Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
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この研究は、米国心臓協会(A.R.-D.)の科学者開発助成金(11SDG5190025)と国立衛生研究所R01助成金AA-023764(A.N.B.)、HL-104631およびR37 AA-11560(A.M.D.)によって支援されました。

動物との実験手順はすべてテネシー大学保健科学センター(UTHSC)で行われました。動物のケアおよび実験プロトコルは、試験動動物ケア国際の評価と認定のための協会によって認定された機関であるUTHSCの動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました。
1. コレステロールを飽和させたメチルβ-シクロデキストリンを用いた組織や細胞の濃縮
<p class="jove_content"...

哺乳類の組織や細胞、コレステロールを含むゼノプス卵母細胞を豊かにする方法は、個々の分子種、複雑な高分子系(タンパク質など)、細胞および器官機能に対するコレステロール値の上昇の影響を調査するための強力なツールです。本論文では、このような研究を促進する2つの補完的なアプローチについて述べた。まず、コレステロールを飽和したMβCDを用いてコレステロールを有?...

コレステロールは、主要な細胞脂質、多数の重要な機能的および構造的役割11、2、3、4、5、6、7、8、92,3,4,5,6,7,8を9果たしている。原形質膜の物理的性質を調節することから、細胞の生存率を保証すること、増殖、増殖、および生化学的経路の多くのシグナル伝達および前駆体分子としての役割を果たすことまで、コレステロールは正常な細胞および器官機能に必要不可欠な構成要素である。その結果、コレステロール欠乏症は、重度の身体的奇形および様々な障害をもたらす。,一方、生理学的レベル(2-3x)以上のコレステロールのわずかな増加でさえ、細胞傷害性,11、2、102,10であり、心血管11、12、13および神経変性疾患111414、15、16、1715を含む障害の発症と関連している。16,171213このように、コレステロールの重要な機能を問い合わせて、コレステロール値の変化の影響を判断するために、組織、細胞、およびゼノプス卵母細胞中のコレステロールの含有量を変化させる異なるアプローチが開発されている。
哺乳類組織および細胞におけるコレステロール値の変化 いくつかのアプローチは、組織および細胞18におけるコレステロールのレベルを低下させるために利用することができる。1つのアプローチは、コレステロール合成19,20の速度を制御するHMG-CoA還元体を阻害するためにリポタンパク質欠損血清中に溶解したスタチンへのそれらの曝露を20含む。しかし、これらのコレステロール低下薬はまた、メバロント経路に沿った非ステロール製品の形成を阻害する。したがって、これらの製品21の形成を可能にし、このアプローチの特異性を高めるために少量のメバロン化物が添加される。コレステロール値を低下させるもう一つのアプローチは、β-シクロデキストリンの使用を含む.これらのグルココピー鼻モノマーは、ステロール22の大きさに一致する直径を有する内部疎水性キャビティを有し、細胞からのコレステロールの抽出を容易にし、それによってそれらの天然コレステロール含有量23からそれらを枯渇させる。その一例は、2−ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリン(HPβCD)であり、ニーマンピック型C型疾患の治療のために現在試験されている前臨床薬物であり、リソソームコレステロール貯蔵24を特徴とする遺伝的に遺伝した致命的な代謝障害である。コレステロールの枯渇のレベルは、使用される特定の誘導体に依存します。例えば、HPβCDはメチル化誘導体よりも低容量のコレステロールを抽出し、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)24、25、26、27、28、29、30。29,3024,25,26,27,28,しかし、特に、β-シクロデキストリンはコレステロールに加えて他の疎水性分子を抽出することもできるが、その後、非特異的な効果を生じ得る31。枯渇とは対照的に、細胞および組織は、コレステロール23で予備飽和されたβ-シクロデキストリンによる処置を通じてコレステロールを特異的に濃縮することができる。このアプローチは、コレステロール枯渇31に用いられるβ-シクロデキストリンの特異性のコントロールとして用いることもできる。組織および細胞からのコレステロールの枯渇は簡単であり、細胞を貯蔵するために使用される培地に溶解した30〜60分間mMMβCDの細胞を曝露することによって達成することができる。このアプローチは、コレステロール含有量の50%の減少をもたらすことができます(例えば、海馬ニューロン32、ラット大脳動脈33)。一方、組織や細胞のコレステロール濃縮のためのβ-シクロデキストリン-コレステロール複合体の調製はより複雑であり、プロトコルセクションに記載される。
コレステロールを飽和させたβ-シクロデキストリンを用いて組織および細胞を濃縮する別のアプローチは、組織/細胞18に発現するLDL受容体に依存するLDLの使用を含む。このアプローチは、細胞の天然コレステロール恒常性機械を使用する利点を提供するが、それはいくつかの制限があります。第一に、LDL受容体を発現しない組織や細胞は、このアプローチでは濃縮できない。第二に、LDL粒子はコレステロールに加えて他の脂質を含む。具体的には、LDLは、タンパク質ApoB100(25%)で構成されています以下の脂質(75%):〜6〜8%コレステロール、〜45〜50%コレステリルエステル、〜18〜24%リン脂質、および〜4〜8%トリアシルグリセロール34。したがって、LDL粒子を介したコレステロールの送達は非特異的である。第三に、LDL受容体を発現する組織および細胞におけるLDLによるコレステロール含有量の増加の割合は、コレステロールを飽和させたシクロデキストリンを用いて観察された増加よりも有意に低い場合がある。例えば、以前の研究では、LDLを介してコレステロールを有するげっ歯類の大脳動脈の濃縮は、コレステロール値の10〜15%の増加をもたらした35.対照的に、プロトコルセクションに記載されているようにコレステロールで飽和したシクロデキストリンを有するこれらの動脈の濃縮は、コレステロール含有量の50%の増加をもたらした(代表結果セクション、図1を参照)。
ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール値の変化 ゼノプス卵母細胞は、細胞およびタンパク質機能の研究に一般的に使用される異種発現系を構成する。以前の研究では、ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール対リン脂質モル比は0.5±0.136であることを示している。コレステロールのこの本質的な高レベルのため、このシステムでコレステロールの含有量を増加させることは困難であり、まだ膜リン脂質とコレステロールから作られた分散を使用して達成することができます。この目的のために選択したリン脂質は、人工平坦脂質二重層の形成に使用されるものと類似しており、L-α-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)および1-パルミトイル-2-オレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-l-セリン(POPS)を含む。この方法では、コレステロールの含有量が 50% 増加する可能性があります (代表的な結果セクションを参照してください(図 2)。
リン脂質ベースの分散液でゼノプス卵母細胞を濃縮する別のアプローチは、組織および細胞が濃縮される方法に似ているコレステロールで飽和シクロデキストリンの使用を含む。しかし、このアプローチは、コレステロール含有量の平均約25%の増加で、再現性と効率が低いことがわかりました。これは、これら 2 つのアプローチの負荷容量が異なる可能性があります (代表的な結果セクション、図 3を参照)。これに対し、ゼノプス卵母細胞からコレステロールを枯渇させるシクロデキストリンを使用すると、コレステロール含量が36%〜40%減少36する可能性があることが示されている。
ここでは、コレステロール飽和シクロデキストリンの適用と、リポソームを用いたゼノプス卵母細胞の適用を通じて、哺乳類組織および細胞のコレステロール濃縮に焦点を当てます。両方のアプローチは、タンパク質機能に対するコレステロールの増加レベルの効果を示すために利用することができます。タンパク質機能のコレステロール調節のメカニズムは、直接的な相互作用を伴うことがあります 8および/または間接的な効果9.コレステロールが直接相互作用を介してタンパク質機能に影響を与える場合、コレステロール値の増加がタンパク質活性に及ぼす影響は、細胞の種類、発現系、または濃縮アプローチとは無関係である可能性が高い。例えば、心房筋細胞37、39海馬ニューロン32、38、HEK2933,38細胞、およびゼノプス卵母細胞32,37において発現される内向きに整流されたG-gatedG-gated(GIRK)チャネルに対するコレステロールの影響を決定するために、37これら2つのアプローチを利用した。これらの研究で得られた結果は一貫していた:哺乳類細胞のすべての3つのタイプおよび両生類卵母細胞でコレステロールアップレギュレートGIRKチャネル関数(海馬ニューロンおよびゼノプス卵母細胞における対応する実験については、代表的な結果セクション、図4を参照)。さらに、これらの研究で行われた観察はまた、心房筋細胞37、40および海馬ニューロン4032、38,38で行われた研究の結果と一致した高コレステロール食,40を受けた動物から新たに単離した。特に、MβCDを用いた海馬ニューロンのコレステロール濃縮は、コレステロール値及びGIRK機能38に対する高コレステロール食の影響に対処するために用いられるアトルバスタチン療法の効果を逆転させた。他の研究では、ゼノプス卵母細胞およびHEK293細胞41の両方を用いて、内向きに整流カリウムチャネルKir2.1のコレステロール感受性に対する突然変異の影響を調べた。繰り返しますが、チャネルの感受性に対する突然変異の影響は、2つのシステムで同様であった。
コレステロール値上昇が分子、細胞、臓器機能に及ぼす影響を判定するための両方の濃縮方法の応用は数多くある。特に、細胞や組織を豊かにするシクロデキストリン-コレステロール複合体の使用は、その特異性が大きく広がることが多い。このアプローチの最近の例としては、HERGチャネル活性化及び基礎機構42に対するコレステロールの影響の決定、コレステロールがヘッジホッグシグナル伝達43を促進するためにSmoothenedGタンパク質結合受容体Smoothenedを活性化するという発見、および膜関連リンカータンパク質44を介した幹細胞バイオメカニクスおよび有分形成におけるコレステロールの役割の同定を含む。私たち自身の研究では、MβCD:コレステロール複合体を用いた哺乳類組織濃縮を利用して、コレステロールの富化が血管平滑筋35,45,46,の大きな導電度(BK,MaxiK)のカルシウムおよび電圧ゲートチャネルの基本的機能35,および薬理学的プロファイルに及ぼす影響を研究しました。46他の研究では、コレステロールを伴う,ゼノプス卵母細胞を濃縮するためのリン脂質ベースの分散アプローチを用いて、コレステロール感受性41、47、48、49,47,48におけるKir2.1およびGIRKチャネルにおける異なる領域の役割を決定し、ならびに49これらのチャネル32、50、51において32,50,51コレステロール結合部位を決定した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

