Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por um Fundo de Desenvolvimento de Cientistas (11SDG5190025) da American Heart Association (para A.R.-D.), e pelo National Institute of Health R01 concede AA-023764 (para A.N.B.), e HL-104631 e R37 AA-11560 (para A.M.D.).

Todos os procedimentos experimentais com animais foram realizados no Centro de Ciênciada da Saúde da Universidade do Tennessee (UTHSC). O cuidado com os animais e os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal da UTHSC, instituição credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais de Laboratório Internacional.
1. Enriquecimento de tecidos e células utilizando metil-β-ciclodextrina saturada com colesterol...

Métodos para enriquecer tecidos e células de mamíferos e oócitos xenopus com colesterol constituem uma poderosa ferramenta para investigar o efeito de níveis elevados de colesterol em espécies moleculares individuais, em sistemas macromoleculares complexos (por exemplo, proteínas), e na função celular e de órgãos. Neste artigo, descrevemos duas abordagens complementares que facilitam tais estudos. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando MβCD saturado com coleste...

O colesterol, um dos principais lipídios celulares, desempenha numerosos papéis funcionais e estruturais críticos1,,2,,3,4,5,,66,7,,8,9. Desde a regulação das propriedades físicas da membrana plasmática até a garantia da viabilidade celular, crescimento, proliferação e servindo como uma molécula de sinalização e precursora em uma infinidade de vias bioquímicas, o colesterol é um componente imperativo necessário para a função normal de células e órgãos. Como resultado, a deficiência de colesterol resulta em malformações físicas graves e uma variedade de distúrbios. Por outro lado, mesmo um pequeno aumento do colesterol acima dos níveis fisiológicos (2-3x) é citotóxico1,2,10 e tem sido associado ao desenvolvimento de distúrbios, incluindo doenças cardiovasculares11,,12,,13 e neurodegenerativas14,,15,16,17. Assim, para interrogar as funções críticas do colesterol e determinar o efeito das mudanças nos níveis de colesterol, foram desenvolvidas diferentes abordagens que alteram o conteúdo do colesterol em tecidos, células e oócitos xenopus.
Alteração dos níveis de colesterol em tecidos e células de mamíferos Várias abordagens podem ser aproveitadas para diminuir os níveis de colesterol nos tecidos e células18. Uma abordagem envolve sua exposição a estatinas dissolvidas no soro lipoproteína-deficiente para inibir a redução do HMG-CoA, que controla a taxa de síntese de colesterol19,20. No entanto, essas drogas que reduzem o colesterol também inibem a formação de produtos não-esterol ao longo do caminho mevalonato. Portanto, uma pequena quantidade de mevalonato é adicionada para permitir a formação desses produtos21 e aumentar a especificidade dessa abordagem. Outra abordagem para a diminuição dos níveis de colesterol envolve o uso de β-ciclodextrinas. Estes monômeros glucopyranose possuem uma cavidade hidrofóbica interna com diâmetro que corresponde ao tamanho dos esteróis22, o que facilita a extração de colesterol das células, esgotando-os de seu teor de colesterol nativo23. Um exemplo é a 2-hidroxipropipil-β-ciclodextrina (HPβCD), uma droga pré-clínica atualmente sendo testada para o tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C, uma desordem metabólica fatal geneticamente herdada caracterizada pelo armazenamento de colesterol lysossomal24. O nível de esgotamento do colesterol depende do derivado específico utilizado. Por exemplo, o HPβCD extrai colesterol com uma capacidade menor do que o derivado metilado, metil-β-ciclodextrina (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Notavelmente, no entanto, β-ciclodextrinas também podem extrair outras moléculas hidrofóbicas além do colesterol, o que pode resultar em efeitos inespecíficos31. Em contraste com o esgotamento, as células e tecidos podem ser especificamente enriquecidos com colesterol através do tratamento com β-ciclodextrina que foi pré-saturada com colesterol23. Esta abordagem também pode ser usada como um controle para a especificidade das β-ciclodextrinas utilizadas para o esgotamento do colesterol31. O esgotamento do colesterol de tecidos e células é simples e pode ser alcançado expondo as células de 30-60 min a 5 mM MβCD dissolvido no meio usado para armazenar as células. Essa abordagem pode resultar em uma redução de 50% no teor de colesterol (por exemplo, em neurônios hipocampais32, artérias cerebrais de ratos33). Por outro lado, preparar o complexo β-ciclodextrina-colesterol para o enriquecimento de colesterol de tecidos e células é mais complexo, e será descrito na seção de protocolo.
