Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una Beca de Desarrollo Científico (11SDG5190025) de la Asociación Americana del Corazón (a A.R.-D.), y por el Instituto Nacional de Salud R01 otorga AA-023764 (a A.N.B.), y HL-104631 y R37 AA-11560 (a A.M.D.).

Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee (UTHSC). El cuidado de los animales y los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la UTHSC, que es una institución acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International.
1. Enriquecimiento de tejidos y células utilizando metil--ciclodextrina satura...

Los métodos para enriquecer los tejidos y células de los mamíferos y los ovocitos de Xenopus con colesterol constituyen una poderosa herramienta para investigar el efecto de los niveles elevados de colesterol en especies moleculares individuales, en sistemas macromoleculares complejos (por ejemplo, proteínas), y en la función celular y de órganos. En este documento, hemos descrito dos enfoques complementarios que facilitan esos estudios. En primer lugar, describimos cómo enriquecer los tejidos y las célu...

El colesterol, un lípido celular importante, desempeña numerosos roles funcionales y estructurales críticos1,2,3,4,5,6,7,8,9. Desde la regulación de las propiedades físicas de la membrana plasmática hasta asegurar la viabilidad celular, el crecimiento, la proliferación y servir como una molécula de señalización y precursora en una gran cantidad de vías bioquímicas, el colesterol es un componente imperativo necesario para la función celular y orgánica normal. Como resultado, deficiencia de colesterol resulta en malformaciones físicas graves y una variedad de trastornos. Por otro lado, incluso un pequeño aumento del colesterol por encima de los niveles fisiológicos (2-3x) es citotóxico1,2,10 y se ha asociado con el desarrollo de trastornos, incluyendocardiovasculares 11,12,13 y enfermedades neurodegenerativas14,15,16,17. Por lo tanto, para interrogar las funciones críticas del colesterol y determinar el efecto de los cambios en los niveles de colesterol, se han desarrollado diferentes enfoques que alteran el contenido de colesterol en tejidos, células y ovocitos de Xenopus.
Alteración de los niveles de colesterol en los tejidos y células de los mamíferos Se pueden aprovechar varios enfoques para disminuir los niveles de colesterol en tejidos y células18. Un enfoque implica su exposición a estatinas disueltas en suero deficiente en lipoproteínas para inhibir la HMG-CoA reductasa, que controla la tasa de síntesis de colesterol19,20. Sin embargo, estos medicamentos para reducir el colesterol también inhiben la formación de productos no esteroles a lo largo de la vía del mevalonato. Por lo tanto, se añade una pequeña cantidad de mevalonato para permitir la formación de estos productos21 y mejorar la especificidad de este enfoque. Otro enfoque para disminuir los niveles de colesterol implica el uso de -ciclosdextrinas. Estos monómeros de glucopranosa poseen una cavidad hidrofóbica interna con un diámetro que coincide con el tamaño de los esteroles22,lo que facilita la extracción de colesterol de las células, agotando así su contenido de colesterol nativo23. Un ejemplo es el 2-hidroxipropil--ciclodextrina (HP-CD), un medicamento preclínico que actualmente se está probando para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, un trastorno metabólico mortal genéticamente heredado caracterizado por el almacenamiento de colesterol lisosomal24. El nivel de agotamiento del colesterol depende del derivado específico utilizado. Por ejemplo, la HP-CD extrae el colesterol con una capacidad inferior a la derivada metilada, metil--ciclodextrina (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. En particular, sin embargo, -ciclosdextrinas también pueden extraer otras moléculas hidrófobas además del colesterol, que luego puede resultar en efectos inespecíficos31. A diferencia del agotamiento, las células y los tejidos se pueden enriquecer específicamente con colesterol a través del tratamiento con la ciclodextrina que ha sido presaturado con colesterol23. Este enfoque también se puede utilizar como un control para la especificidad de las ciclosdextrinas utilizadas para el agotamiento del colesterol31. El agotamiento del colesterol de los tejidos y las células es sencillo y se puede lograr exponiendo las células durante 30-60 min a 5 mM M-CD disuelto en el medio utilizado para almacenar las células. Este enfoque puede resultar en una disminución del 50% en el contenido de colesterol (por ejemplo, en las neuronas del hipocampo32, las arterias cerebrales de rata33). Por otro lado, la preparación del complejo de ciclodextrina-colesterol para el enriquecimiento de colesterol de tejido y células es más compleja, y se describirá en la sección de protocolo.
