Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da un borsedigio per lo sviluppo di scienziati (11SDG5190025) dell'American Heart Association (a A.R.-D.), e dal National Institute of Health R01 concede AA-023764 (a A.N.B.) e HL-104631 e R37 AA-11560 (a A.M.D.).

Tutte le procedure sperimentali con gli animali sono state eseguite presso l'University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). La cura degli animali e dei protocolli sperimentali è stata esaminata e approvata dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'UTHSC, un'istituzione accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Laboratory Animal Care International.
1. Arricchimento di tessuti e cellule che utilizzano metil-z-ciclodextrin saturi di colesterolo
<p...

I metodi per arricchire i tessuti e le cellule dei mammiferi e gli evociti di Xenopus con il colesterolo costituiscono un potente strumento per studiare l'effetto dei livelli elevati di colesterolo sulle singole specie molecolari, sui complessi sistemi macromolecolari (ad esempio, proteine) e sulla funzione cellulare e dell'organo. In questo articolo, abbiamo descritto due approcci complementari che facilitano tali studi. In primo luogo, abbiamo descritto come arricchire i tessuti e le cellule con colesterolo ut...

Il colesterolo, un grande lipido cellulare, svolge numerosi ruoli funzionali e strutturali critici1,2,3,4,5,6,7,8,9. Dalla regolazione delle proprietà fisiche della membrana plasmatica a garantire la vitalità cellulare, la crescita, la proliferazione e fungere da segnalazione e molecola precursore in una pletora di vie biochimiche, il colesterolo è un componente imperativo necessario per la normale funzione cellulare e dell'organo. Di conseguenza, la carenza di colesterolo si traduce in gravi malformazioni fisiche e una varietà di disturbi. D'altra parte, anche un piccolo aumento del colesterolo al di sopra dei livelli fisiologici (2-3x) è citotossico1,2,10 ed è stato associato allo sviluppo di disturbi, tra cui cardiovascolare11,12,13 e malattie neurodegenerative14,15,16,17. Così, per interrogare le funzioni critiche del colesterolo e per determinare l'effetto dei cambiamenti nei livelli di colesterolo, sono stati sviluppati diversi approcci che alterano il contenuto di colesterolo nei tessuti, nelle cellule e negli ovociti di Xenopus.
Alterazione dei livelli di colesterolo nei tessuti e nelle cellule dei mammiferi Diversi approcci possono essere sfruttati per diminuire i livelli di colesterolo nei tessuti e nelle cellule18. Un approccio prevede la loro esposizione alle statine disciolte nel siero carente di lipoproteina per inibire la reductasi HMG-CoA, che controlla il tasso di sintesi del colesterolo19,20. Tuttavia, questi farmaci per abbassare il colesterolo inibiscono anche la formazione di prodotti non sterolo lungo il percorso mevalonato. Pertanto, viene aggiunta una piccola quantità di mevalonato per consentire la formazione di questi prodotti21 e migliorare la specificità di questo approccio. Un altro approccio per diminuire i livelli di colesterolo coinvolge l'uso di z-ciclodextrins. Questi monomeri glucopyranosi possiedono una cavità idrofobica interna con un diametro che corrisponde alla dimensione di steroli22, che facilita l'estrazione del colesterolo dalle cellule, esaurendoli così dal loro contenuto nativo di colesterolo23. Un esempio è costituito da 2-idrossipropyl-z-ciclodextrin (HP-cyclodextrin, un farmaco preclinico attualmente in fase di test per il trattamento della malattia di Niemann-Pick di tipo C, una malattia metabolica fatale ereditata geneticamente ereditata caratterizzata dall'accumulo di colesterolo lisonio24. Il livello di esaurimento del colesterolo dipende dal derivato specifico utilizzato. Ad esempio, l'HP-CD estrae il colesterolo con una capacità inferiore rispetto al derivato metilato, metil-z-ciclodextrin (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. In particolare, tuttavia, il ciclodextrintrins può anche estrarre altre molecole idrofobiche oltre al colesterolo, il che può poi provocare effetti non specifici31. A differenza dell'esaurimento, le cellule e i tessuti possono essere specificamente arricchiti con colesterolo attraverso il trattamento con ciclodextrina che è stato presaturato con colesterolo23. Questo approccio può essere utilizzato anche come controllo per la specificità di z-ciclodextrins utilizzato per l'esaurimento del colesterolo31. L'esaurimento del colesterolo dai tessuti e dalle cellule è semplice e può essere raggiunto esponendo le cellule per 30-60 min a 5 mM-MCD disciolti nel mezzo utilizzato per la conservazione delle cellule. Questo approccio può provocare una diminuzione del 50% del contenuto di colesterolo (ad esempio, nei neuroni ippocampali32, arterie cerebrali del ratto33). D'altra parte, preparare il complesso di colesterolo z-cyclodextrin-colesterolo per l'arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule è più complesso, e sarà descritto nella sezione protocollo.