Uma abordagem alternativa para enriquecer tecidos e células que utilizam β-ciclodextrina saturada com colesterol envolve o uso de LDL, que se baseia em receptores LDL expressos nos tecidos/células18. Embora essa abordagem ofereça a vantagem de usar o maquinário de homeostase de colesterol natural da célula, ele tem várias limitações. Em primeiro lugar, tecidos e células que não expressam o receptor LDL não podem ser enriquecidos usando esta abordagem. Em segundo lugar, as partículas de LDL contêm outros lipídios, além do colesterol. Especificamente, o LDL é composto pela proteína ApoB100 (25%) e os seguintes lipídios (75%): ~6-8% colesterol, ~45-50% éster de cholesteryl, ~18-24% fosfolipídios e ~4-8% triacilglicerols34. Assim, a entrega de colesterol através de partículas LDL é inespecífica. Em terceiro lugar, o percentual de aumento do teor de colesterol por LDL em tecidos e células que expressam o receptor LDL pode ser significativamente menor do que o aumento observado usando ciclodextrina saturada de colesterol. Por exemplo, em um estudo anterior, o enriquecimento de artérias cerebrais de roedores com colesterol via LDL resultou em apenas um aumento de 10-15% nos níveis de colesterol35. Em contrapartida, o enriquecimento dessas artérias com ciclodextrina saturada com colesterol conforme descrito na seção de protocolo resultou em aumento de >50% no teor de colesterol (Ver Seção Resultados Representativos, Figura 1).
Alteração dos níveis de colesterol nos oócitos xenopus Os oócitos de xenopus constituem um sistema de expressão heterólogo comumente usado para estudar a função celular e proteica. Estudos anteriores mostraram que a razão do colesterol para o molar fosfolipídeo nos oócitos xenopus é de 0,5 ± 0,136. Devido a esse alto nível intrínseco de colesterol, o aumento do teor de colesterol neste sistema é desafiador, mas pode ser alcançado usando dispersões feitas de fosfolipídeos de membrana e colesterol. Os fosfolipídios que escolhemos para este fim são semelhantes aos utilizados para formar bicamadas lipídicas planares artificiais e incluem L-α-fosphatidyletanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), conforme descrito na seção de protocolo. Essa abordagem pode resultar em >50% de aumento no teor de colesterol (Ver seção Resultados Representativos, Figura 2).
Uma abordagem alternativa para enriquecer os oócitos xenopus com dispersões à base de fosfolipídeos envolve o uso de ciclodextrina saturada com colesterol, que é semelhante à maneira como tecidos e células são enriquecidos. No entanto, descobrimos que essa abordagem é de baixa reprodutibilidade e eficiência, com um aumento médio de ~25% no teor de colesterol. Isso possivelmente se deve à capacidade de carga diferente dessas duas abordagens (Ver seção Resultados Representativos, Figura 3). Em contraste, foi demonstrado que o uso de ciclodextrina para esgotar o colesterol dos oócitos xenopus pode resultar em uma redução de ~40% no teor de colesterol36.
Aqui, focamos no enriquecimento do colesterol de tecidos e células de mamíferos através da aplicação de ciclodextrina saturada de colesterol, e de oócitos xenopus usando liposomos. Ambas as abordagens podem ser aproveitadas para delinear o efeito do aumento dos níveis de colesterol na função proteica. Os mecanismos de modulação do colesterol da função proteica podem envolver interações diretas8 e/ou efeitos indiretos9. Quando o colesterol afeta a função proteica através de interações diretas, o efeito de um aumento nos níveis de colesterol na atividade proteica é provavelmente independente do tipo celular, sistema de expressão ou abordagem de enriquecimento. Por exemplo, utilizamos essas duas abordagens para determinar o efeito do colesterol nos canais de potássio retificador interiormente (GIRK) da proteína G expressos em miócitos atrial37, neurônios hipocampais32,38, HEK29339 células, e xenopus oócitos32,37. Os resultados obtidos nestes estudos foram consistentes: em todos os três tipos de células mamíferas e em oócitos anfíbios a função de canal girk upregulated (ver seção Resultados Representativos, Figura 4, para neurônios hipocampais e os experimentos correspondentes em oócitos xenopus). Além disso, as observações feitas nesses estudos também foram consistentes com os resultados de estudos realizados em miócitos atrial37,40 e neurônios hipocampais32,38 recém-isolados de animais submetidos a uma dieta de colesterol elevado40. Notavelmente, o enriquecimento do colesterol de neurônios hipocampais usando MβCD reverteu o efeito da terapia atorvastatina usada para lidar com o impacto da dieta de colesterol alto tanto nos níveis de colesterol quanto na função GIRK38. Em outros estudos, investigou-se o efeito das mutações na sensibilidade ao colesterol do canal de potássio kir2.1 retificador interiormente usando tanto os oócitos de Xenopus quanto as células HEK29341. Novamente, o efeito das mutações na sensibilidade do canal foi semelhante nos dois sistemas.