Un enfoque alternativo para enriquecer los tejidos y las células que utilizan la ciclodextrina saturada con colesterol implica el uso de LDL, que se basa en receptores LDL expresados en los tejidos/células18. Si bien este enfoque ofrece la ventaja de utilizar la maquinaria de homeostasis de colesterol natural de la célula, tiene varias limitaciones. En primer lugar, los tejidos y células que no expresan el receptor LDL no se pueden enriquecer con este enfoque. En segundo lugar, las partículas de LDL contienen otros lípidos además del colesterol. Específicamente, LDL se compone de la proteína ApoB100 (25%) y los siguientes lípidos (75%): colesterol de 6-8%, éster de colesteryl de 45-50%, fosfolípidos de 18-24% y triacilgliceroles de 4-8%34. Por lo tanto, la administración de colesterol a través de partículas DE LDL es inespecífica. En tercer lugar, el porcentaje de aumento en el contenido de colesterol por LDL en los tejidos y células que expresan el receptor LDL puede ser significativamente menor que el aumento observado utilizando ciclodextrina saturada de colesterol. Por ejemplo, en un estudio anterior, el enriquecimiento de las arterias cerebrales de roedores con colesterol a través de LDL dio lugar a sólo un aumento del 10-15% en los niveles de colesterol35. Por el contrario, el enriquecimiento de estas arterias con ciclodextrina saturada de colesterol como se describe en la sección de protocolo dio lugar a >50% aumento en el contenido de colesterol (Ver sección Resultados Representativos, Figura 1).
Alteración de los niveles de colesterol en los ovocitos de Xenopus Los ovocitos de xenopus constituyen un sistema de expresión hetólogo comúnmente utilizado para el estudio de la función celular y proteica. Estudios anteriores han demostrado que la relación de colesterol a fosfolípidos molares en los ovocitos de Xenopus es de 0,5 x 0,136. Debido a este alto nivel intrínseco de colesterol, aumentar el contenido de colesterol en este sistema es un reto, sin embargo, se puede lograr utilizando dispersiones hechas de fosfolípidos de membrana y colesterol. Los fosfolípidos que hemos elegido para este fin son similares a los utilizados para la formación de bicapas de lípidos planas artificiales e incluyen L-a-fosfatidiletanolamina (POPE) y 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serina (POPS), como se describe en la sección de protocolo. Este enfoque puede resultar en >50% de aumento en el contenido de colesterol (ver sección Resultados representativos, Figura 2).
Un enfoque alternativo para enriquecer los ovocitos de Xenopus con dispersiones basadas en fosfolípidos implica el uso de ciclodextrina saturada de colesterol, que es similar a la forma en que se enriquecen los tejidos y las células. Sin embargo, hemos encontrado que este enfoque es de baja reproducibilidad y eficiencia, con un aumento promedio del 25% en el contenido de colesterol. Esto es posiblemente debido a la diferente capacidad de carga de estos dos enfoques (ver sección Resultados representativos, Figura 3). Por el contrario, se ha demostrado que el uso de ciclodextrina para agotar el colesterol de los ovocitos de Xenopus puede resultar en una disminución del 40% en el contenido de colesterol36.
Aquí, nos centramos en el enriquecimiento de colesterol de los tejidos y células de los mamíferos a través de la aplicación de ciclodextrina saturada de colesterol, y de los ovocitos de Xenopus usando liposomas. Ambos enfoques se pueden aprovechar para delinear el efecto del aumento de los niveles de colesterol en la función proteica. Los mecanismos de modulación del colesterol de la función proteica pueden implicar interacciones directas8 y/o efectos indirectos9. Cuando el colesterol afecta la función proteica a través de interacciones directas, el efecto de un aumento en los niveles de colesterol en la actividad proteica es probablemente independiente del tipo de célula, sistema de expresión, o enfoque de enriquecimiento. Por ejemplo, utilizamos estos dos enfoques para determinar el efecto del colesterol en la proteína G cerrada internamente rectificando los canales de potasio (GIRK) expresados en miocitos auriculares37, neuronas hipocampales32,38, HEK29339 células, y xenopus ovocitos32,37. Los resultados obtenidos en estos estudios fueron consistentes: en los tres tipos de células de mamíferos y en los ovocitos anfibios el colesterol upregulated función del canal GIRK (ver sección Resultados Representativos, Figura 4, para las neuronas del hipocampo y los experimentos correspondientes en ovocitos de Xenopus). Además, las observaciones realizadas en estos estudios también fueron coherentes con los resultados de los estudios realizados en micocitos auriculares37,,40 y neuronas hipocampales32,,38 recién aisladas de animales sometidos a una dieta alta en colesterol40. En particular, el enriquecimiento de colesterol de las neuronas hipocampales que utilizan M-CD revirtió el efecto de la terapia con atorvastatina utilizada para abordar el impacto de la dieta alta en colesterol tanto en los niveles de colesterol como en la funciónGIRK 38. En otros estudios, investigamos el efecto de las mutaciones en la sensibilidad al colesterol del canal de potasio Ki2.1 rectificando internamente Kir2.1 utilizando ambos ovocitos de Xenopus y células HEK29341. Una vez más, el efecto de las mutaciones en la sensibilidad del canal fue similar en los dos sistemas.
