Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एआर-डी) से एक वैज्ञानिक विकास अनुदान (11SDG5190025) द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R01 अनुदान एए-०२३७६४ (ए. एन.बी.), और एचएल-१०४६३१ और R37 एए-११५६० (A.M.D. ) द्वारा समर्थित था ।

जानवरों के साथ सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं टेनेसी स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (UTHSC) के विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया गया । जानवरों की देखभाल और प्रायोगिक प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और यूटीएचएससी की ए?...

कोलेस्ट्रॉल के साथ स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं और Xenopus oocytes को समृद्ध करने के तरीके जटिल मैक्रोमॉलिक्यूलर सिस्टम (जैसे, प्रोटीन) और सेलुलर और अंग समारोह पर व्यक्तिगत आणविक प्रजातियों पर ऊंचा कोलेस्ट्?...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

कोशिका समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ज़ेनोपस ओसाइट्स सहित स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं का कोलेस्ट्रॉल संवर्धन विभिन्न तरीकों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। यहां, हम इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले दो महत्वपूर्ण दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, हम उदाहरण के रूप में सेरेब्रल धमनियों (ऊतकों) और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स (कोशिकाओं) का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्स्ट्रिन का उपयोग करकोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने का वर्णन करते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग किसी भी प्रकार के ऊतक, कोशिकाओं या सेल लाइनों के लिए किया जा सकता है। कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) का उपयोग शामिल है। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह कोशिका के प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल होमोस्टोसिस मशीनरी के हिस्से का उपयोग करता है। हालांकि, जबकि साइक्लोडेक्सट्रिन दृष्टिकोण कोलेस्ट्रॉल के साथ किसी भी सेल प्रकार के ब्याज को समृद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है, एलडीएल दृष्टिकोण उन कोशिकाओं तक सीमित है जो एलडीएल रिसेप्टर्स (जैसे, यकृत कोशिकाओं, बोन मैरो-व्युत्पन्न कोशिकाओं जैसे रक्त ल्यूकोसाइट्स और ऊतक मैक्रोफेज) व्यक्त करते हैं, और संवर्धन का स्तर एलडीएल रिसेप्टर की एकाग्रता और गतिशीलता पर निर्भर करता है। इसके अलावा, एलडीएल कणों में अन्य लिपिड शामिल हैं, इसलिए कोलेस्ट्रॉल डिलीवरी गैर-विशिष्ट है। दूसरा, हम वर्णन करते हैं कि फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव (यानी, लिपोसोम्स) का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स को कैसे समृद्ध किया जाए जिसमें कोलेस्ट्रॉल शामिल है। ज़ेनोपस ओसाइट्स सेल और प्रोटीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक लोकप्रिय विषमलोगोस अभिव्यक्ति प्रणाली का गठन करता है। स्तनधारी ऊतक (सेरेब्रल धमनियों) के साइक्लोडेक्सट्रिन आधारित कोलेस्ट्रॉल संवर्धन दृष्टिकोण और ज़ेनोपस ओसाइट्स के फॉस्फोलिपिड आधारित कोलेस्ट्रॉल संवर्धन दृष्टिकोण के लिए, हम यह प्रदर्शित करते हैं कि कोलेस्ट्रॉल का स्तर ऊष्मायन के 5 मिन के बाद अधिकतम तक पहुंचता है। कोलेस्ट्रॉल का यह स्तर ऊष्मायन (जैसे, 60 ग्राम) की विस्तारित अवधि के दौरान स्थिर रहता है। साथ में, ये डेटा कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के प्रभाव से पूछताछ करने के उद्देश्य से कार्यात्मक अध्ययनों के लिए ऊतकों, कोशिकाओं और ज़ेनोपस ओसाइट्स के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए अनुकूलित लौकिक स्थितियों का आधार प्रदान करते हैं।

कोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक साधन के रूप में कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग अच्छी तरह से स्थापित है। यहां, हम पहले कोलेस्ट्रॉल के स...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के दो तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं: स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्स्ट्रिन का अनुप्रयोग, और ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध फॉस्फोलिपिड-आधारित फैलाव (लिपोसोम) का उपयोग। ये विधियां आणविक, सेलुलर और अंग समारोह में ऊंचा कोलेस्ट्रॉल के स्तर के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।