As aplicações de ambos os métodos de enriquecimento para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos são numerosas. Em particular, o uso de complexos ciclodextrina-colesterol para enriquecer células e tecidos é muito comum em grande parte devido à sua especificidade. Exemplos recentes dessa abordagem incluem a determinação do impacto do colesterol na ativação do canal HERG e nos mecanismos subjacentes42, a descoberta de que o colesterol ativa o receptor acoplado à proteína G suavizado para promover a sinalização de Hedgehog43, e a identificação do papel do colesterol na biomecânica das células-tronco e na adipogênese através das proteínas de ligação associadas à membrana44. Em nosso próprio trabalho, utilizamos o enriquecimento de tecido mamífero com o complexo mβCD:colesterol para estudar o efeito do enriquecimento do colesterol na função básica e o perfil farmacológico dos canais de cálcio e tensão-gated de grande condutância (BK, MaxiK) no músculo liso vascular35,45,46. Em outros estudos, utilizou-se a abordagem de dispersão baseada em fosfolipíptos para enriquecer oócitos de Xenopus com colesterol para determinar os papéis de diferentes regiões em Kir2.1 e girk na sensibilidade ao colesterol41,47,48,49, bem como para determinar locais de ligação de colesterol putativo nesses canais32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

O enriquecimento de colesterol de tecidos e células de mamíferos, incluindo os oócitos xenopus usados para estudar a função celular, pode ser realizado usando uma variedade de métodos. Aqui, descrevemos duas abordagens importantes usadas para este fim. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando ciclodextrina saturada com colesterol usando artérias cerebrais (tecidos) e neurônios hipocampais (células) como exemplos. Esta abordagem pode ser usada para qualquer tipo de tecido, células ou linhas celulares. Uma abordagem alternativa para o enriquecimento do colesterol envolve o uso de lipoproteína de baixa densidade (LDL). A vantagem dessa abordagem é que ela usa parte do maquinário de homeostase natural da célula. No entanto, considerando que a abordagem da ciclodextrina pode ser aplicada para enriquecer qualquer tipo de interesse celular com colesterol, a abordagem lDL é limitada a células que expressam receptores LDL (por exemplo, células hepáticas, células derivadas da medula óssea, como leucócitos sanguíneos e macrófagos teciduais), e o nível de enriquecimento depende da concentração e da mobilidade do receptor LDL. Além disso, as partículas de LDL incluem outros lipídios, por isso a entrega de colesterol não é específica. Em segundo lugar, descrevemos como enriquecer os oócitos de Xenopus com colesterol usando uma dispersão à base de fosfolipídeos (ou seja, liposóficos) que inclui colesterol. Os oócitos xenopus constituem um popular sistema de expressão heteróloga usado para estudar a função celular e proteica. Tanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de ciclodextrina do tecido mamífero (artérias cerebrais) quanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de fosfolipídeos de oócitos xenopus, demonstramos que os níveis de colesterol atingem um máximo após 5 min de incubação. Esse nível de colesterol permanece constante durante longos períodos de incubação (por exemplo, 60 min). Juntos, esses dados fornecem a base para condições temporais otimizadas para o enriquecimento de colesterol de tecidos, células e oócitos de Xenopus para estudos funcionais que visam interrogar o impacto do enriquecimento do colesterol.

