Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

이 작품은 미국 심장 협회 (A.R.-D.)에서 과학자 개발 보조금 (11SDG5190025)에 의해 지원되었다, 건강 R01의 국립 연구소에 의해 AA-023764 (A.N.B.에), HL-104631 및 R37 AA-11560 (A.M.D.에).

동물과 모든 실험 절차는 테네시 대학 건강 과학 센터에서 수행되었다 (UTHSC). 동물 및 실험 프로토콜의 관리는 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회의 인가 기관인 UTHSC의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 콜레스테롤포화 메틸β-사이클로덱스트린을 사용하는 조직및 세포의 농축
참고: 아래 콜레스테롤 농축 프로토콜은 조...

포유류 조직과 세포를 풍부하게하는 방법과 콜레스테롤과 제노푸스 난모세포는 개별 분자 종에 높은 콜레스테롤 수치의 효과를 조사하기위한 강력한 도구를 구성, 복잡한 거대 분자 시스템에 (예를 들어, 단백질), 세포와 장기 기능에. 이 논문에서는, 우리는 그 같은 연구 결과를 촉진하는 2개의 상보적인 접근을 기술했습니다. 첫째, 우리는 콜레스테롤포화 MβCD를 사용하여 콜레스테롤로 ?...

콜레스테롤, 주요 세포 지질, 수많은 중요 한 기능 및 구조적 역할을 한다1,,2,,3,,44,5,,6,,7,,8,,9. 혈장 막의 물리적 특성을 조절하는 것에서부터 세포 생존력, 성장, 증식, 그리고 생화학적 경로의 과다에서 신호 및 전구체 분자역할을 하는 것까지, 콜레스테롤은 정상적인 세포 및 장기 기능에 필수적인 구성 요소입니다. 결과적으로, 콜레스테롤 결핍은 가혹한 물리적 기형 및 무질서의 각종 귀착됩니다. 한편, 생리적 수준(2-3x)을 초과하는 콜레스테롤의 작은 증가도 세포독성1,,2,,10 및 심혈관11,12, 13및13 신경퇴행성 질환14,,15,,16,,17을포함하는 질환의 발달과 연관되어 있다., 따라서, 콜레스테롤의 중요한 기능을 심문하고 콜레스테롤 수치의 변화의 효과를 결정하기 위해, 조직, 세포 및 제노푸스 난모세포에서 콜레스테롤의 함량을 변화시키는 다른 접근법이 개발되었다.
포유류 조직 및 세포에 있는 콜레스테롤 수치의 변경 몇몇 접근은 조직과 세포에 있는 콜레스테롤의 수준을 감소시키기 위하여 이용될 수 있습니다18. 1개의 접근은 콜레스테롤 합성19,,20의비율을 통제하는 HMG CoA 환원효소를 억제하기 위하여 지단백질 결핍 혈청에 용해된 스타틴에 그들의 노출을 관련시킵니다. 그러나, 이러한 콜레스테롤 낮추는 약물 또한 mevalonate 통로 따라 비 스테롤 제품의 형성을 억제. 따라서, 소량의 메발로네이트(mevalonate)가 첨가되어 이들제품(21)의 형성을 허용하고 이러한 접근법의 특이성을 강화한다. 콜레스테롤 수치를 감소시키는 또 다른 접근은 β-cyclodextrins의 사용을 관련시킵니다. 이러한 글루카피라노스 단량체는 스테롤(22)의크기와 일치하는 직경의 내부 소수성 공동을 가지고 있어 세포에서 콜레스테롤을 추출하여 기본 콜레스테롤 함량23에서고갈시됩니다. 일례로 는 2-하이드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPβCD)이 있으며, 현재 니만-픽 타입 C질환의 치료를 위해 시험중인 전임상 약물로, 리소좀 콜레스테롤 저장을 특징으로 하는 유전적 유전적 치명적인 대사장애(24)이다. 콜레스테롤 고갈의 수준은 사용된 특정 유도체에 달려 있습니다. 예를 들어, HPβCD는 메틸화 유도체보다 낮은 용량을 가진 콜레스테롤을 추출하며, 메틸-β-시클로덱스트린(MβCD)24,,25,,26,,27,,28,,29,,30. 특히, 그러나, β-cyclodextrins는 또한 콜레스테롤 이외에 그밖 소수성 분자를 추출할 수 있습니다, 그 때 비특이적인 효력31귀착될 수 있는. 고갈과는 대조적으로, 세포와 조직은 콜레스테롤23로포화 된 β-cyclodextrin치료를 통해 콜레스테롤을 구체적으로 풍부하게 할 수 있습니다. 이러한 접근법은 또한 콜레스테롤고갈(31)에사용되는 β-사이클로덱스트린의 특이성에 대한 대조군으로서 사용될 수 있다. 조직 및 세포로부터의 콜레스테롤 고갈은 간단하고 세포를 저장하는 데 사용되는 배지에 용해된 30-60분 내지 5 mMMMMMΒCD에 대한 세포를 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 이 접근법은 콜레스테롤 함량이 50% 감소할 수 있습니다(예를 들어, 해마 뉴런32,쥐 대뇌 동맥33). 한편, 조직 및 세포의 콜레스테롤 농축을 위한 β-사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체를 준비하는 것은 더 복잡하고, 프로토콜 섹션에서 설명될 것이다.
