Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por um Fundo de Desenvolvimento de Cientistas (11SDG5190025) da American Heart Association (para A.R.-D.), e pelo National Institute of Health R01 concede AA-023764 (para A.N.B.), e HL-104631 e R37 AA-11560 (para A.M.D.).

Todos os procedimentos experimentais com animais foram realizados no Centro de Ciênciada da Saúde da Universidade do Tennessee (UTHSC). O cuidado com os animais e os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal da UTHSC, instituição credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais de Laboratório Internacional.
1. Enriquecimento de tecidos e células utilizando metil-β-ciclodextrina saturada com colesterol...

Métodos para enriquecer tecidos e células de mamíferos e oócitos xenopus com colesterol constituem uma poderosa ferramenta para investigar o efeito de níveis elevados de colesterol em espécies moleculares individuais, em sistemas macromoleculares complexos (por exemplo, proteínas), e na função celular e de órgãos. Neste artigo, descrevemos duas abordagens complementares que facilitam tais estudos. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando MβCD saturado com coleste...

O colesterol, um dos principais lipídios celulares, desempenha numerosos papéis funcionais e estruturais críticos1,,2,,3,4,5,,66,7,,8,9. Desde a regulação das propriedades físicas da membrana plasmática até a garantia da viabilidade celular, crescimento, proliferação e servindo como uma molécula de sinalização e precursora em uma infinidade de vias bioquímicas, o colesterol é um componente imperativo necessário para a função normal de células e órgãos. Como resultado, a deficiência de colesterol resulta em malformações físicas graves e uma variedade de distúrbios. Por outro lado, mesmo um pequeno aumento do colesterol acima dos níveis fisiológicos (2-3x) é citotóxico1,2,10 e tem sido associado ao desenvolvimento de distúrbios, incluindo doenças cardiovasculares11,,12,,13 e neurodegenerativas14,,15,16,17. Assim, para interrogar as funções críticas do colesterol e determinar o efeito das mudanças nos níveis de colesterol, foram desenvolvidas diferentes abordagens que alteram o conteúdo do colesterol em tecidos, células e oócitos xenopus.
Alteração dos níveis de colesterol em tecidos e células de mamíferos Várias abordagens podem ser aproveitadas para diminuir os níveis de colesterol nos tecidos e células18. Uma abordagem envolve sua exposição a estatinas dissolvidas no soro lipoproteína-deficiente para inibir a redução do HMG-CoA, que controla a taxa de síntese de colesterol19,20. No entanto, essas drogas que reduzem o colesterol também inibem a formação de produtos não-esterol ao longo do caminho mevalonato. Portanto, uma pequena quantidade de mevalonato é adicionada para permitir a formação desses produtos21 e aumentar a especificidade dessa abordagem. Outra abordagem para a diminuição dos níveis de colesterol envolve o uso de β-ciclodextrinas. Estes monômeros glucopyranose possuem uma cavidade hidrofóbica interna com diâmetro que corresponde ao tamanho dos esteróis22, o que facilita a extração de colesterol das células, esgotando-os de seu teor de colesterol nativo23. Um exemplo é a 2-hidroxipropipil-β-ciclodextrina (HPβCD), uma droga pré-clínica atualmente sendo testada para o tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C, uma desordem metabólica fatal geneticamente herdada caracterizada pelo armazenamento de colesterol lysossomal24. O nível de esgotamento do colesterol depende do derivado específico utilizado. Por exemplo, o HPβCD extrai colesterol com uma capacidade menor do que o derivado metilado, metil-β-ciclodextrina (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Notavelmente, no entanto, β-ciclodextrinas também podem extrair outras moléculas hidrofóbicas além do colesterol, o que pode resultar em efeitos inespecíficos31. Em contraste com o esgotamento, as células e tecidos podem ser especificamente enriquecidos com colesterol através do tratamento com β-ciclodextrina que foi pré-saturada com colesterol23. Esta abordagem também pode ser usada como um controle para a especificidade das β-ciclodextrinas utilizadas para o esgotamento do colesterol31. O esgotamento do colesterol de tecidos e células é simples e pode ser alcançado expondo as células de 30-60 min a 5 mM MβCD dissolvido no meio usado para armazenar as células. Essa abordagem pode resultar em uma redução de 50% no teor de colesterol (por exemplo, em neurônios hipocampais32, artérias cerebrais de ratos33). Por outro lado, preparar o complexo β-ciclodextrina-colesterol para o enriquecimento de colesterol de tecidos e células é mais complexo, e será descrito na seção de protocolo.