哺乳類組織および細胞のコレステロール濃縮は、細胞機能の研究に用いられるゼノプス卵母細胞を含め、様々な方法を用いて達成することができる。ここでは、この目的に用いられる2つの重要なアプローチについて説明します。まず、例として、脳動脈(組織)と海馬ニューロン(細胞)を用いてコレステロールを飽和させたシクロデキストリンを用いて、コレステロールを有する組織や細胞を濃縮する方法を説明する。このアプローチは、あらゆるタイプの組織、細胞、または細胞株に使用できます。コレステロールの濃縮のための別のアプローチは、低密度リポタンパク質の使用を含む (LDL).このアプローチの利点は、それが細胞の自然なコレステロール恒常性機械の一部を使用することです.しかし、シクロデキストリンアプローチはコレステロールを有するあらゆる細胞タイプの関心を豊かにするために適用できるのに対し、LDLアプローチはLDL受容体を発現する細胞(例えば、肝臓細胞、血球球および組織マクロファージなどの骨髄由来細胞)に限定され、濃縮のレベルはLDL受容体の濃度および移動度に依存する。さらに、LDL粒子は他の脂質を含むが、コレステロール送達は非特異的である。第2に、コレステロールを含むリン脂質系分散体(すなわちリポソーム)を用いて、ゼノプス卵母細胞をコレステロールで濃縮する方法を説明する。ゼノプス卵母細胞は、細胞およびタンパク質機能の研究に使用される一般的な異種発現系を構成する。哺乳動物組織(大脳動脈)のシクロデキストリン系コレステロール濃縮アプローチとゼノプス卵母細胞のリン脂質ベースのコレステロール濃縮アプローチの両方について、コレステロール値がインキュベーションの最大5分に達することを実証する。このコレステロールのレベルは、インキュベーションの長期期間(例えば、60分)の間に一定のままである。これらのデータは、コレステロール濃縮の影響を調べるための機能研究のために、組織、細胞、ゼノプス卵母細胞のコレステロール濃縮のための最適化された時間的条件の基礎を提供します。