O uso da ciclodextrina saturada de colesterol como meio de enriquecer tecidos e células com colesterol está bem estabelecido. Aqui, primeiro demonstramos a aplicação desta abordagem amplamente utilizada para enriquecer artérias cerebrais de ratos com colesterol usando MβCD saturado com colesterol. A Figura 1A mostra um exemplo de uma camada muscular lisa da artéria cerebral e demonstra o aumento dependente da concentração na fluoresc...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Dois métodos de enriquecimento do colesterol são apresentados: a aplicação de ciclodextrina saturada com colesterol para enriquecer tecidos e células de mamíferos, e o uso de dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidos com colesterol (lipossos) para enriquecer os oócitos xenopus. Esses métodos são fundamentais para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos.

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

O colesterol elevado é um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Nossos protocolos fornecem ferramentas valiosas para estudar as consequências fisiológicas e mecanicistas da hipercolesterolemia. Esses procedimentos podem ser realizados usando equipamentos básicos de laboratório, e são aplicáveis a células, tecidos e oócitos xenopus.O colesterol é um componente importante das membranas celulares em todo o corpo. Essas técnicas podem ser utilizadas para estudar o impacto de níveis elevados de colesterol em qualquer tipo de célula. Dissecar as artérias é o passo mais difícil.Remova cuidadosamente a artéria do cérebro, sem esticar ou danificar o tecido vascular. Lipídios são muito delicados, e trabalhar com eles é mais uma arte do que uma ciência. A demonstração de vídeo fornece um guia para aprender a lidar com lipídios com cuidado.Para preparar a solução de metila-beta-ciclodextrina saturada de colesterol, adicione primeiro 064 gramas de metil-beta-ciclodextrina a 10 mililitros de PBS, agitando a solução com uma barra de agitação, para garantir que a metil-beta-ciclodextrina se dissolva totalmente. Em seguida, adicione 0024 gramas de pó de colesterol ao frasco, e mexa a solução vigorosamente, usando uma espátula para quebrar o maior número possível de pedaços de colesterol. Quando quase todo o colesterol tiver sido dissolvido, sele o frasco com pelo menos duas camadas de filme de parafina.E agitar o frasco a cerca de 30 oscilações por minuto em um banho de água de 37 graus Celsius durante a noite. Depois de oito a 16 horas, esfrie a solução à temperatura ambiente, antes de filtrar a mistura através de um filtro de seringa de poliésterulfone de 22 micrômetros em uma garrafa de classe. Para o enriquecimento da artéria cerebral dos mamíferos, colhia o cérebro de um rato Sprague Dawley de 250 a 300 gramas em um béquer de PBS no gelo, antes de transferir o cérebro para uma tigela de dissecção encerada, sob um microscópio dissecando, contendo apenas PBS suficiente para submergir o tecido.Proteja o cérebro com dois a três pinos, certificando-se de que eles não penetrem vasos sanguíneos. E use fórceps afiados e pequenas tesouras cirúrgicas para dissecar suavemente as artérias cerebrais e seus ramos que formam o Círculo de Willis na base do cérebro. Em seguida, enxágue brevemente até um centímetro de comprimento dos segmentos da artéria na PBS, antes de incubar os segmentos enxaguados em solução suficiente de enriquecimento de colesterol para cobrir os tecidos.Para determinar quaisquer alterações no nível de colesterol, use uma garrafa fresca de pó de filipina para preparar uma solução de estoque de 10 miligramas por mililitro do corante em sulfóxido de dimetil, e lave os tecidos enriquecidos de colesterol com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco. Após a última lavagem, fixe os segmentos da artéria em 4% de paraformaldeído por 15 minutos no gelo, protegido da luz, antes de permeabilizar as amostras em 5% Triton em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os tecidos com três lavagens de cinco minutos em PBS em um shaker, antes de adicionar as amostras a uma concentração final de 25 microgramas por mililitro de solução de corante filipina, por uma hora à temperatura ambiente, protegida da luz.No final da incubação, lave as peças da artéria três vezes como demonstrado, seguida de uma breve lavagem com água destilada. Após a última lavagem, use um tecido de laboratório para absorver qualquer excesso de líquido e monte as artérias em um slide usando um meio de montagem apropriado. Cubra cuidadosamente as artérias com um deslizamento