Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en Scientist Development Grant (11SDG5190025) fra American Heart Association (til A.R.-D.), og av National Institute of Health R01 gir AA-023764 (til A.N.B.), og HL-104631 og R37 AA-11560 (til A.M.D).

Alle eksperimentelle prosedyrer med dyr ble utført ved University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Omsorg for dyr og eksperimentelle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee of the UTHSC, som er en institusjon akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. Berikelse av vev og celler ved hjelp av metyl-β-cykloderkstrin mettet med kolesterol
MERK: Kolesterolberikelsesp...

Metoder for å berike pattedyrvev og celler og Xenopus oocytter med kolesterol utgjør et kraftig verktøy for å undersøke effekten av forhøyede kolesterolnivåer på individuelle molekylære arter, på komplekse makromolekylære systemer (f.eks proteiner), og på cellulær og organfunksjon. I denne artikkelen har vi beskrevet to komplementære tilnærminger som letter slike studier. Først beskrev vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av MβCD mettet med kolesterol. Vi viste at i cerebr...

Kolesterol, en stor cellulær lipid, spiller mange kritiske funksjonelle og strukturelle roller1,2,3,4,5,6,7,8,9. Fra å regulere plasmamembranens fysiske egenskaper til å sikre cellelevedyktighet, vekst, spredning og fungerer som et signal- og forløpermolekyl i en mengde biokjemiske veier, er kolesterol en viktig komponent som er nødvendig for normal celle- og organfunksjon. Som et resultat resulterer kolesterolmangel i alvorlige fysiske misdannelser og en rekke lidelser. På den annen side er selv en liten økning i kolesterol over fysiologiske nivåer (2-3x) cytotoksisk1,2,10 og har vært forbundet med utvikling av lidelser, inkludertkardiovaskulære 11,12,13 og nevrodegenerative sykdommer14,15,16,17. Dermed, for å avhøre de kritiske funksjonene til kolesterol og for å bestemme effekten av endringer i kolesterolnivåer, er forskjellige tilnærminger som endrer innholdet av kolesterol i vev, celler og Xenopus oocytter utviklet.
Endring av kolesterolnivåer i pattedyrvev og celler Flere tilnærminger kan utnyttes for å redusere nivåene av kolesterol i vev og celler18. En tilnærming innebærer deres eksponering for statiner oppløst i lipoprotein-mangelfull serum for å hemme HMG-CoA reduktase, som styrer frekvensen av kolesterolsyntese19,20. Men, disse kolesterolsenkende legemidler også hemme dannelsen av ikke-sterol produkter langs mevalonatbanen. Derfor legges en liten mengde mevalonat for å tillate dannelsen av disse produktene21 og forbedre spesifisiteten til denne tilnærmingen. En annen tilnærming for å redusere kolesterolnivået innebærer bruk av β-cyclodextrins. Disse glucopyranose monomerene har et internt hydrofobt hulrom med en diameter som samsvarer med størrelsen på steroler22, noe som letter utvinning av kolesterol fra celler, og dermed tømme dem fra deres innfødte kolesterolinnhold23. Et eksempel er 2-hydroksypropyl-β-cykloderxtrin (HPβCD), et preklinisk stoff som for tiden testes for behandling av Niemann-Pick type C-sykdommen, en genetisk arvelig dødelig metabolsk lidelse preget av lysosomal kolesterollagring24. Nivået av kolesteroluttømming avhenger av det spesifikke derivatet som brukes. For eksempel, HPβCD trekker kolesterol med en lavere kapasitet enn metylert derivat, metyl-β-cyclodextrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Spesielt kan imidlertid β-cyklodekkliner også trekke ut andre hydrofobe molekyler i tillegg til kolesterol, noe som deretter kan resultere i uspesifikke effekter31. I motsetning til uttømming kan celler og vev spesifikt berikes med kolesterol gjennom behandling med β-cykloderklatrin som har vært forutmettet med kolesterol23. Denne tilnærmingen kan også brukes som en kontroll for spesifisiteten av β-cyclodextrins som brukes til kolesterol uttømming31. Uttømming av kolesterol fra vev og celler er grei og kan oppnås ved å utsette cellene i 30-60 min til 5 mM MβCD oppløst i mediet som brukes til lagring av cellene. Denne tilnærmingen kan resultere i en 50% reduksjon i kolesterolinnhold (f.eks. i hippocampale nevroner32, rotte cerebralarterier33). På den annen side er det mer komplisert å forberede β-cyclodextrin-kolesterolkomplekset for kolesterolberikelse av vev og celler, og vil bli beskrevet i protokollseksjonen.
En alternativ tilnærming til berikende vev og celler ved hjelp av β-cyclodextrin mettet med kolesterol innebærer bruk av LDL, som er avhengig av LDL reseptorer uttrykt i vev / celler18. Mens denne tilnærmingen gir fordelen av å bruke det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen, har den flere begrensninger. For det første kan ikke vev og celler som ikke uttrykker LDL-reseptoren berikes ved hjelp av denne tilnærmingen. For det andre inneholder LDL-partikler andre lipider i tillegg til kolesterol. Spesielt består LDL av proteinet ApoB100 (25 %) og følgende lipider (75%): ~ 6-8% kolesterol, ~ 45-50% cholesteryl ester, ~ 18-24% fosfolipider, og ~ 4-8% triacylglycerols34. Dermed er levering av kolesterol via LDL-partikler ikke-spesifikk. For det tredje kan prosentandelen av økning i kolesterolinnhold ved LDL i vev og celler som uttrykker LDL-reseptoren være betydelig lavere enn økningen observert ved hjelp av cyklodekstrin mettet med kolesterol. For eksempel, i en tidligere studie, berikelse av gnager cerebral arterier med kolesterol via LDL resulterte i bare en 10-15% økning i kolesterolnivåer35. I motsetning resulterte berikelse av disse arteriene med cyclodextrin mettet med kolesterol som beskrevet i protokollseksjonen,& gt; 50% økning i kolesterolinnholdet (se Representative Results seksjon, figur 1).