コレステロールを有する組織および細胞を豊かにする手段としてコレステロールで飽和シクロデキストリンの使用は十分に確立されている.ここでは、コレステロール飽和MβCDを用いてラット大脳動脈をコレステロールで濃縮するためのこの広く用いられているアプローチの応用をまず実証する。図1Aは、画像化された大脳動脈平滑筋...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

コレステロールを飽和させて哺乳動物の組織や細胞を豊かにするシクロデキストリンの適用と、ゼノプス卵母細胞を豊かにするコレステロールを豊富なリン脂質系分散液(リポソーム)の使用の2つの方法が提示される。これらの方法は、分子、細胞、および器官機能におけるコレステロール値の上昇の影響を決定するのに役立ちます。

哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

コレステロールの上昇は、心血管および神経変性疾患の主要な危険因子です。私たちのプロトコルは、高コレステロール血症の生理学的および機械学的な結果の両方を研究するための貴重なツールを提供します。これらの手順は、基本的なラボ機器を使用して実行することができ、細胞、組織、およびゼノプス卵母細胞に適用可能です。コレステロールは、体全体の細胞膜の主要なコンポーネントです。.これらの技術は、任意の細胞型のコレステロールの上昇レベルの影響を研究するために利用することができます。動脈を解剖することは最も困難なステップです。血管組織を伸ばしたり損傷したりすることなく、脳から動脈を慎重に取り除いてください。脂質は非常に繊細であり、それらを扱うことは科学よりも芸術です。ビデオデモンストレーションは、脂質を注意深く扱う方法を学ぶガイドを提供します。コレステロール飽和メチル-β-シクロデキストリン溶液を調製するには、まず10ミリリットルのPBSに064グラムのメチル-β-シクロデキストリンを加え、攪拌バーで溶液をかき混ぜ、メチル-β-シクロデキストリンが完全に溶解することを確実にする。次に、フラスコに0024グラムのコレステロール粉末を加え、ヘラを使用してできるだけ多くのコレステロール塊を分解して溶液を激しく攪拌します。ほぼすべてのコレステロールが溶解したら、フラスコを少なくとも2層のパラフィンフィルムで密封する。そして、一晩37度摂氏水浴で毎分約30振動でフラスコを振ります。8~16時間後、溶液を室温まで冷却し、22マイクロメートルのポリエーテルスルホンフィルターを通してクラスボトルに濾過します。哺乳類の大脳動脈濃縮のために、250〜300グラムのスプレイグ・ドーリーラットから氷上のPBSのビーカーに脳を収穫し、ワックス解剖ボウルに脳を移す前に、解剖顕微鏡の下で、組織を水没させるのに十分なPBSを含む。2~3本のピンで脳を固定し、血管に浸透しないようにします。そして、鋭い鉗子と小さな外科用はさみを使用して、脳の基部にウィリスの円を形成する大脳動脈とその枝を穏やかに解剖します。次に、PBSで長い動脈セグメントを1センチメートルまで簡単にすすいでから、組織を覆うのに十分なコレステロール濃縮溶液でリンスされたセグメントをインキュベートする。コレステロール値の変化を決定するには、新鮮なフィリパン粉末のボトルを使用して、ジメチルスルホキシドの染料の1ミリリットル当たり10ミリグラムのストック溶液を調製し、新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄でコレステロール濃縮組織を洗浄します。最後の洗浄後、4%パラホルムアルデヒドで動脈セグメントを氷上で15分間固定し、光から保護し、PBSの5%トリトンでサンプルを室温で10分間透過させます。インキュベーションの終わりに、シェーカーでPBSで3回の5分間の洗浄で組織を洗浄し、サンプルを1ミリリットル当たり25マイクログラムのフィリピシン染料溶液に加える前に、室温で1時間、光から保護します。インキュベーションの終わりに、示されているように動脈片を3回洗い、続いて蒸留水で短いすすいでください。最後の洗浄後、ラボ組織を使用して余分な液体を吸収し、適切な取り付け媒体を使用して動脈をスライドに取り付けます。慎重にカバースリップで動脈を覆い、組織の転がりやねじれを避けるように注意し、スライドを光から保護された室温で24時間乾燥させます。