कोलेस्ट्रॉल के साथ स्तनधारी ऊतकों और ज़ेनोपस ओसाइट्स का संवर्धन

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

ऊंचा कोलेस्ट्रॉल हृदय और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है। हमारे प्रोटोकॉल हाइपरकोलेस्टेरियोलिमिया के शारीरिक और मशीनी दोनों परिणामों का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण प्रदान करते हैं। इन प्रक्रियाओं को बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है, और कोशिकाओं, ऊतकों और ज़ेनोपस ओसाइट्स पर लागू होता है।कोलेस्ट्रॉल पूरे शरीर में सेलुलर झिल्ली का एक प्रमुख घटक है। इन तकनीकों का उपयोग किसी भी कोशिका प्रकार में कोलेस्ट्रॉल के ऊंचा स्तर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। धमनियों को विच्छेदन करना सबसे कठिन कदम है।ध्यान से मस्तिष्क से धमनी को हटा दें, बिना खींच या संवहनी ऊतक को नुकसान पहुंचाए। लिपिड बहुत नाजुक हैं, और उनके साथ काम करना एक विज्ञान की तुलना में एक कला का अधिक है। वीडियो प्रदर्शन कैसे लिपिड को ध्यान से संभालने के लिए सीखने के लिए एक गाइड प्रदान करता है ।कोलेस्ट्रॉल सैचुरेटेड मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्स्ट्रि सॉल्यूशन तैयार करने के लिए सबसे पहले 064 ग्राम मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्स्ट्रि को 10 मिलीलीटर पीबीएस में डालें, जो कि एक हलचल बार के साथ समाधान को हिलाते हैं, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्सट्रिन पूरी तरह से घुल जाए। इसके बाद, फ्लास्क में 0024 ग्राम कोलेस्ट्रॉल पाउडर जोड़ें, और समाधान को तेजी से हिलाएं, एक स्पैटुला का उपयोग करके जितना संभव हो उतने कोलेस्ट्रॉल के हिस्से को तोड़ने के लिए। जब लगभग सभी कोलेस्ट्रॉल भंग हो गया है, पैराफिन फिल्म की कम से कम दो परतों के साथ फ्लास्क सील।और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में प्रति मिनट के बारे में 30 दोलनों पर फ्लास्क हिला । आठ से 16 घंटे के बाद, एक वर्ग की बोतल में एक 22 माइक्रोमीटर पॉलीएथर्सल्फोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से मिश्रण को छानने से पहले, कमरे के तापमान के समाधान को ठंडा करें। स्तनधारी मस्तिष्क धमनी संवर्धन के लिए, एक २५० से ३०० ग्राम Sprague Dawley चूहा बर्फ पर PBS के एक बीकर में मस्तिष्क फसल, एक लच्छेदार विच्छेदन कटोरा में मस्तिष्क स्थानांतरित करने से पहले, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, बस पर्याप्त PBS युक्त ऊतक जलमग्न करने के लिए ।दो से तीन पिन के साथ मस्तिष्क को सुरक्षित करें, सुनिश्चित करें कि वे रक्त वाहिकाओं में प्रवेश नहीं करते हैं। और मस्तिष्क के आधार पर विली के सर्कल बनाने वाली मस्तिष्क धमनियों और उनकी शाखाओं को धीरे-धीरे विच्छेदन करने के लिए तेज संदंश और छोटी सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। इसके बाद, ऊतकों को कवर करने के लिए पर्याप्त कोलेस्ट्रॉल समृद्ध समाधान में कुल्ला खंडों को इनक्यूबेट करने से पहले, पीबीएस में एक सेंटीमीटर लंबी धमनी खंडों को संक्षेप में कुल्ला करें।कोलेस्ट्रॉल के स्तर में किसी भी परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए, डिमेथिल सल्फोक्साइड में डाई के 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए फिलिपिन पाउडर की एक ताजा बोतल का उपयोग करें, और ताजा पीबीएस में तीन पांच मिनट की धोता के साथ कोलेस्ट्रॉल समृद्ध ऊतकों को धोएं। अंतिम धोने के बाद, धमनी खंडों को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में बर्फ पर 15 मिनट के लिए ठीक करें, प्रकाश से संरक्षित, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 5% ट्राइटन में नमूनों को पार करने से पहले। इनक्यूबेशन के अंत में, एक शेखर पर पीबीएस में तीन पांच मिनट की धुलाई के साथ ऊतकों को धोएं, नमूनों को 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर अंतिम एकाग्रता में जोड़ने से पहले, कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए, प्रकाश से संरक्षित।