Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грант развития ученых (11SDG5190025) от Американской ассоциации сердца (в A.R.-D.), и Национальный институт здравоохранения R01 грантов AA-023764 (до A.N.B.), и HL-104631 и R37 AA-11560 (к A.M.D.).

Все экспериментальные процедуры с животными были проведены в Научном центре здоровья Университета Теннесси (UTHSC). Уход за животными и экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию UTHSC, который является учреждением, аккредитова...

Методы обогащения тканей и клеток млекопитающих и ксенопусов холестерином представляют собой мощный инструмент для исследования влияния повышенного уровня холестерина на отдельные молекулярные виды, на сложные макромолекулярные системы (например, белки) и на клеточные и органн...

Холестерин, основной клеточный липид, играет многочисленные критические функциональные и структурные роли1,,2,,3,,4,,55,66,7,8,,9. От регулирования физических свойств плазменной мембраны до обеспечения жизнеспособности клеток, роста, пролиферации и использования молекулы сигнала и прекурсора в изобилии биохимических путей, холестерин является императивным компонентом, необходимым для нормальной функции клеток и органов. В результате дефицит холестерина приводит к тяжелым физическим порокам развития и различным расстройствам. С другой стороны, даже небольшое повышение уровня холестерина выше физиологических уровней (2-3x),является цитотоксическим1,,2,,10 и было связано с развитием нарушений, в том числе сердечно-сосудистых11,,12,,13 и нейродегенеративных заболеваний14,15,16,17. Таким образом, для изучения важнейших функций холестерина и определения влияния изменений уровня холестерина были разработаны различные подходы, которые изменяют содержание холестерина в тканях, клетках и ксенопух.
Изменение уровня холестерина в тканях и клетках млекопитающих Несколько подходов могут быть использованы для снижения уровня холестерина в тканях и клетках18. Один подход включает в себя их воздействие статинов, растворенных в липопротеино-дефицитной сыворотке для ингибирования HMG-CoA редуктазы, которая контролирует скорость синтеза холестерина19,20. Тем не менее, эти препараты снижения уровня холестерина также препятствуют образованию нестероловых продуктов вдоль мевалонатного пути. Таким образом, небольшое количество мевалоната добавляется, чтобы позволить образование этих продуктов21 и повысить специфику этого подхода. Другой подход к снижению уровня холестерина включает в себя использование циклодекстрин. Эти гюфрироранозы мономеры обладают внутренней гидрофобной полости с диаметром, который соответствует размеру стеринов22, что облегчает извлечение холестерина из клеток, тем самым истощая их от родного содержания холестерина23. Примером является 2-гидроксипропил-я-циклодекстрин (HP-CD), доклинический препарат в настоящее время тестируется для лечения ниманн-Пик типа C болезни, генетически наследственных смертельных метаболических расстройств, характеризующихся лизосомального холестерина хранения24. Уровень истощения холестерина зависит от конкретной производной используется. Например, HP-CD извлекает холестерин с меньшей емкостью, чем метилированные производные, метил-и-циклодекстрин (МЗКД)24,25,26,27,28,29,30. Примечательно, однако, что циклодекстрины могут также извлекать другие гидрофобные молекулы в дополнение к холестерину, что может привести к неспецифическим эффектам31. В отличие от истощения, клетки и ткани могут быть специально обогащены холестерином путем лечения циклодекстрином, который был донасыщен холестерином23. Этот подход также может быть использован в качестве контроля для специфики q-циклодекстринов, используемых для истощения холестерина31. Истощение холестерина из тканей и клеток является простым и может быть достигнуто путем разоблачения клеток в течение 30-60 мин до 5 мМ ММ МЗКД растворяется в среде, используемой для хранения клеток. Такой подход может привести к 50% снижению содержания холестерина (например, в гиппокампе нейронов32, крысиных мозговых артерий33). С другой стороны, подготовка комплекса к циклодекстрин-холестерин для обогащения холестерина тканей и клеток является более сложной и будет описана в разделе протокола.
Альтернативный подход к обогащению тканей и клеток с использованием циклодекстрин насыщен холестерина включает в себя использование ЛПНП, который опирается на рецепторы ЛПНП, выраженные в тканях / клетках18. Хотя этот подход предлагает преимущество использования природного холестерина гомеостаза машины клетки, он имеет несколько ограничений. Во-первых, ткани и клетки, которые не выражают рецептор ЛПНП не могут быть обогащены с помощью этого подхода. Во-вторых, частицы ЛПНП содержат другие липиды в дополнение к холестерину. В частности, ЛПНП состоит из белка ApoB100 (25%) и следующие липиды (75%): 6-8% холестерина, 45-50% холестериновый эфир, 18-24% фосфолипидов и 4-8% триацилглицерола34. Таким образом, доставка холестерина через частицы ЛПНП является неспецифической. В-третьих, процент увеличения содержания холестерина ЛПНП в тканях и клетках, которые выражают рецептор ЛПНП может быть значительно ниже, чем увеличение наблюдается с помощью циклодекстрин насыщенхолестерина холестерина. Например, в предыдущем исследовании, обогащение грызунов мозговых артерий с холестерином через ЛПНП привело только 10-15% увеличение уровня холестерина35. В отличие от этого, обогащение этих артерий циклодекстрином, насыщенным холестерином, как описано в разделе протокола, привело к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел «Результаты представительства», рисунок 1).