Endring av kolesterolnivåer i Xenopus oocytes Xenopus oocytes utgjør et heterologøst uttrykksystem som vanligvis brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. Tidligere studier har vist at kolesterolet til fosfolipid molar forholdet i Xenopus oocytes er 0,5 ± 0,136. På grunn av dette iboende høye nivået av kolesterol, er det utfordrende å øke innholdet av kolesterol i dette systemet, men kan oppnås ved hjelp av dispersjoner laget av membranfolipider og kolesterol. Fosfolipidene som vi har valgt for dette formålet, ligner på de som brukes til å danne kunstige planar lipidbilag og inkluderer L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrevet i protokollseksjonen. Denne tilnærmingen kan resultere i > 50% økning i kolesterolinnhold (Se Representative Results seksjon, Figur 2).
En alternativ tilnærming til berikende Xenopus oocytes med fosfolipid-baserte dispersjoner innebærer bruk av cyklodextrin mettet med kolesterol, som ligner på måten vev og celler er beriket. Vi har imidlertid funnet denne tilnærmingen til å være av lav reproduserbarhet og effektivitet, med et gjennomsnitt på ~ 25% økning i kolesterolinnhold. Dette skyldes muligens den ulike lastekapasiteten til disse to tilnærmingene (se avsnittet Representative Results, figur 3). I motsetning har det blitt vist at bruk av cyklodekstrin for å tømme kolesterol fra Xenopus oocytter kan resultere i en ~ 40% reduksjon i kolesterolinnhold36.
Her fokuserer vi på kolesterol berikelse av pattedyrvev og celler gjennom bruk av cyklodxtrin mettet med kolesterol, og av Xenopus oocytter ved hjelp av liposomer. Begge tilnærminger kan utnyttes for å avgrense effekten av økte nivåer av kolesterol på proteinfunksjon. Mekanismene for kolesterolmodulering av proteinfunksjon kan innebære direkte interaksjoner8 og/eller indirekte effekter9. Når kolesterol påvirker proteinfunksjon via direkte interaksjoner, er effekten av en økning i kolesterolnivået på proteinaktivitet sannsynligvis uavhengig av celletype, uttrykkssystem eller berikelsestilnærming. For eksempel brukte vi disse to tilnærmingene for å bestemme effekten av kolesterol på G-protein gated innover rette kalium (GIRK) kanaler uttrykt i atriemyocytter37, hippocampal nevroner32,38, HEK29339 celler, og Xenopus oocytes32,37. Resultatene oppnådd i disse studiene var konsistente: i alle tre typer pattedyrceller og i amfibier oocytes kolesterol upregulated GIRK kanalfunksjon (se Representative Resultater seksjon, Figur 4,for hippocampal nevroner og tilsvarende eksperimenter i Xenopus oocytes). Videre var observasjonene gjort i disse studiene også i samsvar med resultatene av studier utført i atriemyocytter37,40 og hippocampal nevroner32,38 nylig isolert fra dyr utsatt for et høyt kolesterol diett40. Spesielt, kolesterol berikelse av hippocampal nevroner ved hjelp av MβCD reversert effekten av atorvastatin terapi som brukes for å løse virkningen av høyt kolesterol diett både på kolesterolnivåer og GIRK funksjon38. I andre studier undersøkte vi effekten av mutasjoner på kolesterolfølsomheten til den indre korrigering av kaliumkanalen Kir2.1 ved hjelp av både Xenopus oocytes og HEK293 celler41. Igjen var effekten av mutasjonene på følsomheten til kanalen lik i de to systemene.
Anvendelsene av begge berikelsesmetoder for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer på molekylær, cellulær og organfunksjon er mange. Spesielt er bruk av cyclodextrin-kolesterolkomplekser for å berike celler og vev svært vanlig i stor grad på grunn av spesifisiteten. Nylige eksempler på denne tilnærmingen inkluderer bestemmelse av virkningen av kolesterol på HERG kanalaktivering og underliggende mekanismer42, oppdagelsen av at kolesterol aktiverer G protein koblet reseptor Glattet for å fremme Hedgehog signaliserer43, og identifisering av rollen av kolesterol i stamcelle biomekanikk og adipogenese gjennom membran-assosiert linker proteiner44. I vårt eget arbeid benyttet vi pattedyrvevberikelse med MβCD:kolesterolkompleks for å studere effekten av kolesterolberikelse på grunnleggende funksjon og den farmakologiske profilen til kalsium- og spenningsinngjerdede kanaler med stor ledningsevne (BK, MaxiK) i vaskulær glatt muskel35,45,46. I andre studier brukte vi fosfolipidbasert dispersjonstilnærming for berikende Xenopus oocytter med kolesterol for å bestemme rollene til forskjellige regioner i Kir2.1 og GIRK kanaler i kolesterol følsomhet41,47,48,49, samt å bestemme antatt kolesterol bindende steder i disse kanalene32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