콜레스테롤포화 β-cyclodextrin를 사용하여 조직 과 세포를 풍부하게하는 대안 적인 접근은 조직/세포에 표현된 LDL 수용체에 의존하는 LDL의 사용을 관련시킵니다18. 이 접근법은 세포의 천연 콜레스테롤 항상성 기계를 사용하는 이점을 제공하지만, 몇 가지 한계가 있다. 첫째, LDL 수용체를 발현하지 않는 조직 및 세포는 이 접근법을 사용하여 농축될 수 없다. 둘째, LDL 입자는 콜레스테롤 이외에 다른 지질을 포함. 구체적으로, LDL은 단백질 아포B100 100(25%)으로 구성된다. 및 다음 지질 (75 %): ~ 6-8 % 콜레스테롤, ~ 45-50 % 콜레스테릴 에스테르, ~ 18-24 % 인지질, 및 ~ 4-8 % 트리 아실 글리세롤34. 따라서, LDL 입자를 통한 콜레스테롤의 전달은 비특이적이다. 셋째, LDL 수용체를 발현하는 조직 및 세포에서 LDL에 의한 콜레스테롤 함량 증가의 비율은 콜레스테롤포화 사이클로덱스트린을 사용하여 관찰된 증가보다 현저히 낮을 수 있다. 예를 들어, 이전 연구에서, LDL을 통해 콜레스테롤설치류 대뇌 동맥의 농축만 결과 10-15% 콜레스테롤 수치에 증가35. 대조적으로, 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 콜레스테롤포화사이클로덱스트린을 가진 이들 동맥의 농축은 콜레스테롤 함량의 >50% 증가를 초래하였다(대표 결과 섹션, 그림 1참조).
제노푸스 난소에서 콜레스테롤 수치의 변화 제노푸스 난모세포는 세포 및 단백질 기능을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 이종 발현 시스템을 구성합니다. 이전 연구는 제노푸스 난모세포에서 인지질 대구치 비율에 콜레스테롤이 0.5 ±0.136임을보여주었다. 콜레스테롤의 이 본질적인 높은 수준으로 인해, 이 시스템에서 콜레스테롤의 내용을 증가 하는 것은 도전, 아직 막 인지질과 콜레스테롤에서 만든 분산을 사용 하 여 달성 될 수 있다. 우리가 이 목적을 위해 선택한 인지질은 인공 평면 지질 이중층을 형성하기 위해 사용된 것과 유사하며 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 L-α-phosphatidyleolamine (POPE) 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-phopho-l-serine (POPS)를 포함합니다. 이 접근법은 콜레스테롤 함량이 >50% 증가할 수 있습니다(대표 결과 섹션, 그림 2참조).
인지질 기반 분산으로 제노푸스 난모세포를 풍부하게하는 대체 접근법은 조직과 세포가 농축되는 방식과 유사한 콜레스테롤로 포화 된 사이클로 덱스트린을 사용하는 것을 포함합니다. 그러나, 우리는 낮은 재현성과 효율성의 이 접근이, 콜레스테롤 내용에 있는 ~25% 증가의 평균으로 찾아냈습니다. 이는 이러한 두 가지 접근 방식의 로딩 용량이 다르기 때문일 수 있습니다(대표 결과 섹션, 그림 3참조). 대조적으로, 제노푸스 난모세포에서 콜레스테롤을 고갈시키기 위하여 cyclodextrin를 사용하여 콜레스테롤 내용에서 ~40% 감소귀착될 수 있다는 것을 보여주었습니다36.