Uma abordagem alternativa para enriquecer tecidos e células que utilizam β-ciclodextrina saturada com colesterol envolve o uso de LDL, que se baseia em receptores LDL expressos nos tecidos/células18. Embora essa abordagem ofereça a vantagem de usar o maquinário de homeostase de colesterol natural da célula, ele tem várias limitações. Em primeiro lugar, tecidos e células que não expressam o receptor LDL não podem ser enriquecidos usando esta abordagem. Em segundo lugar, as partículas de LDL contêm outros lipídios, além do colesterol. Especificamente, o LDL é composto pela proteína ApoB100 (25%) e os seguintes lipídios (75%): ~6-8% colesterol, ~45-50% éster de cholesteryl, ~18-24% fosfolipídios e ~4-8% triacilglicerols34. Assim, a entrega de colesterol através de partículas LDL é inespecífica. Em terceiro lugar, o percentual de aumento do teor de colesterol por LDL em tecidos e células que expressam o receptor LDL pode ser significativamente menor do que o aumento observado usando ciclodextrina saturada de colesterol. Por exemplo, em um estudo anterior, o enriquecimento de artérias cerebrais de roedores com colesterol via LDL resultou em apenas um aumento de 10-15% nos níveis de colesterol35. Em contrapartida, o enriquecimento dessas artérias com ciclodextrina saturada com colesterol conforme descrito na seção de protocolo resultou em aumento de >50% no teor de colesterol (Ver Seção Resultados Representativos, Figura 1).
Alteração dos níveis de colesterol nos oócitos xenopus Os oócitos de xenopus constituem um sistema de expressão heterólogo comumente usado para estudar a função celular e proteica. Estudos anteriores mostraram que a razão do colesterol para o molar fosfolipídeo nos oócitos xenopus é de 0,5 ± 0,136. Devido a esse alto nível intrínseco de colesterol, o aumento do teor de colesterol neste sistema é desafiador, mas pode ser alcançado usando dispersões feitas de fosfolipídeos de membrana e colesterol. Os fosfolipídios que escolhemos para este fim são semelhantes aos utilizados para formar bicamadas lipídicas planares artificiais e incluem L-α-fosphatidyletanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), conforme descrito na seção de protocolo. Essa abordagem pode resultar em >50% de aumento no teor de colesterol (Ver seção Resultados Representativos, Figura 2).
Uma abordagem alternativa para enriquecer os oócitos xenopus com dispersões à base de fosfolipídeos envolve o uso de ciclodextrina saturada com colesterol, que é semelhante à maneira como tecidos e células são enriquecidos. No entanto, descobrimos que essa abordagem é de baixa reprodutibilidade e eficiência, com um aumento médio de ~25% no teor de colesterol. Isso possivelmente se deve à capacidade de carga diferente dessas duas abordagens (Ver seção Resultados Representativos, Figura 3). Em contraste, foi demonstrado que o uso de ciclodextrina para esgotar o colesterol dos oócitos xenopus pode resultar em uma redução de ~40% no teor de colesterol36.
Aqui, focamos no enriquecimento do colesterol de tecidos e células de mamíferos através da aplicação de ciclodextrina saturada de colesterol, e de oócitos xenopus usando liposomos. Ambas as abordagens podem ser aproveitadas para delinear o efeito do aumento dos níveis de colesterol na função proteica. Os mecanismos de modulação do colesterol da função proteica podem envolver interações diretas8 e/ou efeitos indiretos9. Quando o colesterol afeta a função proteica através de interações diretas, o efeito de um aumento nos níveis de colesterol na atividade proteica é provavelmente independente do tipo celular, sistema de expressão ou abordagem de enriquecimento. Por exemplo, utilizamos essas duas abordagens para determinar o efeito do colesterol nos canais de potássio retificador interiormente (GIRK) da proteína G expressos em miócitos atrial37, neurônios hipocampais32,38, HEK29339 células, e xenopus oócitos32,37. Os resultados obtidos nestes estudos foram consistentes: em todos os três tipos de células mamíferas e em oócitos anfíbios a função de canal girk upregulated (ver seção Resultados Representativos, Figura 4, para neurônios hipocampais e os experimentos correspondentes em oócitos xenopus). Além disso, as observações feitas nesses estudos também foram consistentes com os resultados de estudos realizados em miócitos atrial37,40 e neurônios hipocampais32,38 recém-isolados de animais submetidos a uma dieta de colesterol elevado40. Notavelmente, o enriquecimento do colesterol de neurônios hipocampais usando MβCD reverteu o efeito da terapia atorvastatina usada para lidar com o impacto da dieta de colesterol alto tanto nos níveis de colesterol quanto na função GIRK38. Em outros estudos, investigou-se o efeito das mutações na sensibilidade ao colesterol do canal de potássio kir2.1 retificador interiormente usando tanto os oócitos de Xenopus quanto as células HEK29341. Novamente, o efeito das mutações na sensibilidade do canal foi semelhante nos dois sistemas.