Un approccio alternativo all'arricchimento dei tessuti e delle cellule che utilizzano la saturazione di colesterolo derivante dal colesterolo, che si basa sui recettori LDL espressi nei tessuti/cellule18. Mentre questo approccio offre il vantaggio di utilizzare il meccanismo naturale di omeostasi colesterolo della cellula, ha diverse limitazioni. In primo luogo, i tessuti e le cellule che non esprimono il recettore LDL non possono essere arricchiti con questo approccio. In secondo luogo, le particelle LDL contengono altri lipidi oltre al colesterolo. In particolare, LDL è costituito dalla proteina ApoB100 (25%) e i seguenti lipidi (75%): colesterolo del 6-8%, 45-50% di esteri di colesterile, 18-24% fosforidi, e 34 triacylgliceroli34. Pertanto, la somministrazione di colesterolo tramite particelle LDL non è specifica. In terzo luogo, la percentuale di aumento del contenuto di colesterolo da LDL nei tessuti e nelle cellule che esprimono il recettore LDL può essere significativamente inferiore all'aumento osservato utilizzando ciclodextrin saturo di colesterolo. Ad esempio, in uno studio precedente, l'arricchimento delle arterie cerebrali dei roditori con colesterolo tramite LDL ha provocato solo un aumento del 10-15% nei livelli di colesterolo35. Al contrario, l'arricchimento di queste arterie con ciclodextrin saturo di colesterolo come descritto nella sezione protocollo ha provocato >50% aumento del contenuto di colesterolo (Vedi sezione Risultati rappresentativi, Figura 1).
Alterazione dei livelli di colesterolo in Xenopus oecytes Gli ovociti Xenopus costituiscono un sistema di espressione eterologa comunemente usato per studiare la funzione cellulare e proteica. Studi precedenti hanno dimostrato che il rapporto di colesterolo al molare fosfolipide in Xenopus oocytes è 0,5 x 0,136. A causa di questo alto livello intrinseco di colesterolo, aumentare il contenuto di colesterolo in questo sistema è impegnativo, ma può essere raggiunto utilizzando dispersioni a base di fosfolipidi di membrana e colesterolo. I fosfolipidi che abbiamo scelto per questo scopo sono simili a quelli utilizzati per formare bistrato ibici planari artificiali e includono l'l-z-fosfatidylethanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), come descritto nella sezione del protocollo. Questo approccio può comportare un aumento del contenuto di colesterolo in >50% (vedere la sezione Risultati rappresentativi, Figura 2).
Un approccio alternativo all'arricchimento degli ovociti di Xenopus con dispersioni a base di fosofilidi comporta l'uso di ciclodextrin saturi di colesterolo, che è simile al modo in cui tessuti e cellule sono arricchiti. Tuttavia, abbiamo trovato questo approccio di bassa riproducibilità ed efficienza, con una media di 25% aumento del contenuto di colesterolo. Ciò è probabilmente dovuto alla diversa capacità di caricamento di questi due approcci (vedere la sezione Risultati rappresentativi, Figura 3). Al contrario, è stato dimostrato che l'utilizzo di ciclodextrinper per esaurire il colesterolo da Xenopus oocytes può provocare una diminuzione del colesterolo del 40% nel contenuto36.
