוס32, העורקים המוח מוחין33). מצד שני, הכנת מורכבות β-cyclodextrin-כולסטרול עבור העשרת כולסטרול של רקמות ותאים מורכבים יותר, והוא יתואר בסעיף הפרוטוקול.
גישה חלופית להעשרת רקמות ותאים באמצעות β-cyclodextrin רווי כולסטרול כרוך בשימוש LDL, אשר מסתמך על קולטני LDL המבוטא ברקמות/תאים18. בעוד גישה זו מציעה את היתרון של שימוש במנגנון הומאוסטזיס כולסטרול טבעי של התא, יש לו מספר מגבלות. ראשית, רקמות ותאים שאינם מבטאים את קולטן ה-LDL לא ניתן להעשיר באמצעות גישה זו. שנית, חלקיקי LDL מכילים שומנים אחרים בנוסף לכולסטרול. באופן ספציפי, LDL מורכב חלבון ApoB100 (25%) ואת השומנים הבאים (75%): ~ 6-8% כולסטרול, ~ 45-50% cholesteryl אסתר, ~ 18-24% פוספוליפידים, ו ~ 4-8% triacylglycerols34. כך, משלוח של כולסטרול באמצעות חלקיקי LDL הוא לא ספציפי. שלישית, אחוז העלייה בתוכן כולסטרול על-ידי LDL ברקמות ובתאים המבטאים את קולטן ה-LDL עשוי להיות נמוך באופן משמעותי מהעלייה שנצפתה באמצעות cyclodextrin רווי בכולסטרול. למשל, במחקר הקודם, העשרה של עורקים מוחין מכרסמים עם כולסטרול דרך LDL הביא רק 10-15% עלייה ברמות הכולסטרול35. לעומת זאת, העשרת העורקים הללו עם cyclodextrin רווי כולסטרול כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול הביאו לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגים, איור 1).
שינוי של רמות כולסטרול בקסנפוס אוציטים קסנפוס אוציטים מהווים מערכת ביטוי הטרוולוגי המשמשת בדרך כלל לחקר תאי וחלבון. מחקרים מוקדמים הראו כי הכולסטרול ליחס פוספוליפיד טוחנת ב Xenopus oocytes הוא 0.5 ± 0.136. בשל רמה גבוהה פנימית של כולסטרול, הגדלת התוכן של כולסטרול במערכת זו הוא מאתגר, עדיין ניתן להשיג באמצעות דיספרסיות ממברנה פוספוליפידים וכולסטרול. פוספוליפידים כי בחרנו למטרה זו דומים לאלה המשמשים ליצירת השומנים מישורי מלאכותי bilayers וכוללים L-α-פוספולידילטנולטואמין (האפיפיור) ו-1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-3-פוספאו-L-סרין (פופס), כמתואר בסעיף הפרוטוקול. גישה זו יכולה לגרום לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגות, איור 2).
גישה חלופית כדי להעשיר Xenopus מועשר עם מפזרים פוספוליפיד זרחן כרוך בשימוש של cyclodextrin רווי כולסטרול, אשר דומה הרקמות והתאים מועשרים. עם זאת, מצאנו את הגישה הזאת כדי להיות בלתי מנוצחת ויעילות נמוכה, עם ממוצע של ~ 25% עלייה בתוכן כולסטרול. ייתכן שהדבר נובע מיכולת הטעינה השונה של שתי גישות אלה (ראה סעיף ' תוצאות מייצגות ', איור 3). לעומת זאת, זה הוכח כי באמצעות cyclodextrin כדי לרוקן את הכולסטרול מ Xenopus oocytes יכול לגרום ~ 40% ירידה בתוכן כולסטרול36.