Las aplicaciones de ambos métodos de enriquecimiento para determinar el impacto de los niveles elevados de colesterol en la función molecular, celular y orgánica son numerosas. En particular, el uso de complejos de ciclodextrina-colesterol para enriquecer las células y tejidos es muy común en gran medida debido a su especificidad. Ejemplos recientes de este enfoque incluyen la determinación del impacto del colesterol en la activación del canal HERG y los mecanismos subyacentes42, el descubrimiento de que el colesterol activa el receptor acoplado a la proteína G Suavizado para promover la señalización de erizo43, y la identificación del papel del colesterol en la biomecánica de células madre y la adipogénesis a través de proteínas de vinculador asociadas a la membrana44. En nuestro propio trabajo, utilizamos el enriquecimiento de tejido de mamíferos con el complejo M-CD:colesterol para estudiar el efecto del enriquecimiento de colesterol en la función básica y el perfil farmacológico de los canales de calcio y voltaje cerrados de gran conductancia (BK, MaxiK) en el músculo liso vascular35,,45,,46. En otros estudios, utilizamos el enfoque de dispersión basado en fosfolípidos para enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol para determinar las funciones de diferentes regiones en los canales Kir2.1 y GIRK en sensibilidad al colesterol41,,47,48,49, así como para determinar los sitios de unión del colesterol putativo en estos canales32,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

El enriquecimiento de colesterol de los tejidos y células de los mamíferos, incluyendo los ovocitos de Xenopus utilizados para estudiar la función celular, se puede lograr utilizando una variedad de métodos. Aquí, describimos dos enfoques importantes utilizados para este propósito. En primer lugar, describimos cómo enriquecer los tejidos y células con colesterol usando ciclodextrina saturada con colesterol usando arterias cerebrales (tejidos) y neuronas hipocampales (células) como ejemplos. Este enfoque se puede utilizar para cualquier tipo de tejido, células o líneas celulares. Un enfoque alternativo para el enriquecimiento del colesterol implica el uso de lipoproteínas de baja densidad (LDL). La ventaja de este enfoque es que utiliza parte de la maquinaria de homeostasis de colesterol natural de la célula. Sin embargo, mientras que el enfoque de ciclodextrina se puede aplicar para enriquecer cualquier tipo de interés celular con el colesterol, el enfoque LDL se limita a las células que expresan receptores LDL (por ejemplo, células hepáticas, células derivadas de la médula ósea como leucocitos de sangre y macrófagos tisulares), y el nivel de enriquecimiento depende de la concentración y la movilidad del receptor LDL. Además, las partículas de LDL incluyen otros lípidos, por lo que la administración de colesterol no es específica. En segundo lugar, describimos cómo enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol utilizando una dispersión basada en fosfolípidos (es decir, liposomas) que incluye el colesterol. Los ovocitos de xenopus constituyen un popular sistema de expresión hetóloga utilizado para estudiar la función celular y proteica. Tanto para el enfoque de enriquecimiento de colesterol basado en ciclodextrina del tejido de mamíferos (arterias cerebrales) como para el enfoque de enriquecimiento de colesterol basado en fosfolípidos de los ovocitos de Xenopus, demostramos que los niveles de colesterol alcanzan un máximo de 5 minutos de incubación. Este nivel de colesterol permanece constante durante períodos prolongados de incubación (por ejemplo, 60 min). Juntos, estos datos proporcionan la base para condiciones temporales optimizadas para el enriquecimiento de colesterol de tejidos, células y ovocitos de Xenopus para estudios funcionales destinados a interrogar el impacto del enriquecimiento de colesterol.