As aplicações de ambos os métodos de enriquecimento para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos são numerosas. Em particular, o uso de complexos ciclodextrina-colesterol para enriquecer células e tecidos é muito comum em grande parte devido à sua especificidade. Exemplos recentes dessa abordagem incluem a determinação do impacto do colesterol na ativação do canal HERG e nos mecanismos subjacentes42, a descoberta de que o colesterol ativa o receptor acoplado à proteína G suavizado para promover a sinalização de Hedgehog43, e a identificação do papel do colesterol na biomecânica das células-tronco e na adipogênese através das proteínas de ligação associadas à membrana44. Em nosso próprio trabalho, utilizamos o enriquecimento de tecido mamífero com o complexo mβCD:colesterol para estudar o efeito do enriquecimento do colesterol na função básica e o perfil farmacológico dos canais de cálcio e tensão-gated de grande condutância (BK, MaxiK) no músculo liso vascular35,45,46. Em outros estudos, utilizou-se a abordagem de dispersão baseada em fosfolipíptos para enriquecer oócitos de Xenopus com colesterol para determinar os papéis de diferentes regiões em Kir2.1 e girk na sensibilidade ao colesterol41,47,48,49, bem como para determinar locais de ligação de colesterol putativo nesses canais32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

O enriquecimento de colesterol de tecidos e células de mamíferos, incluindo os oócitos xenopus usados para estudar a função celular, pode ser realizado usando uma variedade de métodos. Aqui, descrevemos duas abordagens importantes usadas para este fim. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando ciclodextrina saturada com colesterol usando artérias cerebrais (tecidos) e neurônios hipocampais (células) como exemplos. Esta abordagem pode ser usada para qualquer tipo de tecido, células ou linhas celulares. Uma abordagem alternativa para o enriquecimento do colesterol envolve o uso de lipoproteína de baixa densidade (LDL). A vantagem dessa abordagem é que ela usa parte do maquinário de homeostase natural da célula. No entanto, considerando que a abordagem da ciclodextrina pode ser aplicada para enriquecer qualquer tipo de interesse celular com colesterol, a abordagem lDL é limitada a células que expressam receptores LDL (por exemplo, células hepáticas, células derivadas da medula óssea, como leucócitos sanguíneos e macrófagos teciduais), e o nível de enriquecimento depende da concentração e da mobilidade do receptor LDL. Além disso, as partículas de LDL incluem outros lipídios, por isso a entrega de colesterol não é específica. Em segundo lugar, descrevemos como enriquecer os oócitos de Xenopus com colesterol usando uma dispersão à base de fosfolipídeos (ou seja, liposóficos) que inclui colesterol. Os oócitos xenopus constituem um popular sistema de expressão heteróloga usado para estudar a função celular e proteica. Tanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de ciclodextrina do tecido mamífero (artérias cerebrais) quanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de fosfolipídeos de oócitos xenopus, demonstramos que os níveis de colesterol atingem um máximo após 5 min de incubação. Esse nível de colesterol permanece constante durante longos períodos de incubação (por exemplo, 60 min). Juntos, esses dados fornecem a base para condições temporais otimizadas para o enriquecimento de colesterol de tecidos, células e oócitos de Xenopus para estudos funcionais que visam interrogar o impacto do enriquecimento do colesterol.