כאן, אנו מתמקדים העשרה כולסטרול של רקמות ותאים באמצעות היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול, ו Xenopus אוציטים באמצעות ליפוזומים. שתי הגישות ניתן לרתום כדי להתוות את ההשפעה של רמות גבוהות של כולסטרול על תפקוד החלבון. המנגנונים של אפנון כולסטרול של פונקציית חלבון עשויים לכלול אינטראקציות ישירות8 ו/או אפקטים עקיפים9. כאשר הכולסטרול משפיע על תפקוד החלבון באמצעות אינטראקציות ישירות, ההשפעה של גידול ברמות הכולסטרול על פעילות החלבון היא כנראה עצמאית של סוג התא, מערכת הביטוי, או גישה העשרה. לדוגמה, אנו מנוצל שתי גישות אלה כדי לקבוע את ההשפעה של כולסטרול ב-G-חלבון מגודרת בתוכו אשלגן (girk) ערוצים מבוטא פרפור מייציטים37, היפוקמוניות נוירונים32,38, HEK29339 תאים, ו xenopus oocytes32,37. התוצאות שהתקבלו במחקרים אלה היו עקביים: בכל שלושת הסוגים של התאים המיונקים ובתוך הכולסטרול האמפיבי הכולסטרול של הערוץ (ראה מדור תוצאות נציג, איור 4, עבור נוירונים היפוקמאל והניסויים המתאימים xenopus oocytes). יתר על כן, תצפיות שנעשו במחקרים אלה היו גם עקבי עם תוצאות המחקרים שבוצעו ב פרפור מייציטים37,40 ו היפוקמאל נוירונים32,38 מבודדים טרי מבעלי חיים נתון דיאטה כולסטרול גבוה40. בעיקר, העשרה כולסטרול של נוירונים היפוקמאל באמצעות MβCD הפך את ההשפעה של טיפול atorvastatin המשמש לטיפול ההשפעה של הדיאטה הכולסטרול הגבוה הן על רמות כולסטרול ו-GIRK פונקציה38. במחקרים אחרים, חקרנו את ההשפעה של מוטציות על רגישות כולסטרול של מבפנים לתקן אשלגן לתקן את קיר 2.1 באמצעות שניהם Xenopus oocytes ו HEK293 תאים41. שוב, השפעת המוטציות על רגישות הערוץ הייתה דומה בשתי המערכות.
היישומים של שתי שיטות העשרה לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב הם רבים. בפרט, השימוש של מתחמי cyclodextrin-כולסטרול כדי להעשיר את התאים והרקמות הוא נפוץ מאוד בעיקר בשל הייחוד שלה. דוגמאות אחרונות של גישה זו כוללות את קביעת ההשפעה של כולסטרול על הפעלת ערוץ HERG ומנגנונים הבסיסי42, גילוי כי כולסטרול מפעיל את חלבון G מצמידים קולטן Smoothened כדי לקדם קיפוד איתות43, ואת הזיהוי של התפקיד של כולסטרול בביומכניקה של תא גזע ו אדיפוגנזה באמצעות רפידת מקשר הקשורים חלבונים44. בעבודתנו שלנו, אנו מנוצלים העשרה רקמות המסיביות עם MβCD: קומפלקס כולסטרול כדי ללמוד את ההשפעה של העשרה כולסטרול על הפונקציה הבסיסית ואת פרופיל פרמקולוגית של סידן, מתח מגודרת ערוצים של מוליכות גדולה (BK, מקסימינק) בשריר חלק וסקולרית35,45,46. במחקרים אחרים, השתמשנו הגישה מבוססי פוספוליפיד מבוסס פיזור עבור מעשיר xenopus של הכולסטרול עם כולסטרול כדי לקבוע את התפקידים של אזורים שונים ב-קיר 2.1 ו-girk של הרגישות כולסטרול41,47,48,49, כמו גם כדי לקבוע אתרים כולסטרול בכבלים הללו בערוצים אלה32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