Изменение уровня холестерина в яйцеклетках Ксенопуса Ксенопусские яйцеклетки представляют собой гетерологовую систему экспрессии, обычно используемую для изучения функции клеток и белков. Более ранние исследования показали, что соотношение холестерина к фосфолипидным молярным соотношению у ооцитов Ксенопуса составляет 0,5 и 0,136. Из-за этого внутренне высокий уровень холестерина, повышение содержания холестерина в этой системе является сложной задачей, но может быть достигнуто с помощью дисперсии из мембранных фосфолипидов и холестерина. Фосфолипиды, которые мы выбрали для этой цели, аналогичны тем, которые используются для формирования искусственных планарных липидных бислой и включают L-я-фосфатидидаланоламин (POPE) и 1-palmitoyl-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфо-л-серин (POPS), как описано в разделе протокола. Такой подход может привести к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел "Результаты представлений", рисунок 2).
Альтернативный подход к обогащению ооцитов ксенопуса фосфолипидными дисперсиями предполагает использование циклодекстрин, насыщенный холестерином, который похож на то, как обогащаются ткани и клетки. Тем не менее, мы обнаружили, что этот подход имеет низкую воспроизводимость и эффективность, в среднем на 25% больше содержания холестерина. Это, возможно, связано с различной грузоподъемностью этих двух подходов (см. раздел "Результаты представитель", рисунок 3). В отличие от этого, было показано, что использование циклодекстрин для истощения холестерина из ооцитов Ксенопуса может привести к снижениюсодержанияхолестерина на 40%.
Здесь мы сосредоточиваемся на обогащении холестерина тканей и клеток млекопитающих путем применения циклодекстрин насыщенных холестерином, и ксенопусов ооцитов с использованием липосом. Оба подхода могут быть использованы для разграничения влияния повышенного уровня холестерина на функцию белка. Механизмы модуляции холестерина функции белка могут включать прямые взаимодействия8 и/или косвенные эффекты9. Когда холестерин влияет на функцию белка через прямые взаимодействия, влияние повышения уровня холестерина на активность белка, вероятно, не зависит от типа клеток, системы выражения или подхода обогащения. Например, мы использовали эти два подхода, чтобы определить влияние холестерина на G-белок закрытых внутренне выправляя калия (GIRK) каналов, выраженных в предсердий миоцитов37, гиппокампа нейронов32,38, HEK29339 клеток, и Ксенопус ооцитов32,37. Результаты, полученные в этих исследованиях, были последовательными: во всех трех типах клеток млекопитающих и в оицитах амфибий холестерина upregulated GIRK функции канала (см. Представитель Результаты раздела, Рисунок 4, для гиппокампа нейронов и соответствующие эксперименты в ооцитов Ксенопуса). Кроме того, наблюдения, сделанные в этих исследованиях, также согласуются с результатами исследований, проведенных в предсердий миоцитов37,40 и гиппокампа нейронов32,38 свежеизолированных от животных, подвергаемых высоким уровнем холестерина диеты40. Примечательно, что обогащение холестерина гиппокампа нейронов с помощью МЗКД обратить вспять эффект аторвастатина терапии, используемой для решения воздействия диеты с высоким уровнем холестерина как на уровень холестерина и GIRK функции38. В других исследованиях мы исследовали влияние мутаций на чувствительность холестерина внутренне выправляющего калийный канал Kir2.1 с использованием обоих клеток Xenopus и клеток HEK29341. Опять же, влияние мутаций на чувствительность канала было аналогичным в двух системах.
Применение обоих методов обогащения для определения влияния повышенного уровня холестерина на молекулярную, клеточную и органную функцию многочисленны. В частности, использование циклодекстрин-холестериновых комплексов для обогащения клеток и тканей очень распространено во многом благодаря своей специфичности. Недавние примеры такого подхода включают определение влияния холестерина на активацию канала HERG и основные механизмы42, открытие, что холестерин активирует G белка связаны рецептор Smoothened содействовать Ежик сигнализации43, и определение роли холестерина в биомеханики стволовых клеток и адипогенеза через мембраны связанных связующих белков44. В нашей собственной работе, мы использовали обогащение тканей млекопитающих с комплексом M'CD: холестерин для изучения влияния обогащения холестерина на основную функцию и фармакологический профиль кальция- и напряжения-gated каналов большой проводимости (BK, MaxiK) в сосудистой гладкой мышце35,45,46. В других исследованиях, мы использовали фосфолипид основе дисперсии подход для обогащения ксенопусов ооцитов с холестерином, чтобы определить роли различных регионов в Kir2.1 и GIRK каналов в холестериновой чувствительности41,47,48,49, а также для определения предполагаемых холестеринсвязных сайтов в этих каналах32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