O uso da ciclodextrina saturada de colesterol como meio de enriquecer tecidos e células com colesterol está bem estabelecido. Aqui, primeiro demonstramos a aplicação desta abordagem amplamente utilizada para enriquecer artérias cerebrais de ratos com colesterol usando MβCD saturado com colesterol. A Figura 1A mostra um exemplo de uma camada muscular lisa da artéria cerebral e demonstra o aumento dependente da concentração na fluoresc...

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Dois métodos de enriquecimento do colesterol são apresentados: a aplicação de ciclodextrina saturada com colesterol para enriquecer tecidos e células de mamíferos, e o uso de dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidos com colesterol (lipossos) para enriquecer os oócitos xenopus. Esses métodos são fundamentais para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos.

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

O colesterol elevado é um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Nossos protocolos fornecem ferramentas valiosas para estudar as consequências fisiológicas e mecanicistas da hipercolesterolemia. Esses procedimentos podem ser realizados usando equipamentos básicos de laboratório, e são aplicáveis a células, tecidos e oócitos xenopus.O colesterol é um componente importante das membranas celulares em todo o corpo. Essas técnicas podem ser utilizadas para estudar o impacto de níveis elevados de colesterol em qualquer tipo de célula. Dissecar as artérias é o passo mais difícil.Remova cuidadosamente a artéria do cérebro, sem esticar ou danificar o tecido vascular. Lipídios são muito delicados, e trabalhar com eles é mais uma arte do que uma ciência. A demonstração de vídeo fornece um guia para aprender a lidar com lipídios com cuidado.Para preparar a solução de metila-beta-ciclodextrina saturada de colesterol, adicione primeiro 064 gramas de metil-beta-ciclodextrina a 10 mililitros de PBS, agitando a solução com uma barra de agitação, para garantir que a metil-beta-ciclodextrina se dissolva totalmente. Em seguida, adicione 0024 gramas de pó de colesterol ao frasco, e mexa a solução vigorosamente, usando uma espátula para quebrar o maior número possível de pedaços de colesterol. Quando quase todo o colesterol tiver sido dissolvido, sele o frasco com pelo menos duas camadas de filme de parafina.E agitar o frasco a cerca de 30 oscilações por minuto em um banho de água de 37 graus Celsius durante a noite. Depois de oito a 16 horas, esfrie a solução à temperatura ambiente, antes de filtrar a mistura através de um filtro de seringa de poliésterulfone de 22 micrômetros em uma garrafa de classe. Para o enriquecimento da artéria cerebral dos mamíferos, colhia o cérebro de um rato Sprague Dawley de 250 a 300 gramas em um béquer de PBS no gelo, antes de transferir o cérebro para uma tigela de dissecção encerada, sob um microscópio dissecando, contendo apenas PBS suficiente para submergir o tecido.Proteja o cérebro com dois a três pinos, certificando-se de que eles não penetrem vasos sanguíneos. E use fórceps afiados e pequenas tesouras cirúrgicas para dissecar suavemente as artérias cerebrais e seus ramos que formam o Círculo de Willis na base do cérebro. Em seguida, enxágue brevemente até um centímetro de comprimento dos segmentos da artéria na PBS, antes de incubar os segmentos enxaguados em solução suficiente de enriquecimento de colesterol para cobrir os tecidos.Para determinar quaisquer alterações no nível de colesterol, use uma garrafa fresca de pó de filipina para preparar uma solução de estoque de 10 miligramas por mililitro do corante em sulfóxido de dimetil, e lave os tecidos enriquecidos de colesterol com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco. Após a última lavagem, fixe os segmentos da artéria em 4% de paraformaldeído por 15 minutos no gelo, protegido da luz, antes de permeabilizar as amostras em 5% Triton em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os tecidos com três lavagens de cinco minutos em PBS em um shaker, antes de adicionar as amostras a uma concentração final de 25 microgramas por mililitro de solução de corante filipina, por uma hora à temperatura ambiente, protegida da luz.No final da incubação, lave as peças da artéria três vezes como demonstrado, seguida de uma breve lavagem com água destilada. Após a última lavagem, use um tecido de laboratório para absorver qualquer excesso de líquido e monte as artérias em um slide usando um meio de montagem apropriado. Cubra cuidadosamente as artérias com um