העשרת כולסטרול של רקמות ותאים מיונקים, כולל Xenopus oocytes המשמשים ללימוד תפקוד התא, ניתן לבצע באמצעות מגוון שיטות. כאן אנו מתארים שתי גישות חשובות המשמשות למטרה זו. ראשית, אנו מתארים כיצד להעשיר רקמות ותאים עם כולסטרול באמצעות cyclodextrin רווי כולסטרול באמצעות עורקים מוחין (רקמות) ו נוירונים היפוקמאל (תאים) כדוגמאות. גישה זו יכולה לשמש עבור כל סוג של רקמות, תאים, או קווי תאים. גישה חלופית להעשרה כולסטרול כרוכה בשימוש בליפרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). היתרון של גישה זו הוא כי היא משתמשת בחלק ממנגנון הומאוסטזיס טבעי של הכולסטרול של התא. עם זאת, בעוד הגישה cyclodextrin ניתן להחיל להעשיר כל סוג תא של עניין עם כולסטרול, גישה LDL מוגבל לתאים המבטאים קולטני LDL (למשל, תאי הכבד, מח עצם נגזר תאים כגון לוקיציטים דם ומקרופאגים רקמות), ואת רמת העשרה תלוי בריכוז וניידות של קולטן LDL. יתר על כן, חלקיקי LDL כוללים שומנים אחרים, כך משלוח כולסטרול הוא לא ספציפי. שנית, אנו מתארים כיצד להעשיר Xenopus oocytes עם כולסטרול באמצעות הפיזור פוספוליפיד מבוסס (כלומר, ליפוזומים) הכולל כולסטרול. קסנפוס אוציטים מהווה מערכת הטרוולוגי פופולרית המשמשת ללימוד תאים וחלבונים. הן הגישה הcyclodextrin המבוססת על כולסטרול של רקמת היונקים (עורקים מוחית) ועל הגישה המבוססת פוספוליפיד כולסטרול של Xenopus oocytes, אנו מדגימים כי רמות הכולסטרול להגיע למקסימום הבא 5 דקות של דגירה. רמה זו של כולסטרול נשאר קבוע במהלך תקופות ממושכות של דגירה (למשל, 60 דקות). יחד, נתונים אלה לספק את הבסיס עבור תנאים הזמני אופטימיזציה עבור העשרה כולסטרול של רקמות, תאים, ו Xenopus oocytes למחקרים פונקציונליים שמטרתה חקירת ההשפעה של העשרה כולסטרול.

השימוש cyclodextrin רווי כולסטרול כאמצעי להעשרת רקמות ותאים עם כולסטרול הוא מבוסס היטב. כאן, אנו הראשונים להדגים את היישום של גישה זו בשימוש נרחב להעשרת עורקים מוחין החולדה עם כולסטרול באמצעות MβCD רווי בכולסטרול. איור 1מראה דוגמה של שכבת השריר החלקה של...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

שתי שיטות של העשרה כולסטרול מוצגים: היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול כדי להעשיר את רקמות היונקים ואת התאים, ואת השימוש של פוספוליפיד זרחן מועשר מבוססי מפזרים (ליפוזומים) כדי להעשיר Xenopus oocytes. שיטות אלה הן אינסטרומנטלי לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב.

העשרה של רקמות מיונקים וקסנפוס אוציטים עם כולסטרול

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

כולסטרול גבוה הוא גורם סיכון עיקרי למחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות. הפרוטוקולים שלנו מספקים כלים בעלי ערך לחקר ההשלכות הפיזיולוגיות והמכוניסטיות של היפרכולסטרולמיה. הליכים אלה יכולים להתבצע באמצעות ציוד מעבדה בסיסי, והם חלים על תאים, רקמות, ו קסנופוס oocytes.כולסטרול הוא מרכיב מרכזי של קרום הסלולר בכל הגוף. טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של רמות גבוהות של כולסטרול בכל סוג תא. ניתוח העורקים הוא הצעד הקשה ביותר.בזהירות להסיר את העורק מהמוח, מבלי למתוח או לפגוע ברקמת כלי הדם. שומנים הם עדינים מאוד, ולעבוד איתם הוא יותר אמנות מאשר מדע. הדגמת וידאו מספקת מדריך ללימוד כיצד לטפל בזהירות בליפידים.