Холестерин обогащения тканей млекопитающих и клеток, в том числе Ксенопус ооцитов, используемых для изучения функции клеток, может быть достигнуто с помощью различных методов. Здесь мы описываем два важных подхода, используемых для этой цели. Во-первых, мы описываем, как обогащать ткани и клетки с помощью циклодекстрин насыщен холестерина с помощью мозговых артерий (тканей) и гиппокампа нейронов (клеток) в качестве примеров. Этот подход может быть использован для любого типа тканей, клеток или клеточных линий. Альтернативный подход к обогащению холестерина предполагает использование липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Преимущество этого подхода является то, что он использует часть естественного холестерина гомеостаза машины клетки. Однако, в то время как циклодекстрин подход может быть применен для обогащения любого типа клеток с холестерином, LDL подход ограничивается клетками, которые выражают ldL рецепторов (например, клетки печени, костного мозга полученных клеток, таких как лейкоциты крови и ткани макрофагов), и уровень обогащения зависит от концентрации и мобильности рецептора ЛПНП. Кроме того, частицы ЛПНП включают в себя другие липиды, поэтому доставка холестерина неспецифическая. Во-вторых, мы описываем, как обогатить ооциты ксенопуса холестерином с помощью дисперсии на основе фосфолипидов (т.е. липосом), которая включает холестерин. Ксенопусские яйцеклетки представляют собой популярную гетерологусную систему экспрессии, используемую для изучения функции клеток и белков. Как для циклодекстрин основе холестерина обогащения подход млекопитающих тканей (мозговых артерий) и фосфолипид основе холестерина обогащения подход ксенопуса ооцитов, мы пяндекс. Этот уровень холестерина остается неизменным в течение длительных периодов инкубации (например, 60 мин). В совокупности эти данные обеспечивают основу для оптимизированных временных условий для обогащения холестерина тканей, клеток и ооцитов ксенопусов для функциональных исследований, направленных на изучение влияния обогащения холестерина.

Использование циклодекстрин насыщен холестерина в качестве средства для обогащения тканей и клеток с холестерином хорошо установлено. Здесь мы сначала демонстрируем применение этого широко используемого подхода для обогащения крысиных мозговых артерий холестерин...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Представлены два метода обогащения холестерина: применение циклодекстрин насыщенного холестерином для обогащения тканей и клеток млекопитающих, а также использование обогащенных холестерином фосфолипидных дисперсий (липосом) для обогащения клеточных яйцеклеток. Эти методы являются полезными для определения влияния повышенного уровня холестерина в молекулярной, клеточной и органной функции.