El uso de ciclodextrina saturada con colesterol como un medio para enriquecer los tejidos y las células con colesterol está bien establecido. Aquí, primero demostramos la aplicación de este enfoque ampliamente utilizado para enriquecer las arterias cerebrales de ratas con colesterol usando M-CD saturado de colesterol. La Figura 1A muestra un ejemplo de una capa muscular lisa de la arteria cerebral con imágenes y demuestra el aumento depe...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Se presentan dos métodos de enriquecimiento del colesterol: la aplicación de ciclodextrina saturada con colesterol para enriquecer los tejidos y células de los mamíferos, y el uso de dispersiones basadas en fosfolípidos enriquecidos con colesterol (liposomas) para enriquecer los ovocitos de Xenopus. Estos métodos son instrumentales para determinar el impacto de los niveles elevados de colesterol en la función molecular, celular y orgánica.

Enriquecimiento de los tejidos de los mamíferos y los ovocitos del xenopus con el colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

El colesterol elevado es un factor de riesgo importante para las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Nuestros protocolos proporcionan herramientas valiosas para estudiar las consecuencias fisiológicas y mecanicistas de la hipercolesterolemia. Estos procedimientos se pueden realizar utilizando equipos básicos de laboratorio y son aplicables a células, tejidos y ovocitos xenopus.El colesterol es un componente importante de las membranas celulares en todo el cuerpo. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar el impacto de niveles elevados de colesterol en cualquier tipo de célula. Diseccionar las arterias es el paso más difícil.Retire cuidadosamente la arteria del cerebro, sin estirar ni dañar el tejido vascular. Los lípidos son muy delicados, y trabajar con ellos es más un arte que una ciencia. La demostración en vídeo proporciona una guía para aprender a manejar los lípidos con cuidado.Para preparar la solución saturada de colesterol metil-beta-ciclodextrina, primero agregue 064 gramos de metil-beta-ciclodextrina a 10 mililitros de PBS, agitando la solución con una barra de agitación, para asegurar que la metil-beta-ciclodextrina se disuelva por completo. A continuación, agregue 0024 gramos de polvo de colesterol al matraz, y revuelva la solución vigorosamente, utilizando una espátula para romper tantos trozos de colesterol como sea posible. Cuando casi todo el colesterol se haya disuelto, selle el matraz con al menos dos capas de película de parafina.Y agitar el matraz a unas 30 oscilaciones por minuto en un baño de agua Celsius de 37 grados durante la noche. Después de ocho a 16 horas, enfríe la solución a temperatura ambiente, antes de filtrar la mezcla a través de un filtro de jeringa de poliétersulfone de 22 micrómetros en una botella de clase. Para el enriquecimiento de la arteria cerebral de los mamíferos, cosecha el cerebro de una rata Sprague Dawley de 250 a 300 gramos en un vaso de precipitados de PBS sobre hielo, antes de transferir el cerebro a un tazón de disección encerado, bajo un microscopio desección, que contiene suficiente PBS para sumergir el tejido.Asegure el cerebro con dos o tres pines, asegurándose de que no penetren los vasos sanguíneos. Y usa fórceps afilados y pequeñas tijeras quirúrgicas para diseccionar suavemente las arterias cerebrales y sus ramas que forman el Círculo de Willis en la base del cerebro. A continuación, enjuague brevemente hasta un centímetro de segmentos de arteria de largo en PBS, antes de incubar los segmentos enjuagados en suficiente solución enriquecedora de colesterol para cubrir los tejidos.Para determinar cualquier alteración en el nivel de colesterol, utilice una botella fresca de polvo de filipina para preparar una solución de 10 miligramos por mililitro de stock del tinte en dimetil sulfóxido, y lave los tejidos enriquecidos con colesterol con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco. Después del último lavado, fijar los segmentos de la arteria en 4%paraformaldehído durante 15 minutos sobre hielo, protegido de la luz, antes de permeabilizar las muestras en 5%Tritón en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los tejidos con tres lavados de cinco minutos en PBS en una coctelera, antes de añadir las muestras a una concentración final de 25 microgramos por mililitro de solución de tinte filipin, durante una hora a temperatura ambiente, protegida de la luz.Al final de la incubación, lave las piezas de la arteria tres veces como se ha demostrado, seguido de un breve enjuague con agua destilada. Después del último lavado, usa un tejido de laboratorio para absorber cualquier exceso de líquido, y monta las arterias en un portaobjetos usando un medio de montaje adecuado. Cubra cuidadosamente las arterias con un resbalón de cubierta, teniendo cuidado de evitar rodar o torcer el