Qui, ci concentriamo sull'arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule dei mammiferi attraverso l'applicazione di ciclodextrinsatura satura di colesterolo e di Enopus evociti usando i liposomi. Entrambi gli approcci possono essere sfruttati per delineare l'effetto dell'aumento dei livelli di colesterolo sulla funzione proteica. I meccanismi di modulazione del colesterolo della funzione proteica possono comportare interazioni dirette8 e/o effetti indiretti9. Quando il colesterolo influisce sulla funzione delle proteine tramite interazioni dirette, l'effetto di un aumento dei livelli di colesterolo sull'attività proteica è probabilmente indipendente dal tipo di cellula, dal sistema di espressione o dall'approccio di arricchimento. Per esempio, abbiamo utilizzato questi due approcci per determinare l'effetto del colesterolo sui canali di rettificazione interiore del potassio (GIRK) della proteina G e 32 espressi nei miociti atriale37,neuroni ippocampali32,38, HEK29339 cellule, e Xenopus oociti32,37. I risultati ottenuti in questi studi sono stati coerenti: in tutti e tre i tipi di cellule di mammiferi e negli ovociti anfibi il colesterolo ha aumentato la funzione del canale GIRK (vedi sezione Risultati rappresentativi, Figura 4, per i neuroni ippocampali e i corrispondenti esperimenti in ovociti di Xenopo). Inoltre, le osservazioni fatte in questi studi erano anche coerenti con i risultati degli studi condotti in miociti atriale37,40 e neuroni ippocampali32,38 appena isolati da animali sottoposti a una dieta ad alto colesterolo40. In particolare, l'arricchimento del colesterolo dei neuroni ippocampali utilizzando la funzione di abitarla ha invertito l'effetto della terapia dell'atorvastatina utilizzata per affrontare l'impatto della dieta ad alto colesterolo sia sui livelli di colesterolo che sulla funzione GIRK38. In altri studi, abbiamo studiato l'effetto delle mutazioni sulla sensibilità al colesterolo del canale di potassio rettificare interiormente Kir2.1 utilizzando sia gli evociti Xenopus che le cellule HEK29341. Ancora una volta, l'effetto delle mutazioni sulla sensibilità del canale era simile nei due sistemi.
Le applicazioni di entrambi i metodi di arricchimento per determinare l'impatto dei livelli elevati di colesterolo sulla funzione molecolare, cellulare, e dell'organo sono numerosi. In particolare, l'uso di complessi di colesterolo ciclodelo per arricchire le cellule e i tessuti è molto comune in gran parte a causa della sua specificità. Esempi recenti di questo approccio includono la determinazione dell'impatto del colesterolo sull'attivazione del canale HERG e i meccanismi sottostanti42, la scoperta che il colesterolo attiva il recettore accoppiato della proteina G levigato per promuovere la segnalazione delriccio 43, e l'identificazione del ruolo del colesterolo nella biomeccanica delle cellule staminali e nell'adipogenesi attraverso le proteine associate alla membrana44. Nel nostro lavoro, abbiamo utilizzato l'arricchimento dei tessuti mammiferi con il complesso M'CD:colesterolo per studiare l'effetto dell'arricchimento del colesterolo sulla funzione di base e il profilo farmacologico dei canali di calcio e tensione-gated di grandi conduttamenti (BK, MaxiK) nel muscolo liscio vascolare35,45,46. In altri studi, abbiamo usato l'approccio di dispersione basato sul fosfolipidi per arricchire gli evociti Xenopus con il colesterolo per determinare i ruoli delle diverse regioni nei canali Kir2.1 e GIRK nella sensibilità al colesterolo41,47,48,49, così come per determinare i siti di legame putativo in questi canali32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