Обогащение тканей млекопитающих и ксенопусов с холестерином

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Повышенный уровень холестерина является основным фактором риска сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Наши протоколы предоставляют ценные инструменты для изучения как физиологических, так и механистических последствий гиперхолестеринемии. Эти процедуры могут быть выполнены с использованием базового лабораторного оборудования, и применимы к клеткам, тканям и ксенопус яйцеклеток.Холестерин является основным компонентом клеточных мембран по всему телу. Эти методы могут быть использованы для изучения влияния повышенного уровня холестерина в любом типе клеток. Рассечение артерий является самым трудным шагом.Тщательно удалите артерию из мозга, не растягивая и не повреждая сосудистую ткань. Липиды очень деликатны, и работа с ними - это скорее искусство, чем наука. Видео демонстрация предоставляет руководство для обучения, как обращаться с липидами тщательно.Чтобы подготовить насыщенный холестерином метил-бета-циклодекстрин раствор, сначала добавьте 064 грамма метил-бета-циклодекстрина в 10 миллилитров PBS, перемешивая раствор с помощью батончика, чтобы убедиться, что метил-бета-циклодекстрин полностью растворяется. Затем добавьте 0024 грамма холестеринового порошка в колбу и энергично перемешивайте раствор, используя шпатель, чтобы разбить как можно больше кусков холестерина. Когда почти весь холестерин был растворен, запечатать колбу, по крайней мере два слоя парафиновой пленки.И встряхните колбу около 30 колебаний в минуту в 37 градусов по Цельсию водяной бане на ночь. Через 8-16 часов охладите раствор до комнатной температуры, прежде чем фильтровать смесь через 22-метровый фильтр для шприца полиэтилена в классную бутылку. Для обогащения мозговой артерии млекопитающих, урожай мозга от 250 до 300 грамм Sprague Dawley крысы в стакан PBS на льду, прежде чем передать мозг в вощеной чаши вскрытия, под рассечением микроскопа, содержащий достаточно PBS, чтобы погрузить ткани.Защитите мозг двумя-тремя булавками, убедившись, что они не проникают в кровеносные сосуды. И использовать острые миппы и небольшие хирургические ножницы, чтобы аккуратно вскрыть мозговые артерии и их ветви, которые образуют Круг Уиллиса у основания мозга. Далее, кратко промыть до одного сантиметра длиной артерии сегментов в PBS, прежде чем инкубации промыть сегментов в достаточно холестерина обогащающий раствор для покрытия тканей.Чтобы определить любые изменения в уровне холестерина, используйте свежую бутылку филипинового порошка, чтобы подготовить 10 миллиграмм на миллилитр раствора запаса красителя в диметиловом сульфоксиде, и мыть холестерин обогащенных тканей с тремя пять минут моет в свежем PBS. После последней стирки, исправить сегменты артерии в 4%paraformaldehyde в течение 15 минут на льду, защищенный от света, прежде чем проницать образцы в 5%Triton в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть ткани с тремя пятью минутами моет в PBS на шейкер, прежде чем добавить образцы 25 микрограмм на миллилитр окончательной концентрации раствора филипина красителя, в течение одного часа при комнатной температуре, защищены от света.В конце инкубации, мыть кусочки артерии в три раза, как попродемонстрировано, а затем краткое полоскание дистиллированной водой. После последнего мытья, использовать лабораторные ткани, чтобы поглотить излишки жидкости, и смонтировать артерии на слайде с помощью соответствующей среды монтажа. Тщательно накройте артерии крышкой скольжения, заботясь, чтобы избежать прокатки или скручивания ткани, и пусть слайд сухой в течение 24 часов при комнатной температуре, защищены от света.Когда монтаж среды сухой, печать крышки скольжения края с четким лаком для ногтей, и дайте польский высохнуть в течение 10 до 15 минут. Затем, изображение ткани с возбуждением от 340 до 380 нанометров, и выброс от 385 до 470 нанометров. Для подготовки дисперсии на основе фосфата, объединить 200 микролитров 10 миллиграмм на миллилитр хлороформ растворенного липидного раствора, L-альфа-фосфатилетаноламин, 1-Palmitoyl-2-олеойл-sn-glycero-3-фосфатохолин, и холестерин в 12 миллилитров стеклянной трубки.