Kolesterol berikelse av pattedyr vev og celler, inkludert Xenopus oocytes som brukes til å studere cellefunksjon, kan oppnås ved hjelp av en rekke metoder. Her beskriver vi to viktige tilnærminger som brukes til dette formålet. Først beskriver vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av cyclodextrin mettet med kolesterol ved hjelp av cerebralarterier (vev) og hippocampal nevroner (celler) som eksempler. Denne tilnærmingen kan brukes til alle typer vev, celler eller cellelinjer. En alternativ tilnærming for kolesterol berikelse innebærer bruk av lav tetthet lipoprotein (LDL). Fordelen med denne tilnærmingen er at den bruker en del av det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen. Men mens cyclodextrin tilnærming kan brukes til å berike noen celletype interesse med kolesterol, er LDL-tilnærmingen begrenset til celler som uttrykker LDL-reseptorer (f.eks. leverceller, benmargsavledede celler som blodleukocytter og vevmakrofager), og nivået av berikelse avhenger av konsentrasjonen og mobiliteten til LDL-reseptoren. Videre inkluderer LDL-partikler andre lipider, så kolesterollevering er ikke spesifikk. For det andre beskriver vi hvordan du beriker Xenopus oocytes med kolesterol ved hjelp av en fosfolipidbasert dispersjon (dvs. liposomer) som inkluderer kolesterol. Xenopus oocytes utgjør et populært heterologøst uttrykksystem som brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. For både cyklodekstrin-basert kolesterolberikelse tilnærming av pattedyrvev (cerebral arterier) og for fosfolipid-basert kolesterol berikelse tilnærming av Xenopus oocytes, viser vi at kolesterol nivåer nå maksimalt etter 5 min inkubasjon. Dette nivået av kolesterol forblir konstant i lengre perioder med inkubasjon (f.eks. 60 min). Sammen gir disse dataene grunnlag for optimaliserte temporale forhold for kolesterolberikelse av vev, celler og Xenopus oocytter for funksjonelle studier som tar sikte på å avhøre virkningen av kolesterolberikelse.