여기에서는 콜레스테롤로 포화된 사이클로덱스트린과 리포좀을 이용한 제노푸스 난모세포의 적용을 통해 포유류 조직과 세포의 콜레스테롤 농축에 초점을 맞추고 있습니다. 두 접근 은 단백질 기능에 콜레스테롤의 증가 된 수준의 효과 설명 하기 위해 활용 될 수 있다. 단백질 기능의 콜레스테롤 변조의 메커니즘은 직접적인 상호 작용을 포함 할 수있다8 및 / 또는 간접 효과9. 콜레스테롤이 직접적인 상호 작용을 통해 단백질 기능에 영향을 미칠 때, 단백질 활동에 대한 콜레스테롤 수치의 증가의 효과는 세포 유형, 발현 시스템 또는 농축 접근법과 는 무관합니다. 예를 들어, 이러한 두 가지 접근법을 활용하여 심방 근세포37,해마 뉴런32,,38,HEK29339 세포, 제노푸스 난모세포32,,37로발현된 내측 정류 칼륨(GIRK) 채널에 대한 콜레스테롤의 효과를 결정하였다. 이러한 연구에서 얻은 결과는 일관되었다: 포유류 세포의 모든 세 가지 유형과 양서류 콜레스테롤 upregulated GIRK 채널 기능 (참조 대표 결과 섹션, 그림 4,해마 뉴런 및 제노푸스 oocytes에 해당 실험). 더욱이, 이들 연구에서 이루어진 관찰은 또한 심방 근세포37,,40 및 해마 뉴런32,,38마리가 고콜레스테롤 식이요법을 행한 동물로부터 신선하게 분리된 연구 결과와 일치하였다.40 특히, MβCD를 이용한 해마 뉴런의 콜레스테롤 농축은 콜레스테롤 수치와 GIRK 기능 모두에 높은 콜레스테롤 식이요법의 영향을 해결하는 데 사용되는 아토르바스타틴 치료의 효과를 역전시켰다38. 다른 연구에서는, 우리는 제노푸스 난모세포와 HEK293 세포41을모두 사용하여 내적으로 정류칼륨 채널 Kir2.1의 콜레스테롤 감도에 돌연변이의 효력을 조사했습니다. 다시, 채널의 감도에 대한 돌연변이의 효과는 두 시스템에서 유사하였다.
분자에 높은 콜레스테롤 수치의 영향을 결정 하기 위한 두 농축 방법의 응용 프로그램, 세포, 그리고 장기 기능 은 수많은. 특히, 세포와 조직을 풍부하게 하기 위해 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체의 사용은 그 특이성 때문에 크게 일반적이다. 이러한 접근법의 최근 예로는 HERG 채널 활성화 및 기본 메커니즘에 대한 콜레스테롤의 영향의 측정42,고슴도치 신호전달을촉진하기 위해 스무딩된 G 단백질 결합 수용체를 활성화시키는 발견, 및 줄기 세포 생체역학 및 포막 관련 링커 단백질을 통한 지방형성에서콜레스테롤의 역할의 식별44. 우리 자신의 연구에서, 우리는 MβCD와 포유류 조직 농축을 활용 :콜레스테롤 복합체는 혈관 평활근35, 45,46에서 칼슘의 기본 기능 및 전압 게이트 채널의 약리학적 프로필과 칼슘의 약리학적 프로필에 대한 콜레스테롤 농축의 효과를 연구하기 위해35,45,,46. 다른 연구에서는 콜레스테롤을 가진 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하기 위한 인지질 계 분산 접근법을 사용하여 콜레스테롤 민감도41,,47,,48,,49에서KirK 채널에서 다른 부위의 역할을 결정하고 이들 채널에서 콜레스테롤 결합 부위를 결정할 뿐만 아니라32,50,,51.,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