Испарите хлороформ в капюшоне под потоком азота, прежде чем приостановить липиды в 800 микролитров буферных 150 миллимолярный хлорид калия и 10 миллимолярный Tris HEPES раствор. Затем запечатайте трубку парафиновой пленкой и аккуратно опечатайте содержимое трубки на 80 килогерц в течение 10 минут, пока не образуется молочная смесь. Для обогащения холестерина ксенопусных яйцеклеток, использовать острые миппы, чтобы нарушить яичников мешок от самки xenopus laevis лягушки в нескольких регионах, и место яичников куски в 60 миллиметров пластины с пятью миллилитров кальция бесплатно ND96 дополнены 5 миллиграммов на миллилитр коллагеназы.Встряхните ткань на орбитальном шейкере при 60 колебаниях в минуту в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации используйте переносную пипетку с широким наконечником, чтобы энергично пипетку яйцеклетки, содержащую раствор, пять-десять раз изолировать отдельные яйцеклетки, и быстро промыть темный раствор яйцеклетки свежим кальцием ND96 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Далее, передача 90 микролитров холестерина обогащенного фосфолипида на основе дисперсии в один колодец из 96 пластины хорошо, и добавить до шести яйцеклеток в колодец с как можно меньше среды, как это возможно.Поместите пластину 96 хорошо на трехмерный ротатор платформы в течение пяти-десяти минут. Затем добавьте каплю ND96 в колодец и перенесите обогащенные холестерином яйцеклетки в 35-миллиметровую пластину, содержащую ND96 для их немедленного анализа. Здесь, пример изображенной мозговой артерии гладкий мышечный слой демонстрирует концентрацию зависимого увеличения филипина связанных флуоресценции, полученные при обогащении тканей с увеличением концентрации холестерина.Примечательно, что через три часа после лечения метил-бета-циклодекстрином холестерина уровень холестерина снизился примерно на 50% по сравнению с их уровнем сразу после обогащения. В то время как один час инкубации время обычно используется для обогащения тканей и клеток с холестерином во время этого подхода, пять минут инкубации, как правило, достаточно для достижения статистически значимого увеличения содержания артериального холестерина в мозге, как это определено холестерина оксидазы на основе биохимического анализа. Хотя никаких существенных изменений наблюдается в уровнях холестерина в Ксенопс ооцитов обогащенный контроля фосфолипида основе дисперсий не хватает холестерина, уровень холестерина значительно повыситься только после пяти минут лечения с фосфолипид основе дисперсий, которые включают холестерин, и остаются на этом уровне, когда инкубацио время увеличивается до 60 минут.Эффективность циклодекстринного подхода для обогащения клеток также демонстрируется в нейронах, недавно изолированных от области CA1 гиппокампа. Действительно, инкубация нейронов в метил-бета-циклодекстрин насыщенных холестерином в течение 60 минут приводит к более чем в два раза повышение уровня холестерина, по оценке филипина связанных флуоресценции. В целом, два наиболее важных шага для этих процедур являются подготовка смеси обогащения холестерина и обеспечения целостности артериальной ткани.После обогащения холестерина, можно изучить функцию белков, которые страдают от гиперхолестеринемии. Способность обогащать клетки холестерином способствовала изучению повышенного уровня холестерина в кардиомиоцитах и нейронах. Использование ооцитов позволило нам исследовать, как холестерин связывается с ионные каналы.Лабораторное пальто и перчатки, которые она всегда носила для этого протокола. Хлороформ и параформальдегид следует использовать под дымовой капот и выбрасывать в качестве опасных отходов.

enrichment-of-mammalian-tissues-and-xenopus-oocytes-with-cholesterol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Флуорометрия с фиксацией напряжения в<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооциты с использованием флуоресцентных неестественных аминокислот

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

Обогащение частиц липопротеинов коренных народов с микроРНК и последующее определение их абсолютной/относительной микроРНК содержание и их сотовой скорость передачи

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...