Bruken av cyclodextrin mettet med kolesterol som et middel for berikende vev og celler med kolesterol er godt etablert. Her demonstrerer vi først anvendelsen av denne mye brukte tilnærmingen for å berike rottecerebralarterier med kolesterol ved hjelp av MβCD mettet med kolesterol. Figur 1A viser et eksempel på et avbildet cerebral arterie glatt muskellag og demonstrerer den konsentrasjonsavhengige økningen i filipin-assosiert fluorescen...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

To metoder for kolesterol berikelse presenteres: anvendelsen av cyklodextrin mettet med kolesterol for å berike pattedyr vev og celler, og bruk av kolesterolberiket fosfolipid-baserte dispersjoner (liposomer) for å berike Xenopus oocytes. Disse metodene er instrumentelle for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer i molekylær, cellulær og organfunksjon.

Berikelse av pattedyrvev og Xenopus oocytter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Forhøyet kolesterol er en viktig risikofaktor for kardiovaskulær og nevrodegenerativ sykdom. Våre protokoller gir verdifulle verktøy for å studere både fysiologiske og mekanistiske konsekvenser av hyperkolesterolemi. Disse prosedyrene kan utføres ved hjelp av grunnleggende laboratorieutstyr, og gjelder for celler, vev og Xenopus oocytes.Kolesterol er en viktig komponent i cellulære membraner i hele kroppen. Disse teknikkene kan benyttes til å studere virkningen av forhøyede nivåer av kolesterol i enhver celletype. Dissekere arteriene er det vanskeligste trinnet.Fjern forsiktig arterien fra hjernen, uten å strekke eller skade vaskulært vev. Lipider er veldig delikate, og å jobbe med dem er mer av en kunst enn en vitenskap. Videodemonstrasjon gir en veiledning for å lære å håndtere lipider nøye.For å forberede kolesterolet mettet metyl-beta-cyclodextrin løsning, først legge til 064 gram metyl-beta-cyclodextrin til 10 milliliter PBS, rør løsningen med en røre bar, for å sikre at methyl-beta-cyclodextrin oppløses fullt ut. Deretter legger du til 0024 gram kolesterolpulver til kolben, og rør løsningen kraftig, ved hjelp av en slikkepott for å bryte opp så mange kolesterolbiter som mulig. Når nesten alt kolesterolet er oppløst, forsegle kolben med minst to lag parafinfilm.Og rist kolben på ca 30 svingninger per minutt i et 37 graders Celsius vannbad over natten. Etter åtte til 16 timer avkjøles oppløsningen til romtemperatur, før du filtrerer blandingen gjennom et 22 mikrometerpolyeterpolyetersulfonsprøytefilter i en klasseflaske. For pattedyr cerebral arterie berikelse, høst hjernen fra en 250 til 300 gram Sprague Dawley rotte inn i et beger av PBS på is, før du overfører hjernen til en vokset disseksjon bolle, under et dissekere mikroskop, som inneholder akkurat nok PBS til å senke vevet.Sikre hjernen med to til tre pinner, og pass på at de ikke trenger inn i blodårene. Og bruk skarpe tang og liten kirurgisk saks for å forsiktig dissekere hjernearteriene og deres grener som danner Circle of Willis ved foten av hjernen. Deretter skyller du opptil en centimeter lange arteriesegmenter i PBS, før du inkuberer de skyllede segmentene i nok kolesterolberikende løsning for å dekke vevet.For å bestemme eventuelle endringer i kolesterolnivået, bruk en ny flaske filippinsk pulver for å forberede en 10 mg per milliliter lagerløsning av fargestoffet i dimetylsulfoksid, og vask kolesterolberiket vev med tre fem minutters vasker i friske PBS. Etter siste vask, fest arteriesegmentene i 4% paraformaldehyd i 15 minutter på is, beskyttet mot lys, før de gjennomsyrer prøvene i 5% Triton i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vasker vevet med tre fem minutters vasker i PBS på en shaker, før du legger prøvene til et 25 mikrogram per milliliter endelig konsentrasjon av filipinfargeløsning, i en time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen vasker du arteriebitene tre ganger som demonstrert, etterfulgt av en kort skyll med destillert vann. Etter siste vask, bruk et laboratorievev for å absorbere overflødig væske, og monter arteriene på et lysbilde ved hjelp av et passende monteringsmedium. Dekk forsiktig arteriene med en dekselslipp, vær forsiktig for å unngå å rulle eller vri vevet, og la lysbildet tørke i 24 timer ved romtemperatur, beskyttet mot lys.Når monteringsmediet er tørt, forsegler du dekselets sklikanter med klar neglelakk, og la polishen tørke i 