L'arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule dei mammiferi, compresi gli evociti di Xenopus utilizzati per studiare la funzione cellulare, può essere realizzato utilizzando una varietà di metodi. In questo caso, descriviamo due approcci importanti utilizzati a questo scopo. In primo luogo, descriviamo come arricchire tessuti e cellule con colesterolo usando ciclodextrin saturi di colesterolo usando arterie cerebrali (tessuti) e neuroni ippocampali (cellule) come esempi. Questo approccio può essere utilizzato per qualsiasi tipo di tessuto, cellule o linee cellulari. Un approccio alternativo per l'arricchimento del colesterolo prevede l'uso di lipoproteina a bassa densità (LDL). Il vantaggio di questo approccio è che utilizza parte della macchina naturale dell'omeostasi del colesterolo della cellula. Tuttavia, mentre l'approccio ciclodextrin può essere applicato per arricchire qualsiasi tipo di interesse cellulare con il colesterolo, l'approccio LDL è limitato alle cellule che esprimono i recettori LDL (ad esempio, le cellule epatiche, le cellule derivate dal midollo osseo come i leucociti e i macrofagi tissutali), e il livello di arricchimento dipende dalla concentrazione e dalla mobilità del recettore LDL. Inoltre, le particelle Di LDL includono altri lipidi, quindi la somministrazione di colesterolo non è specifica. In secondo luogo, descriviamo come arricchire gli ovociti di Xenopus con colesterolo usando una dispersione a base di fosforidi (cioè liposomi) che include il colesterolo. Gli ovociti Xenopus costituiscono un popolare sistema di espressione eterologa utilizzato per studiare la funzione cellulare e proteica. Sia per l'approccio di arricchimento del colesterolo basato su ciclodintrina del tessuto dei mammiferi Xenopus (arterie cerebrali) sia per l'approccio di arricchimento del colesterolo basato su fosfori di nociti, dimostriamo che i livelli di colesterolo raggiungono un massimo dopo 5 min di incubazione. Questo livello di colesterolo rimane costante durante lunghi periodi di incubazione (ad esempio, 60 min). Insieme, questi dati forniscono la base per condizioni temporali ottimizzate per l'arricchimento del colesterolo di tessuti, cellule e evociti di Xenopus per studi funzionali volti a interrogare l'impatto dell'arricchimento del colesterolo.

L'uso di ciclodextrin saturo di colesterolo come mezzo per arricchire tessuti e cellule con colesterolo è ben consolidato. In questo caso, dimostriamo prima l'applicazione di questo approccio ampiamente usato per arricchire le arterie cerebrali di ratto con colesterolo usando MCD saturi di colesterolo. La figura 1A mostra un esempio di uno strato muscolare liscio dell'arteria cerebrale raffigurata e dimostra l'aumento dipendente dalla concen...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Sono presentati due metodi di arricchimento del colesterolo: l'applicazione di ciclodextrin satura di colesterolo per arricchire tessuti e cellule mammiferi e l'uso di dispersioni a base di fosfolipidi arricchiti di colesterolo (liposomi) per arricchire gli evociti di Xenopo. Questi metodi sono fondamentali per determinare l'impatto dei livelli elevati di colesterolo nella funzione molecolare, cellulare e dell'organo.