इनक्यूबेशन के अंत में, धमनी के टुकड़ों को तीन बार धोएं, जिसके बाद आसुत पानी के साथ एक संक्षिप्त कुल्ला किया गया। अंतिम धोने के बाद, किसी भी अतिरिक्त तरल को अवशोषित करने के लिए एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग करें, और एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग करके धमनियों को स्लाइड पर माउंट करें। ध्यान से एक कवर पर्ची के साथ धमनियों को कवर, रोलिंग या ऊतक के घुमा से बचने के लिए ध्यान रखना, और स्लाइड कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए सूखी, प्रकाश से संरक्षित करते हैं ।जब बढ़ते माध्यम सूखी है, स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची किनारों सील, और पॉलिश 10 से 15 मिनट के लिए सूखने के लिए अनुमति देते हैं । फिर, 340 से 380 नैनोमीटर की उत्तेजन के साथ ऊतक की छवि, और 385 से 470 नैनोमीटर का उत्सर्जन। फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव तैयार करने के लिए 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म भंग लिपिड सॉल्यूशन, एल-अल्फा-फॉस्फेटिडिलेथेनहामाइन, 1-पामिटोइल-2-ओलिओइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन और कोलेस्ट्रॉल के 200 माइक्रोलीटर को 12 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में मिलाएं।नाइट्रोजन की एक धारा के तहत हुड में क्लोरोफॉर्म वाष्पित, बफर 150 मिलीमोलर पोटेशियम क्लोराइड और 10 मिलीमोलर ट्रिस एचईपीएस समाधान के 800 माइक्रोलीटर में लिपिड को निलंबित करने से पहले। फिर पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूब को सील करें, और धीरे-धीरे 80 किलोहर्ट्ज पर ट्यूब सामग्री को 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें, जब तक कि दूधिया मिश्रण न बन जाए। ज़ेनोपस ओसाइट्स के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए, कई क्षेत्रों में एक मादा ज़ेनोपस लेविस मेंढक से अंडाशय थैली को बाधित करने के लिए तेज संदंश का उपयोग करें, और अंडाशय के हिस्से को 60 मिलीमीटर प्लेट में रखें जिसमें कैल्शियम मुक्त ND96 के पांच मिलीलीटर के साथ कोलेजनेस के 5 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक हो।कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रति मिनट 60 दोलनों पर एक कक्षीय शेखर पर ऊतक हिलाएं। इनक्यूबेशन के अंत में, व्यक्तिगत ओसाइट्स को अलग करने के लिए पांच से 10 बार समाधान युक्त ओसाइट युक्त ओसाइट को सख्ती से पिपेट करने के लिए एक विस्तृत टिप के साथ एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें, और समाधान पारदर्शी होने तक ताजा कैल्शियम मुक्त ND96 के साथ अंधेरे ओसाइट समाधान को जल्दी से कुल्ला करें। इसके बाद, कोलेस्ट्रॉल समृद्ध फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव के 90 माइक्रोलीटर को 96 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें, और जितना संभव हो उतना कम माध्यम के साथ अच्छी तरह से छह ओसाइट्स तक जोड़ें।पांच से 10 मिनट के लिए एक तीन आयामी मंच रोटेटर पर ९६ अच्छी तरह से थाली रखें । फिर कुएं में ND96 की एक बूंद जोड़ें, और कोलेस्ट्रॉल समृद्ध oocytes को उनके तत्काल विश्लेषण के लिए ND96 युक्त 35 मिलीमीटर प्लेट में स्थानांतरित करें। यहां, एक इमेज्ड सेरेब्रल धमनी चिकनी मांसपेशियों की परत का एक उदाहरण कोलेस्ट्रॉल की बढ़ती सांद्रता के साथ ऊतक संवर्धन पर प्राप्त फिलिपिन संबद्ध फ्लोरेसेंस में एकाग्रता निर्भर वृद्धि को दर्शाता है।