세포 기능을 연구하는 데 사용되는 제노푸스 난모세포를 포함한 포유류 조직 및 세포의 콜레스테롤 농축은 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 여기서는 이 용도로 사용되는 두 가지 중요한 접근 방식을 설명합니다. 첫째, 우리는 대뇌 동맥을 사용하여 콜레스테롤로 포화 사이클로 덱스트린을 사용하여 콜레스테롤과 조직과 세포를 풍부하게하는 방법을 설명 (조직) 및 해마 뉴런 (세포) 예로. 이 접근법은 모든 유형의 조직, 세포 또는 세포주에 사용될 수 있다. 콜레스테롤 농축을 위한 다른 접근은 저밀도 지단백 (LDL)의 사용을 관련시킵니다. 이 접근법의 장점은 세포의 천연 콜레스테롤 항상성 기계의 일부를 사용한다는 것입니다. 그러나, 사이클로덱스트린 접근법은 콜레스테롤로 관심있는 모든 세포 유형을 풍부하게 하기 위해 적용될 수 있는 반면, LDL 접근법은 LDL 수용체(예를 들어, 간 세포, 혈액 백혈구 및 조직 대식세포와 같은 골수 유래 세포)를 발현하는 세포로 제한되며, 농축 수준은 LDL 수용체의 농도 및 이동성에 달려 있다. 또한, LDL 입자는 다른 지질을 포함, 그래서 콜레스테롤 전달은 비특이적. 둘째, 우리는 콜레스테롤을 포함하는 인지질 계 분산 (즉, 리포솜)을 사용하여 콜레스테롤로 제노푸스 난모세포를 풍부하게하는 방법을 설명합니다. 제노푸스 난모세포는 세포 및 단백질 기능을 연구하는 데 사용되는 인기 있는 이종 발현 시스템을 구성합니다. 포유류 조직의 사이클로덱스트린 기반 콜레스테롤 농축 접근법(대뇌 동맥)과 제노푸스 난모세포의 인지질 기반 콜레스테롤 농축 접근법모두, 우리는 콜레스테롤 수치가 배양 후 최대 5분까지 도달한다는 것을 보여줍니다. 콜레스테롤의 이 수준은 잠복기의 연장된 기간 도중 일정하게 남아 있습니다 (예를 들면, 60 분). 이 데이터는 함께 콜레스테롤 농축의 영향을 심문하는 것을 목표로 하는 기능적 연구를 위해 조직, 세포 및 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 농축을 위한 최적화된 시간적 조건에 대한 기초를 제공합니다.

콜레스테롤조직과 콜레스테롤을 가진 세포를 풍부하게 하기 위한 수단으로 콜레스테롤포화 사이클로덱스트린의 사용은 잘 확립되어 있습니다. 여기에서, 우리는 먼저 콜레스테롤포화MβCD를 사용하여 콜레스테롤을 가진 쥐 대뇌 동맥을 풍부하게 하기 위한 이 널리 이용되는 접근의 응용을 보여줍니다. 도 1A는 이미지화된 대뇌 동맥 평?...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

콜레스테롤 농축의 두 가지 방법이 제시된다 : 포유류 조직과 세포를 풍부하게하기 위해 콜레스테롤포화 사이클로 덱스트린의 응용 프로그램, 그리고 콜레스테롤 농축 인지질 기반 분산의 사용 (리포좀) 제노푸스 oocytes을 풍부하게. 이 방법은 분자에 높은 콜레스테롤 수치의 영향을 결정 하기 위한 도구, 세포, 그리고 장기 기능.