Arricchimento dei tessuti mammiferi e Xenopus Oocytes con colesterolo

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Il colesterolo elevato è un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari e neurodegenerative. I nostri protocolli forniscono strumenti preziosi per studiare le conseguenze fisiologiche e meccaniche dell'ipercolesterolemia. Queste procedure possono essere eseguite utilizzando attrezzature di laboratorio di base e sono applicabili a cellule, tessuti e ovociti Xenopus.Il colesterolo è un componente importante delle membrane cellulari in tutto il corpo. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare l'impatto di elevati livelli di colesterolo in qualsiasi tipo di cellula. Sezionare le arterie è il passo più difficile.Rimuovere con cura l'arteria dal cervello, senza allungare o danneggiare il tessuto vascolare. I lipidi sono molto delicati e lavorare con loro è più un'arte che una scienza. La dimostrazione video fornisce una guida per imparare a gestire attentamente i lipidi.Per preparare la soluzione di metil-beta-ciclodestrina satura di colesterolo, aggiungere prima 064 grammi di metil-beta-ciclodestrina a 10 millilitri di PBS, mescolando la soluzione con una barra di agitazione, per assicurarsi che la metil-beta-ciclodestrina si dissolva completamente. Successivamente, aggiungere 0024 grammi di polvere di colesterolo al pallone e mescolare vigorosamente la soluzione, usando una spatola per rompere il maggior numero possibile di blocchi di colesterolo. Quando quasi tutto il colesterolo è stato sciolto, sigillare il pallone con almeno due strati di pellicola di paraffina.E scuotere il pallone a circa 30 oscillazioni al minuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo otto o 16 ore, raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, prima di filtrare la miscela attraverso un filtro siringa in polieteresolfone da 22 micrometri in una bottiglia di classe. Per l'arricchimento dell'arteria cerebrale dei mammiferi, raccogliere il cervello da un ratto Sprague Dawley da 250 a 300 grammi in un becher di PBS sul ghiaccio, prima di trasferire il cervello in una ciotola di dissezione cerata, al microscopio sezionato, contenente appena abbastanza PBS per immergere il tessuto.Fissare il cervello con due o tre perni, assicurandosi che non penetrino nei vasi sanguigni. E usare forcep affilate e piccole forbici chirurgiche per sezionare delicatamente le arterie cerebrali e i loro rami che formano il Cerchio di Willis alla base del cervello. Successivamente, sciacquare brevemente segmenti di arteria lunghi fino a un centimetro in PBS, prima di incubare i segmenti risciacquati in una soluzione che arricchisce il colesterolo sufficiente a coprire i tessuti.Per determinare eventuali alterazioni del livello di colesterolo, utilizzare una bottiglia fresca di polvere di filippina per preparare una soluzione di brodo da 10 milligrammi per millilitro del colorante nel solfossido di dimetile e lavare i tessuti arricchiti di colesterolo con tre lavaggi di cinque minuti in PBS fresco. Dopo l'ultimo lavaggio, fissare i segmenti dell'arteria in paraformaldeide al 4% per 15 minuti sul ghiaccio, protetti dalla luce, prima di permeabilizzare i campioni nel 5%Triton in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare i tessuti con tre lavaggi di cinque minuti in PBS su uno shaker, prima di aggiungere i campioni a una concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro di soluzione di colorante filippino, per un'ora a temperatura ambiente, protetta dalla luce.Alla fine dell'incubazione, lavare i pezzi dell'arteria tre volte come dimostrato, seguito da un breve risciacquo con acqua distillata. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare un tessuto da laboratorio per assorbire qualsiasi liquido in eccesso e montare le arterie su uno scivolo utilizzando un mezzo di montaggio appropriato. Coprire con cura le arterie con un coperchio scivolare, facendo attenzione a evitare il rotolamento o la torsione del tessuto, e lasciare asciugare lo scivolo per 24 ore a temperatura ambiente, protetto dalla luce.Quando il mezzo di montaggio è asciutto, sigillare i bordi dello slittamento del coperchio con smalto chiaro e lasciare asciugare lo smalto per 10-15 minuti. Quindi, immagina il tessuto con un'eccitazione da 340 a 380 nanometri e un'emissione da 385 a 470 nanometri. Per preparare la dispersione a base fosfolipidica, combinare 200 microlitri da 10 milligrammi per millilitro cloroformio soluzione lipidica disciolta, L-alfa-fosfatidiletanolammina, 