deslizamento de tampa, tomando cuidado para evitar enrolar ou torcer o tecido, e deixe o slide secar por 24 horas em temperatura ambiente, protegido da luz.Quando o meio de montagem estiver seco, sele as bordas de deslizamento de tampa com esmalte claro e deixe o polimento secar por 10 a 15 minutos. Em seguida, imagem do tecido com uma excitação de 340 a 380 nanômetros, e uma emissão de 385 a 470 nanômetros. Para preparar a dispersão à base de fosfolipídid, combine 200 microliters de 10 mililígenos por solução lipídica dissolvida por clorofórmio mililitro, L-alfa-fosfatidylethanolamina, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfosphocholine, e colesterol em um tubo de vidro de 12 mililitro.Evaporar o clorofórmio no capô sob um fluxo de nitrogênio, antes de suspender os lipídios em 800 microliters de 150 milialares de cloreto de potássio e 10 milimilas solução Tris HEPES. Em seguida, sele o tubo com filme de parafina e sonicar suavemente o conteúdo do tubo a 80 kilohertz por 10 minutos, até formar uma mistura leitosa. Para o enriquecimento de colesterol de oócitos xenopus, use fórceps afiados para interromper o sacuto ovariano de um sapo xenopus laevis fêmea em várias regiões, e coloque os pedaços de ovário em uma placa de 60 milímetros com cinco mililitros de ND96 livre de cálcio suplementados com 5 miligramas por mililitro de colagenase.Agite o tecido em um agitador orbital a 60 oscilações por minuto durante 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, use uma pipeta de transferência com uma ponta larga para pipetar vigorosamente o oócito contendo solução de cinco a dez vezes para isolar os oócitos individuais, e enxaguar rapidamente a solução de oócito escuro com nd96 fresco livre de cálcio até que a solução se torne transparente. Em seguida, transfira 90 microlitadores do colesterol enriquecido dispersão à base de fosfolipídio em um poço de uma placa de poço 96, e adicione seis oócitos ao poço com o mínimo possível.Coloque a placa 96 em um rotador de plataforma tridimensional por cinco a 10 minutos. Em seguida, adicione uma gota de ND96 ao poço, e transfira os oócitos enriquecidos de colesterol para uma placa de 35 milímetros contendo ND96 para sua análise imediata. Aqui, um exemplo de uma camada muscular lisa da artéria cerebral imagem demonstra o aumento dependente da concentração na fluorescência associada à filipina obtida após o enriquecimento tecidual com concentrações crescentes de colesterol.Notavelmente três horas após o tratamento com o complexo de colesterol metil-beta-ciclodextrina, os níveis de colesterol diminuíram aproximadamente 50% em comparação com seu nível imediatamente após o enriquecimento. Embora um tempo de incubação de uma hora seja comumente usado para enriquecer os tecidos e células com colesterol durante essa abordagem, cinco minutos de incubação são geralmente suficientes para alcançar um aumento estatisticamente significativo no teor de colesterol arterial cerebral, determinado pelo ensaio bioquímico baseado em colesterol oxidase. Embora nenhuma mudança significativa seja observada nos níveis de colesterol em Xenopus oócitos enriquecidos com dispersões à base de fósforo de controle sem colesterol, os níveis de colesterol aumentam significativamente após apenas cinco minutos de tratamento com as dispersões à base de fosfolipídid que incluem colesterol, e permanecem neste nível quando o tempo de incubação é aumentado para 60 minutos.A eficácia da abordagem baseada em ciclodextrina para células enriquecedoras também é demonstrada em neurônios recém-isolados da região do CA1 do hipocampo. De fato, a incubação dos neurônios na metil-beta-ciclodextrina saturada de colesterol por 60 minutos resulta em um aumento de mais de duas vezes nos níveis de colesterol, conforme avaliado pela fluorescência associada à filipina. No geral, os dois passos mais importantes para esses procedimentos são preparar a mistura de enriquecimento de colesterol e garantir a integridade do tecido arterial.Após o enriquecimento do colesterol, pode-se estudar a função das proteínas que são afetadas pela hipercolesterolemia. A capacidade de enriquecer células com colesterol facilitou o estudo de níveis elevados de colesterol em cardiomiócitos e neurônios. O uso de oócitos nos permitiu investigar como o colesterol se liga aos canais de íons.Um jaleco e luvas que ela sempre usa para este protocolo. Clorofórmio e paraformaldeído devem ser usados sob um capô de fumaça e serem descartados como resíduos perigosos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...