포유류 조직과 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 우세포의 농축

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

높은 콜레스테롤은 심혈관 및 신경 퇴행성 질환의 주요 위험 요소입니다. 우리의 프로토콜은 콜레스테롤 혈증의 생리적 및 기계성 결과를 연구하기위한 귀중한 도구를 제공합니다. 이러한 절차는 기본 실험실 장비를 사용하여 수행 할 수 있으며 세포, 조직 및 제노푸스 난모세포에 적용됩니다.콜레스테롤은 몸 전체에 세포 막의 주요 구성 요소. 이 기술은 어떤 세포 모형에 있는 콜레스테롤의 높은 수준의 충격을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 동맥을 해부하는 것이 가장 어려운 단계입니다.조심스럽게 혈관 조직을 스트레칭하거나 손상시키지 않고 뇌에서 동맥을 제거하십시오. 지질은 매우 섬세하며, 그들과 함께 일하는 것은 과학보다 예술에 가중됩니다. 비디오 데모는 지질을 신중하게 처리하는 방법을 배우기 위한 가이드를 제공합니다.콜레스테롤 포화 메틸 베타-사이클로덱스트린 용액을 준비하려면 먼저 064그램의 메틸 베타-사이클로덱스트린을 PBS 의 10 밀리리터에 추가하여 메틸 베타-사이클로덱스트린이 완전히 용해되도록 합니다. 다음으로, 플라스크에 0024 그램의 콜레스테롤 파우더를 넣고 주걱을 사용하여 가능한 한 많은 콜레스테롤 덩어리를 분해하여 용액을 적극적으로 저어줍니다. 거의 모든 콜레스테롤이 용해되었을 때, 파라핀 필름의 적어도 두 층플라스크를 밀봉.그리고 하룻밤 사이에 섭씨 37도의 수탕에서 분당 약 30 진동으로 플라스크를 흔들어 주세요. 8 내지 16시간 후에, 22 마이크로미터 polyethersulfone 주사기 필터를 통해 혼합물을 동급 병으로 필터링하기 전에 실온에 용액을 식힙니다. 포유류 대뇌 동맥 농축을 위해, 250에서 300 그램 Sprague Dawley 쥐에서 얼음에 PBS의 비커로 뇌를 수확, 왁스 해부 그릇에 뇌를 전송하기 전에, 해부 현미경 아래, 조직을 침수하기에 충분한 PBS를 포함.2~3개의 핀으로 뇌를 확보하여 혈관을 관통하지 않도록 하십시오. 그리고 날카로운 집게와 작은 수술 가위를 사용하여 뇌의 기지에서 윌리스의 원을 형성하는 대뇌 동맥과 가지를 부드럽게 해부합니다. 다음으로, PBS에서 1센티미터 길이의 동맥 세그먼트까지 간략하게 헹구고, 조직을 커버하기에 충분한 콜레스테롤 농축 용액에 헹구는 세그먼트를 배양합니다.콜레스테롤 수치의 변화를 확인하려면 신선한 필리핀 분말 병을 사용하여 디메틸 설프리산화물의 염료의 밀리리터 스톡 용액당 10밀리그램을 준비하고, 콜레스테롤이 풍부한 조직을 신선한 PBS에서 35분간 세척하여 세척합니다. 마지막 세척 후, 실내 온도에서 10 분 동안 PBS에서 5 %트리톤에서 샘플을 투과화하기 전에, 빛으로부터 보호, 얼음에 4 %파라 포름 알데히드에 4 %의 para포름알데히드에 동맥 세그먼트를 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 셰이커에 PBS에서 35분 세척으로 티슈를 세척한 후 실온에서 1시간 동안 실온에서 1시간 동안 필리핀 염료 용액의 밀리리터 최종 농도당 25마이크로그램에 샘플을 추가합니다.인큐베이션이 끝나면 동맥 조각을 세 번 씻고 증류수로 짧은 헹구는 것입니다. 마지막 세척 후, 실험실 조직을 사용하여 여분의 액체를 흡수하고 적절한 장착 매체를 사용하여 동맥을 슬라이드에 장착하십시오. 조심스럽게 커버 슬립으로 동맥을 덮고 조직의 롤링 또는 비틀림을 피하기 위해 주의를 기울이고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 24 시간 동안 슬라이드를 건조시키십시오.마운팅 매체가 건조하면 뚜껑 슬립 엣지를 명확한 매니큐어로 밀봉하고 폴란드어가 10-15분 동안 건조할 수 있도록 합니다. 