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterolo in un tubo di vetro da 12 millilitri.Evaporare il cloroformio nella cappa sotto un flusso di azoto, prima di sospendere i lipidi in 800 microlitri di cloruro di potassio tamponato da 150 millimolare e soluzione di Tris HEPES da 10 millimolare. Quindi sigillare il tubo con pellicola di paraffina e sonicare delicatamente il contenuto del tubo a 80 kilohertz per 10 minuti, fino a formare una miscela lattina. Per l'arricchimento del colesterolo degli ovociti xenopus, utilizzare forcep affilati per interrompere il sacco ovarico da una rana Xenopus laevis femmina in più regioni e posizionare i pezzi dell'ovaio in una piastra di 60 millimetri con cinque millilitri di ND96 senza calcio integrati con 5 milligrammi per millilitro di collagenasi.Agitare il tessuto su uno shaker orbitale a 60 oscillazioni al minuto per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di trasferimento con un'ampia punta per pipettare vigorosamente l'ovociti contenente la soluzione da cinque a 10 volte per isolare i singoli ovociti e sciacquare rapidamente la soluzione di ovociti scuri con ND96 fresco privo di calcio fino a quando la soluzione diventa trasparente. Successivamente, trasferire 90 microlitri della dispersione a base di fosfolipide arricchita di colesterolo in un pozzo di una piastra di 96 pozzetti e aggiungere fino a sei ovociti al pozzo con il meno mezzo possibile.Posizionare la piastra del pozzo 96 su un rotatore a piattaforma tridimensionale per cinque-10 minuti. Quindi aggiungere una goccia di ND96 al pozzo e trasferire gli ovociti arricchiti di colesterolo su una piastra di 35 millimetri contenente ND96 per la loro analisi immediata. Qui, un esempio di uno strato muscolare liscio dell'arteria cerebrale immagine dimostra l'aumento dipendente dalla concentrazione della fluorescenza associata alla filina ottenuta dall'arricchimento dei tessuti con crescenti concentrazioni di colesterolo.In particolare tre ore dopo il trattamento con il complesso di colesterolo metil-beta-ciclodestrina i livelli di colesterolo sono diminuiti di circa il 50% rispetto al loro livello immediatamente dopo l'arricchimento. Mentre un tempo di incubazione di un'ora è comunemente usato per arricchire i tessuti e le cellule con colesterolo durante questo approccio, cinque minuti di incubazione sono solitamente sufficienti per ottenere un aumento statisticamente significativo del contenuto di colesterolo arterioso cerebrale determinato dal test biochimico a base di colesterolo ossidasi. Mentre non si osserva alcun cambiamento significativo nei livelli di colesterolo negli ovociti xenopus arricchiti con dispersioni a base fosfolipidica di controllo prive di colesterolo, i livelli di colesterolo aumentano significativamente dopo soli cinque minuti di trattamento con le dispersioni a base fosfolipidica che includono colesterolo e rimangono a questo livello quando il tempo di incubazione è aumentato a 60 minuti.L'efficacia dell'approccio basato sulla ciclodestrina per le cellule arricchenti è dimostrata anche nei neuroni appena isolati dalla regione CA1 dell'ippocampo. Infatti, l'incubazione dei neuroni in metil-beta-ciclodestrina satura di colesterolo per 60 minuti si traduce in un aumento oltre due volte dei livelli di colesterolo, come valutato dalla fluorescenza associata filippina. Nel complesso, i due passaggi più importanti per queste procedure sono preparare la miscela di arricchimento del colesterolo e garantire l'integrità del tessuto arterioso.Dopo l'arricchimento del colesterolo, si può studiare la funzione delle proteine che sono colpite da ipercolesterolemia. La capacità di arricchire le cellule con colesterolo ha facilitato lo studio di elevati livelli di colesterolo nei cardiomiociti e nei neuroni. L'uso di ovociti ci ha permesso di indagare come il colesterolo si lega ai canali ionici.Un camice da laboratorio e guanti che viene sempre indossata per questo protocollo. La cloroformio e la paraformaldeide devono essere utilizzati sotto una cappa aspirante ed essere scartati come rifiuti pericolosi.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting analisi di traduzione Iniziazione formazione complessa su mRNAs mammiferi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

Arricchimento delle particelle di lipoproteina nativa con microRNA e successiva determinazione del loro contenuto di microRNA assoluto/relativo e della loro velocità di trasferimento cellulare

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...