विशेष रूप से तीन घंटे मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्स्ट्रिन कोलेस्ट्रॉल जटिल के साथ उपचार के बाद कोलेस्ट्रॉल के स्तर में समृद्धि के तुरंत बाद उनके स्तर की तुलना में लगभग 50% की कमी आई। जबकि एक घंटे इनक्यूबेशन समय आमतौर पर इस दृष्टिकोण के दौरान कोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इनक्यूबेशन के पांच मिनट आमतौर पर कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेस आधारित जैव रासायनिक परख द्वारा निर्धारित मस्तिष्क धमनी कोलेस्ट्रॉल सामग्री में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है । हालांकि कोलेस्ट्रॉल की कमी नियंत्रण फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव से समृद्ध ज़ेनोपस ओसाइट्स में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा जाता है, लेकिन कोलेस्ट्रॉल आधारित फैलाव के साथ केवल पांच मिनट के उपचार के बाद कोलेस्ट्रॉल का स्तर काफी बढ़ जाता है जिसमें कोलेस्ट्रॉल शामिल होता है, और इस स्तर पर रहता है जब इनक्यूबेशन समय 60 मिनट तक बढ़ जाता है।कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए साइक्लोडेक्स्ट्रिन आधारित दृष्टिकोण की प्रभावशीलता भी हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र से ताजा अलग न्यूरॉन्स में प्रदर्शित की जाती है। दरअसल, मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्सट्रिन में न्यूरॉन्स के इनक्यूबेशन ६० मिनट के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त कोलेस्ट्रॉल के स्तर में दो गुना से अधिक वृद्धि हुई है, के रूप में फिलिपिन से जुड़े फ्लोरेसेंस द्वारा मूल्यांकन किया । कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं के लिए दो सबसे महत्वपूर्ण कदम कोलेस्ट्रॉल संवर्धन मिश्रण तैयार कर रहे है और धमनी ऊतक की अखंडता सुनिश्चित करने ।कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के बाद, कोई भी हाइपरकोलेस्टेरियोमिया से प्रभावित प्रोटीन के कार्य का अध्ययन कर सकता है। कोलेस्ट्रॉल के साथ कोशिकाओं को समृद्ध करने की क्षमता कार्डियोमायोसाइट्स और न्यूरॉन्स में ऊंचा कोलेस्ट्रॉल के स्तर के अध्ययन की सुविधा । oocytes के उपयोग ने हमें यह जांचने की अनुमति दी कि कोलेस्ट्रॉल आयन चैनलों को कैसे बांधता है।एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने वह हमेशा इस प्रोटोकॉल के लिए पहना जा सकता है । क्लोरोफॉर्म और पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग धूम हुड के नीचे किया जाना चाहिए और इसे खतरनाक कचरे के रूप में त्याग दिया जाना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

वोल्टेज क्लैंप फ्लोराइट्री में<em&gt; Xenopus</em&gt; फ्लोरोसेंट अस्वास्थ्यकर एमिनो एसिड का प्रयोग करने वाले ओक्साइट्स

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय का संवर्धन

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

इमेजिंग Amyloid ऊतक Hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा Luminescent संयुग्मित Oligothiophenes के साथ दाग

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

स्तनधारी mRNAs पर अनुवाद दीक्षा परिसर गठन का Toeprinting विश्लेषण

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

स्तनधारी Bestrophin आयन चैनलों की अभिव्यक्ति और शुद्धि

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

MicroRNA के साथ देशी Lipoprotein कणों का संवर्धन और उनके निरपेक्ष के बाद दृढ़ संकल्प/

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

कोशिकाओं और ऊतकों में कोएंजाइम ए का परिमाण

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...