tejido, y deje que el portaobjetos se seque durante 24 horas a temperatura ambiente, protegido de la luz.Cuando el medio de montaje esté seco, selle los bordes deslizantes de la cubierta con esmalte de uñas transparente y deje que el esmalte se seque durante 10 a 15 minutos. Luego, imagine el tejido con una excitación de 340 a 380 nanómetros, y una emisión de 385 a 470 nanómetros. Para preparar la dispersión a base de fosfolípidos, combine 200 microlitros de 10 miligramos por mililitro cloroformo cloroformo solución lipricada, L-alfa-fosfatidiletanolamina, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, y colesterol en un tubo de vidrio de 12 mililitros.Evaporar el cloroformo en la campana bajo una corriente de nitrógeno, antes de suspender los lípidos en 800 microlitros de cloruro de potasio tamponado de 150 mililitros y 10 mililitros de solución Des HEPES. A continuación, selle el tubo con película de parafina y sonice suavemente el contenido del tubo a 80 kilohercios durante 10 minutos, hasta que se forme una mezcla lechosa. Para el enriquecimiento del colesterol de los ovocitos de Xenopus, utilice fórceps afilados para interrumpir el saco ovárico de una rana hembra de Xenopus laevis en múltiples regiones, y coloque los trozos de ovario en una placa de 60 milímetros con cinco mililitros de ND96 libre de calcio complementado con 5 miligramos por mililitro de colágeno.Agitar el tejido en un agitador orbital a 60 oscilaciones por minuto durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, utilice una pipeta de transferencia con una punta ancha para pipetear vigorosamente el ócito que contiene solución de cinco a 10 veces para aislar los ovocitos individuales, y enjuague rápidamente la solución de ovocitos oscuros con ND96 libre de calcio fresco hasta que la solución se vuelva transparente. A continuación, transfiera 90 microlitros de la dispersión basada en fosfolípidos enriquecidos con colesterol en un pozo de una placa de 96 pozos, y agregue hasta seis ovocitos al pozo con el menor medio posible.Coloque la placa de 96 pozos en un rotador de plataforma tridimensional durante cinco a 10 minutos. A continuación, agregue una gota de ND96 al pozo, y transfiera los ovocitos enriquecidos con colesterol a una placa de 35 milímetros que contenga ND96 para su análisis inmediato. Aquí, un ejemplo de una capa muscular lisa de la arteria cerebral con imagen demuestra el aumento dependiente de la concentración en la fluorescencia asociada a filipin obtenida al enriquecemiento del tejido con el aumento de las concentraciones de colesterol.En particular, tres horas después del tratamiento con el complejo de colesterol metil-beta-ciclodextrina los niveles de colesterol disminuyeron en aproximadamente un 50% en comparación con su nivel inmediatamente después del enriquecimiento. Mientras que un tiempo de incubación de una hora se utiliza comúnmente para enriquecer los tejidos y células con colesterol durante este enfoque, cinco minutos de incubación es generalmente suficiente para lograr un aumento estadísticamente significativo en el contenido de colesterol arterial cerebral según lo determinado por el ensayo bioquímico a base de colesterol oxidasa. Aunque no se observa ningún cambio significativo en los niveles de colesterol en los ovocitos de Xenopus enriquecidos con dispersiones basadas en fosfolípidos de control que carecen de colesterol, los niveles de colesterol aumentan significativamente después de sólo cinco minutos de tratamiento con las dispersiones basadas en fosfolípidos que incluyen colesterol, y permanecen en este nivel cuando el tiempo de incubación se incrementa a 60 minutos.La eficacia del enfoque basado en ciclodextrina para enriquecer las células también se demuestra en las neuronas recién aisladas de la región CA1 del hipocampo. De hecho, la incubación de las neuronas en metil-beta-ciclodextrina saturada con colesterol durante 60 minutos da como resultado un aumento de más de dos veces en los niveles de colesterol, según lo evaluado por la fluorescencia asociada a filipin. En general, los dos pasos más importantes para estos procedimientos son preparar la mezcla de enriquecimiento de colesterol y garantizar la integridad del tejido arterial.Después del enriquecimiento del colesterol, se puede estudiar la función de las proteínas que se ven afectadas por la hipercolesterolemia. La capacidad de enriquecer las células con colesterol facilitó el estudio de niveles elevados de colesterol en cardiomiocitos y neuronas. El uso de ovocitos nos permitió investigar cómo el colesterol se une a los canales iónicos.Un abrigo de laboratorio y guantes que siempre se usa para este protocolo. El cloroformo y el paraformaldehído deben utilizarse bajo una campana de humos y desecharse como residuos peligrosos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Investigación

Bioquímica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...