이어서, 340 내지 380 나노미터의 자궁내포를 가진 조직을 이미지화하고, 385 내지 470 나노미터의 방출을 한다. 인지질 기반 분산을 준비하려면 밀리리터 클로로폼 용해 지질 용액 당 10 밀리그램의 200 마이크로리터, L-알파-인파디에틸레타놀라민, 1-팔미토일-2-올레오일-글리페로-3-인포콜린, 콜레스테롤 을 12밀리리터 에 결합한다.질소 스트림 아래 후드에서 클로로폼을 증발시키고, 완충된 150밀리머 칼륨과 10 밀리머 트리헤페스 용액의 800 마이크로리터에서 지질을 중단한다. 그런 다음 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하고, 유백색 혼합물이 형성될 때까지 80킬로헤르츠에서 튜브 내용을 10분 동안 부드럽게 초음파 처리합니다. 제노푸스 의 콜레스테롤 농축을 위해 날카로운 집게를 사용하여 여러 지역의 여성 제노푸스 라리비 개구리의 난소 낭을 방해하고 난소 덩어리를 콜라게나아제 밀리리터 당 5 밀리그램으로 보충한 칼슘 프리 ND96 5밀리리터가 있는 60mm 플레이트에 넣습니다.실온에서 15분 동안 분당 60진동으로 궤도 셰이커에 티슈를 흔들어 주세요. 인큐베이션이 끝나면 넓은 팁이 있는 이송 파이펫을 사용하여 용액을 5~10회 파이펫하여 개별 난소동을 분리하고, 용액이 투명해질 때까지 신선한 칼슘 프리 ND96으로 다크 오사이클용액을 빠르게 헹구는다. 다음으로, 콜레스테롤 농축 인지질 기반 분산의 90 마이크로리터를 96웰 플레이트의 한 웰로 옮기고, 가능한 한 적은 배지로 최대 6개의 난초를 첨가한다.96 웰 플레이트를 3차원 플랫폼 회전기위에 5~10분간 놓습니다. 그런 다음 ND96 한 방울을 우물에 추가하고 콜레스테롤 농축 난모세포를 즉각적인 분석을 위해 ND96을 포함하는 35mm 플레이트로 옮깁니다. 여기서, 이미지화된 대뇌 동맥 의 예평근육층은 콜레스테롤 농도가 증가함에 따라 조직 농축시 얻어진 필리핀 관련 형광의 농도 의존성 증가를 보여준다.특히 메틸 베타-사이클로덱스트린 콜레스테롤 복합체로 치료한 후 3시간 후 콜레스테롤 수치가 농축 직후 의 수준에 비해 약 50% 감소했습니다. 1시간 의 배양 시간은 일반적으로 이 접근법 도중 콜레스테롤을 가진 조직 그리고 세포를 풍부하게 하기 위하여 이용되는 동안, 잠복의 5 분은 콜레스테롤 산화제 기지를 둔 생화학분석에 의해 결정된 대로 뇌동맥 콜레스테롤 콘텐츠에 있는 통계적으로 유의한 증가를 달성하기에 충분합니다. 콜레스테롤이 부족한 조절인 인지질 기반 분산으로 농축된 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 수치에서 유의한 변화가 관찰되지 는 않지만, 콜레스테롤을 포함하는 인지질 계 분산으로 5분 만에 콜레스테롤 수치가 크게 증가하고, 잠복시간이 60분으로 증가하면 이 수준으로 유지된다.세포를 풍부하게 하기 위한 사이클로덱스트린 기반 접근법의 효과는 또한 해마의 CA1 영역에서 갓 분리된 뉴런에서 입증된다. 실제로, 메틸 베타-사이클로덱스트린에 있는 뉴런의 잠복은 60분 동안 콜레스테롤로 포화되어, 필리핀 관련 형광에 의해 평가된 바와 같이 콜레스테롤 수치가 2배 이상 증가합니다. 전반적으로, 이 절차에 대한 두 가지 가장 중요한 단계는 콜레스테롤 농축 혼합물을 준비하고 동맥 조직의 무결성을 보장하는 것입니다.콜레스테롤 농축 에 이어, 하나는 콜레스테롤 혈 증에 의해 영향을 받는 단백질의 기능을 공부할 수 있습니다. 콜레스테롤을 가진 세포를 풍요롭게 하는 기능은 심근세포와 뉴런에 있는 높은 콜레스테롤 수치의 연구 결과 촉진했습니다. 난모 세포의 사용은 콜레스테롤이 이온 채널에 결합하는 방법을 조사 할 수 있었습니다.실험실 코트와 장갑그녀는 항상이 프로토콜을 위해 착용할 수 있습니다. 클로로폼과 파라포름알데히드는 연기 후드 아래에 사용되어야 하며 유해 폐기물로 버려야 합니다.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...