כדי להכין את הכולסטרול רווי מתיל-בטא-cyclodextrin פתרון, תחילה להוסיף 064 גרם של מתיל-בטא-cyclodextrin ל 10 מיליליטר של PBS, ערבוב הפתרון עם בר ערבוב, כדי להבטיח כי מתיל-בטא-cyclodextrin מתמוסס לחלוטין. לאחר מכן, מוסיפים 0024 גרם של אבקת כולסטרול לבקבוק, ומערבבים את הפתרון במרץ, באמצעות מרית כדי לשבור כמו גושי כולסטרול רבים ככל האפשר. כאשר כמעט כל הכולסטרול כבר מומס, לאטום את הבקבוק עם לפחות שתי שכבות של סרט פרפין.ולנער את הבקבוק בערך 30 תנודות לדקה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר שמונה עד 16 שעות, מצננים את הפתרון לטמפרטורת החדר, לפני סינון התערובת באמצעות מסנן מזרק פוליאתרשולפון 22 מיקרומטר לתוך בקבוק בכיתה. להעשרת עורק המוח של יונקים, לקצור את המוח מ 250 עד 300 גרם Sprague Dawley עכברוש לתוך PBS על קרח, לפני העברת המוח לתוך קערת ניתוח שעווה, תחת מיקרוסקופ מנתח, המכיל מספיק PBS כדי להטביע את הרקמה.לאבטח את המוח עם שניים עד שלושה סיכות, לוודא שהם לא לחדור כלי דם. ולהשתמש במטלפים חדים ומספריים כירורגיים קטנים כדי לנתח בעדינות את העורקים המוחיים ואת ענפיהם שיוצרים את מעגל ויליס בבסיס המוח. לאחר מכן, שטפו לזמן קצר עד לסנטימטר אחד של מקטעי עורקים ארוכים ב- PBS, לפני הדגירה של המקטעים השטיפים בתתכנות מעשירה מספיק כולסטרול כדי לכסות את הרקמות.כדי לקבוע שינויים ברמת הכולסטרול, השתמש בבקבוק טרי של אבקת פיליפין כדי להכין 10 מיליגרם לכל מיליליטר פתרון מלאי של הצבע דימתיל סולפוקסיד, ולשטוף את הרקמות מועשר כולסטרול עם שלוש חמש דקות שטיפות PBS טרי. לאחר הכביסה האחרונה, לתקן את מקטעי העורק ב 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות על קרח, מוגן מפני אור, לפני permeabilizing את הדגימות ב 5% טריטון ב PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות עם שלוש חמש דקות שטיפה PBS על שייקר, לפני הוספת הדגימות ל 25 מיקרוגרם למיליליטר ריכוז סופי של פתרון צבע פיליפיני, במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את חתיכות העורק שלוש פעמים כפי שהוכח, ואחריו שטיפה קצרה עם מים מזוקקים. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש ברקמת מעבדה כדי לספוג כל נוזל עודף, ולהוות את העורקים על מגלשה באמצעות מדיום הרכבה מתאים. בזהירות לכסות את העורקים עם להחליק כיסוי, דואג להימנע מתגלגל או פיתול של הרקמה, ולתת את השקופית יבש במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.כאשר מדיום ההרכבה יבש, לאטום את קצוות החלקת הכיסוי עם לק ברור, ולאפשר לק להתייבש במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, תמונה הרקמה עם העירור של 340 עד 380 ננומטר, ו פליטה של 385 עד 470 ננומטר. כדי להכין את הפיזור מבוסס פוספוליפיד, לשלב 200 microliters של 10 מיליגרם לכל מיליליטר כלורופורם מומס תמיסת השומנים, L-אלפא-phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-גליצרו-3-פוספוכולין, וכולסטרול בצינור זכוכית 12 מיליליטר.