10 til 15 minutter. Deretter kan du se for deg vevet med en eksitasjon på 340 til 380 nanometer, og et utslipp på 385 til 470 nanometer. For å forberede fosfolipidbasert dispersjon, kombiner 200 mikroliter på 10 mg per milliliter kloroform oppløst lipidløsning, L-alfa-fosfosyletanolamin, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfolkolin og kolesterol i et 12 milliliter glassrør.Fordampe kloroformen i hetten under en strøm av nitrogen, før du suspenderer lipidene i 800 mikroliter bufret 150 millimolar kaliumklorid og 10 millimolar Tris HEPES-løsning. Forsegle deretter røret med parafinfilm, og soniker forsiktig rørinnholdet på 80 kilohertz i 10 minutter, til en melkeaktig blanding dannes. For kolesterolberikelse av Xenopus oocytes, bruk skarpe tang for å forstyrre eggstokksekken fra en kvinnelig Xenopus laevis frosk i flere regioner, og legg eggstokkbitene i en 60 millimeter plate med fem milliliter kalsiumfri ND96 supplert med 5 milligram per milliliter kollagennase.Rist vevet på en orbital shaker ved 60 svingninger per minutt i 15 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, bruk en overføringpipette med en bred spiss for å kraftig pipette oocyte som inneholder løsningen fem til 10 ganger for å isolere de enkelte oocytes, og skyll raskt den mørke oocyteløsningen med fersk kalsiumfri ND96 til løsningen blir gjennomsiktig. Deretter overfører du 90 mikroliter av kolesterolberiket fosfolipdbasert dispersjon til en brønn av en 96-brønnplate, og legger til opptil seks oocytter til brønnen med så lite medium som mulig.Plasser 96-brønnplaten på en tredimensjonal plattformrotator i fem til ti minutter. Legg deretter til en dråpe ND96 til brønnen, og overfør kolesterolberikede oocytter til en 35 millimeter plate som inneholder ND96 for deres umiddelbare analyse. Her viser et eksempel på en avbildet cerebral arterie glatt muskellag den konsentrasjonsavhengige økningen i filipin assosiert fluorescens oppnådd ved vevsberikelse med økende konsentrasjoner av kolesterol.Spesielt tre timer etter behandlingen med metyl-beta-cyclodextrin kolesterol kompleks kolesterolnivået redusert med ca 50%sammenlignet med deres nivå umiddelbart etter berikelsen. Mens en time inkubasjonstid ofte brukes til å berike vev og celler med kolesterol under denne tilnærmingen, er fem minutter inkubasjon vanligvis tilstrekkelig til å oppnå en statistisk signifikant økning i cerebral arterielt kolesterolinnhold som bestemmes av kolesteroloksidasebasert biokjemisk analyse. Mens ingen signifikant endring observeres i kolesterolnivåer i Xenopus oocytes beriket med kontroll fosfolipd baserte dispersjoner mangler kolesterol, kolesterolnivået øker betydelig etter bare fem minutters behandling med fosfolippid baserte dispersjoner som inkluderer kolesterol, og forblir på dette nivået når inkubasjonstiden økes til 60 minutter.Effektiviteten av cyclodextrin basert tilnærming for berikende celler er også demonstrert i nevroner ferskt isolert fra CA1-regionen i hippocampus. Faktisk resulterer inkubasjon av nevronene i metyl-beta-cyclodextrin mettet med kolesterol i 60 minutter i en over to ganger økning i kolesterolnivåer, som vurdert av filipin assosiert fluorescens. Samlet sett forbereder de to viktigste trinnene for disse prosedyrene kolesterolberikelseblandingen og sikrer integriteten til arterielt vev.Etter kolesterolberikelse kan man studere funksjonen til proteinene som påvirkes av hyperkolesterolemi. Evnen til å berike celler med kolesterol tilrettelagt studiet av forhøyede kolesterolnivåer i kardiomyocytter og nevroner. Bruken av oocytes tillot oss å undersøke hvordan kolesterol binder seg til ionkanaler.En lab frakk og hansker hun alltid brukes for denne protokollen. Kloroform og paraformaldehyd skal brukes under en røykhette og kastes som farlig avfall.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spenningsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjelp av fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anriking av vaskemiddel-uløselig Protein aggregater fra Postmortem hjernen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vev beiset med selvlysende konjugert Oligothiophenes av hyperspektral AC Confocal mikroskopi og fluorescens levetid bildebehandling

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifisering av koenzym A i celler og vev

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...