取り付け媒体が乾燥したら、カバースリップエッジを透明なマニキュアで密封し、磨きを10〜15分間乾燥させます。次いで、340〜380ナノメートルの励起、および385〜470ナノメートルの放出で組織を画像化する。リン脂質ベースの分散液を調製するために、1ミリリットルクロロホルム溶解脂質溶液あたり10ミリグラムの200マイクロリットル、L-α-ホスファチジルエタノールアミン、1-パルミトイル-2-オレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、およびコレステロールを12ミリリットルガラスチューブに組み合わせます。窒素の流れの下でフード内のクロロホルムを蒸発させ、脂質を800マイクロリットルの緩衝された塩化150ミリモルカリウムおよび10ミリモルトリスHEPES溶液で懸濁させる。その後、パラフィンフィルムでチューブを密封し、乳白色の混合物が形成されるまで、80キロヘルツでチューブの内容物を10分間穏やかに超音波処理します。ゼノプス卵母細胞のコレステロール濃縮のために、鋭い鉗子を使用して複数の領域の女性ゼノプス・ラエビスカエルから卵巣嚢を破壊し、卵巣塊を60ミリプレートに入れ、5ミリリットルのカルシウムフリーND96を60ミリプレートに入れ、1ミリリットルのコラゲラーゼ1ミリグラムを補う。室温で15分間毎分60回振動して軌道シェーカーの組織を振ります。インキュベーションの最後に、広い先端を持つ移管ピペットを使用して、卵母細胞含有溶液を5〜10回精力的にピペットして個々の卵母細胞を分離し、溶液が透明になるまで新鮮なカルシウムフリーND96で暗い卵母細胞溶液を素早くすすぐ。次に、90マイクロリットルのコレステロールを濃縮したリン脂質ベースの分散液を96ウェルプレートの1ウェルに移し、できるだけ少ない媒体で6個までの卵母細胞をウェルに加える。96ウェルプレートを3次元プラットフォーム回転器に5~10分間置きます。その後、ウェルにND96の滴を加え、コレステロール濃縮卵母細胞をND96を含む35ミリメートルプレートに移して即時分析します。ここで、画像化された大脳動脈平滑筋層の一例は、コレステロールの濃度の増加に伴う組織濃縮時に得られるフィリミン関連蛍光の濃度依存性の増加を示す。特にメチル-β-シクロデキストリンコレステロール複合体による治療後3時間は、コレステロール値が濃縮直後のレベルと比較して約50%減少した。このアプローチの間に1時間のインキュベーション時間がコレステロールを持つ組織および細胞を豊かにするために一般的に使用されるが、インキュベーションの5分は通常、コレステロールオキシダーゼベースの生化学的アッセイによって決定される脳動脈コレステロール含有量の統計的に有意な増加を達成するのに十分である。コレステロールを欠いたコントロールリン脂質ベースの分散液を有するゼノプス卵母細胞のコレステロール値には有意な変化は認められないが、コレステロール値はコレステロールを含むリン脂質ベースの分散液で5分しか処理を行った後に有意に増加し、インキュベーション時間が60分に増加するとこのレベルにとどまる。細胞を濃縮するためのシクロデキストリンベースのアプローチの有効性は、海馬のCA1領域から新たに単離されたニューロンにおいても実証されている。実際、メチル-β-シクロデキストリン中のニューロンのインキュベーションは、60分間コレステロールで飽和し、フィリピシン関連蛍光によって評価されるようにコレステロール値の2倍以上の増加をもたらす。全体的に、これらの手順のための2つの最も重要なステップは、コレステロール濃縮混合物を調製し、動脈組織の完全性を確保することである。コレステロールの濃縮に続いて、高コレステロール血症の影響を受けるタンパク質の機能を研究することができます。コレステロールを持つ細胞を豊かにする能力は、心筋細胞およびニューロンにおけるコレステロール値の上昇の研究を促進した。卵母細胞の使用は、コレステロールがイオンチャネルにどのように結合するかを調査することができました。彼女はいつもこのプロトコルのために着用されるラボコートと手袋。クロロホルムとパラホルムアルデヒドは、ヒュームフードの下で使用し、有害廃棄物として廃棄する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

生化学

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...