de tampa, tomando cuidado para evitar enrolar ou torcer o tecido, e deixe o slide secar por 24 horas em temperatura ambiente, protegido da luz.Quando o meio de montagem estiver seco, sele as bordas de deslizamento de tampa com esmalte claro e deixe o polimento secar por 10 a 15 minutos. Em seguida, imagem do tecido com uma excitação de 340 a 380 nanômetros, e uma emissão de 385 a 470 nanômetros. Para preparar a dispersão à base de fosfolipídid, combine 200 microliters de 10 mililígenos por solução lipídica dissolvida por clorofórmio mililitro, L-alfa-fosfatidylethanolamina, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfosphocholine, e colesterol em um tubo de vidro de 12 mililitro.Evaporar o clorofórmio no capô sob um fluxo de nitrogênio, antes de suspender os lipídios em 800 microliters de 150 milialares de cloreto de potássio e 10 milimilas solução Tris HEPES. Em seguida, sele o tubo com filme de parafina e sonicar suavemente o conteúdo do tubo a 80 kilohertz por 10 minutos, até formar uma mistura leitosa. Para o enriquecimento de colesterol de oócitos xenopus, use fórceps afiados para interromper o sacuto ovariano de um sapo xenopus laevis fêmea em várias regiões, e coloque os pedaços de ovário em uma placa de 60 milímetros com cinco mililitros de ND96 livre de cálcio suplementados com 5 miligramas por mililitro de colagenase.Agite o tecido em um agitador orbital a 60 oscilações por minuto durante 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, use uma pipeta de transferência com uma ponta larga para pipetar vigorosamente o oócito contendo solução de cinco a dez vezes para isolar os oócitos individuais, e enxaguar rapidamente a solução de oócito escuro com nd96 fresco livre de cálcio até que a solução se torne transparente. Em seguida, transfira 90 microlitadores do colesterol enriquecido dispersão à base de fosfolipídio em um poço de uma placa de poço 96, e adicione seis oócitos ao poço com o mínimo possível.Coloque a placa 96 em um rotador de plataforma tridimensional por cinco a 10 minutos. Em seguida, adicione uma gota de ND96 ao poço, e transfira os oócitos enriquecidos de colesterol para uma placa de 35 milímetros contendo ND96 para sua análise imediata. Aqui, um exemplo de uma camada muscular lisa da artéria cerebral imagem demonstra o aumento dependente da concentração na fluorescência associada à filipina obtida após o enriquecimento tecidual com concentrações crescentes de colesterol.Notavelmente três horas após o tratamento com o complexo de colesterol metil-beta-ciclodextrina, os níveis de colesterol diminuíram aproximadamente 50% em comparação com seu nível imediatamente após o enriquecimento. Embora um tempo de incubação de uma hora seja comumente usado para enriquecer os tecidos e células com colesterol durante essa abordagem, cinco minutos de incubação são geralmente suficientes para alcançar um aumento estatisticamente significativo no teor de colesterol arterial cerebral, determinado pelo ensaio bioquímico baseado em colesterol oxidase. Embora nenhuma mudança significativa seja observada nos níveis de colesterol em Xenopus oócitos enriquecidos com dispersões à base de fósforo de controle sem colesterol, os níveis de colesterol aumentam significativamente após apenas cinco minutos de tratamento com as dispersões à base de fosfolipídid que incluem colesterol, e permanecem neste nível quando o tempo de incubação é aumentado para 60 minutos.A eficácia da abordagem baseada em ciclodextrina para células enriquecedoras também é demonstrada em neurônios recém-isolados da região do CA1 do hipocampo. De fato, a incubação dos neurônios na metil-beta-ciclodextrina saturada de colesterol por 60 minutos resulta em um aumento de mais de duas vezes nos níveis de colesterol, conforme avaliado pela fluorescência associada à filipina. No geral, os dois passos mais importantes para esses procedimentos são preparar a mistura de enriquecimento de colesterol e garantir a integridade do tecido arterial.Após o enriquecimento do colesterol, pode-se estudar a função das proteínas que são afetadas pela hipercolesterolemia. A capacidade de enriquecer células com colesterol facilitou o estudo de níveis elevados de colesterol em cardiomiócitos e neurônios. O uso de oócitos nos permitiu investigar como o colesterol se liga aos canais de íons.Um jaleco e luvas que ela sempre usa para este protocolo. Clorofórmio e paraformaldeído devem ser usados sob um capô de fumaça e serem descartados como resíduos perigosos.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...