לאדות את כלורופורם במכסה המנוע תחת זרם של חנקן, לפני השעיית השומנים ב 800 microliters של אשלגן כלורי 150 מילימולרי ו 10 מילימולר טריס HEPES פתרון. לאחר מכן לאטום את הצינור עם סרט פרפין, בעדינות sonicate את תכולת הצינור ב 80 קילוהרץ במשך 10 דקות, עד תערובת חלבית נוצרת. להעשרת כולסטרול של קסנופוס oocytes, להשתמש במטליות חדות כדי לשבש את הסק השחלות מצפרדע נקבה Xenopus laevis באזורים מרובים, ולמקם את נתחי השחלה לתוך צלחת 60 מילימטר עם חמישה מיליליטר של סידן חינם ND96 בתוספת 5 מיליגרם למיליליטר של קולגן.לנער את הרקמה על שייקר מסלולית ב 60 תנודות לדקה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, השתמשו בפיפלטת העברה עם קצה רחב כדי לפעום במרץ את ה-oocyte המכיל פתרון חמש עד עשר פעמים כדי לבודד את הוציטים הבודדים, ולשטוף במהירות את תסנובת האוציטים הכהים עם ND96 נטול סידן טרי עד שהפתרון הופך לשקוף. לאחר מכן, להעביר 90 microliters של כולסטרול מועשר פוספוליפיד מבוסס פיזור לתוך באר אחת של צלחת 96 גם, ולהוסיף עד שישה oocytes ל הבאר עם מדיום קטן ככל האפשר.מניחים את צלחת 96 היטב על מסובב פלטפורמה תלת מימדי במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן להוסיף טיפה של ND96 לגם, ולהעביר את הכולסטרול מועשר oocytes לצלחת 35 מילימטר המכיל ND96 לניתוח המיידי שלהם. כאן, דוגמה של שכבת שריר חלק עורק מוחי בתמונה מדגים את הגידול תלוי הריכוז פלואורסצנטיות הקשורים פיליפין המתקבל על העשרת רקמות עם ריכוזים הולכים וגדלים של כולסטרול.יש לציין כי שלוש שעות לאחר הטיפול במתחם הכולסטרול מתיל-בטא-ציקלודקסטרין רמות הכולסטרול ירדו בכ-50% בהשוואה לרמתן מיד לאחר ההעשרה. בעוד זמן הדגירה של שעה אחת משמש בדרך כלל כדי להעשיר את הרקמות והתאים עם כולסטרול במהלך גישה זו, חמש דקות של דגירה הוא בדרך כלל מספיק כדי להשיג עלייה משמעותית סטטיסטית בתכלית כולסטרול עורקי מוחי כפי שנקבע על ידי כולסטרול אוקסידזה מבוסס בדיקות ביוכימיות. אמנם אין שינוי משמעותי נצפתה ברמות הכולסטרול ב קסנופוס oocytes מועשר שליטה פוספוליפיד מבוסס פיזור חסר כולסטרול, רמות הכולסטרול להגדיל באופן משמעותי לאחר חמש דקות בלבד של טיפול עם זרחונים מבוססי פיזור הכוללים כולסטרול, ולהישאר ברמה זו כאשר זמן הדגירה הוא גדל ל 60 דקות.האפקטיביות של הגישה מבוססת cyclodextrin להעשרת תאים מוכחת גם נוירונים מבודדים טריים מאזור CA1 של ההיפוקמפוס. אכן, דגירה של הנוירונים במתיל-בטא-ציקלודקטרין רווי כולסטרול במשך 60 דקות גורמת לעלייה של יותר פי שניים ברמות הכולסטרול, כפי שהוערך על ידי הפלואורסצנטיות הפיליפינית הקשורה. בסך הכל, שני הצעדים החשובים ביותר עבור הליכים אלה הם הכנת תערובת העשרת הכולסטרול ולהבטיח את שלמות רקמת העורקים.בעקבות העשרת הכולסטרול, ניתן ללמוד את תפקוד החלבונים המושפעים מהיפרכולסטרולמיה. היכולת להעשיר תאים עם כולסטרול הקלה על המחקר של רמות כולסטרול גבוהות בקרדיומיוציטים ונוירונים. השימוש בוציטים איפשר לנו לחקור כיצד כולסטרול נקשר לערוצי היונים.חלוק מעבדה וכפפות היא תמיד להיות משוחק לפרוטוקול זה. יש להשתמש בכלורופורם ובפרפורמלדהיד מתחת למכסה המנוע ולהשליך אותם כפסולת מסוכנת.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...