Name: enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol
Uploaded: 2020-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en Scientist Development Grant (11SDG5190025) från American Heart Association (till A.R.-D.), och av National Institute of Health R01 bidrag AA-023764 (till A.N.B.), och HL-104631 och R37 AA-11560 (till A.M.D).

Alla experimentella försök med djur utfördes vid University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Skötsel av djur och försöksprotokoll har granskats och godkänts av UTHSC:s kommitté för djurvård och användning, som är en institution som ackrediterats av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. Anrikning av vävnader och celler med metyl-β-cyklodextrin mättat med kolesterol
OBS: Kolesterolanrikning pro...

Metoder för att berika däggdjursvävnader och däggdjursceller och Xenopus-oocyter med kolesterol utgör ett kraftfullt verktyg för att undersöka effekten av förhöjda kolesterolnivåer på enskilda molekylära arter, på komplexa makromolekylära system (t.ex. proteiner) och på cellulära och organiska funktion. I detta dokument har vi beskrivit två kompletterande metoder som underlättar sådana studier. Först beskrev vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med MβCD mättad med kolester...

Kolesterol, en stor cellulär lipid, spelar många kritiska funktionella och strukturella roller1,2,3,4,5,6,7,8,9. Från att reglera de fysiska egenskaperna hos plasmamembranet till att säkerställa cellens livskraft, tillväxt, spridning, och fungerar som en signalering och prekursor molekyl i en uppsjö av biokemiska vägar, kolesterol är en absolut nödvändigt komponent som krävs för normal cell och organfunktion. Som ett resultat, kolesterolbrist resulterar i allvarliga fysiska missbildningar och en mängd olika sjukdomar. Å andra sidan, även en liten ökning av kolesterol över fysiologiska nivåer (2-3x) är cytotoxiska1,2,10 och har associerats med utvecklingen av sjukdomar, inklusive hjärt-1111,12,13 och neurodegenerativa sjukdomar14,15,16,17. Således, att förhöra de kritiska funktionerna av kolesterol och att bestämma effekten av förändringar i kolesterolnivåer, olika metoder som ändrar innehållet av kolesterol i vävnader, celler, och Xenopus äggceller har utvecklats.
Ändring av kolesterolnivåer i däggdjursvävnader och celler Flera metoder kan utnyttjas för att minska nivåerna av kolesterol i vävnader och celler18. Ett tillvägagångssätt innebär deras exponering för statiner upplöst i lipoprotein-saknas serum för att hämma HMG-CoA reduktas, som styr graden avkolesterolsyntes 19,20. Emellertid, dessa kolesterolsänkande läkemedel hämmar också bildandet av icke-sterol produkter längs mevalonat vägen. Därför tillsätts en liten mängd mevalonat för att möjliggöra bildandet av dessa produkter21 och öka specificiteten i detta tillvägagångssätt. Ett annat tillvägagångssätt för att minska kolesterolnivåerna innebär användning av β-cyklodextrins. Dessa glucopyranose monomers har en intern hydrofoba hålighet med en diameter som matchar storleken på steroler22, vilket underlättar utvinning av kolesterol från celler, vilket bryter dem från deras inhemska kolesterolhalt23. Ett exempel är 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), ett prekliniskt läkemedel som för närvarande testas för behandling av Niemann-Pick typ C sjukdom, en genetiskt ärftlig dödlig metabolisk störning som kännetecknas av lysosomal kolesterol lagring24. Nivån av kolesterol utarmning beror på den specifika derivat som används. HPβCD extraherar till exempel kolesterol med lägre kapacitet än det metylerade derivatet, metyl-β-cyklodextrin (MβCD)24,,25,,26,27,28,29,30. Särskilt kan dock β-cyklodextrins också extrahera andra hydrofoba molekyler utöver kolesterol, vilket sedan kan resultera i ospecifika effekter31. I motsats till utarmning, celler och vävnader kan vara särskilt berikas med kolesterol genom behandling med β-cyclodextrin som har förmätits med kolesterol23. Detta tillvägagångssätt kan också användas som en kontroll för specificiteten hos β-cyklodextris som används för kolesterolutarmning31. Utarmning av kolesterol från vävnader och celler är enkel och kan uppnås genom att exponera cellerna i 30-60 min till 5 mM MβCD upplöst i det medium som används för att lagra cellerna. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en 50% minskning av kolesterolhalten (t.ex. i hippocampus nervceller32, råtta cerebrala artärer33). Å andra sidan, förbereda β-cyclodextrin-kolesterol komplex för kolesterol anrikning av vävnad och celler är mer komplex, och kommer att beskrivas i protokollet avsnitt.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att berika vävnader och celler med β-cyklodextrin mättad med kolesterol innebär användning av LDL, som är beroende av LDL-receptorer uttryckta i vävnaderna/cellerna18. Även om detta tillvägagångssätt erbjuder fördelen av att använda den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen, det har flera begränsningar. För det första kan vävnader och celler som inte uttrycker LDL-receptorn inte berikas med hjälp av denna metod. För det andra innehåller LDL-partiklar andra lipider utöver kolesterol. Specifikt består LDL av proteinet ApoB100 (25%) och följande lipider (75%): ~6-8% kolesterol, ~45-50% cholesteryl ester, ~18-24% fosfolipider, och ~4-8% triacylglycerols34. Således är leverans av kolesterol via LDL-partiklar ospecifik. För det tredje, andelen ökning av kolesterolhalten av LDL i vävnader och celler som uttrycker LDL-receptorn kan vara betydligt lägre än den ökning som observerats med cyklodextrin mättad med kolesterol. Till exempel, i en tidigare studie, anrikning av gnagare cerebrala artärer med kolesterol via LDL resulterade i endast en 10-15% ökning av kolesterolnivåer35. Däremot resulterade anrikning av dessa artärer med cyklodextrin mättad med kolesterol enligt beskrivningen i protokollavsnittet i >50% ökning av kolesterolhalten (se avsnittet Representativa resultat, figur 1).
Ändring av kolesterolnivåer i Xenopus oocyter Xenopus oocyter utgör ett heterologt uttryckssystem som vanligen används för att studera cell- och proteinfunktion. Tidigare studier har visat att kolesterolet till fosfolipid molar förhållandet i Xenopus oocyter är 0,5 ± 0,136. På grund av denna inneboende höga nivå av kolesterol, öka innehållet av kolesterol i detta system är utmanande, men kan uppnås med hjälp av dispersioner gjorda av membran fosfolipider och kolesterol. Fosfolipiderna som vi har valt för detta ändamål liknar dem som används för att bilda konstgjorda plana lipidbilager och inkluderar L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrivs i protokollet avsnitt. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en ökning av kolesterolhalten på >50 % (se avsnittet Representativa resultat, figur 2).
En alternativ metod för att berika Xenopus oocyter med fosfolipid-baserade dispersioner innebär användning av cyklodextrin mättad med kolesterol, vilket liknar hur vävnader och celler berikas. Vi har dock funnit detta tillvägagångssätt vara av låg reproducerbarhet och effektivitet, med ett genomsnitt på ~ 25% ökning av kolesterolhalten. Detta beror möjligen på de olika lastkapaciteten hos dessa två metoder (se avsnittet Representativa resultat, figur 3). Däremot har det visat sig att använda cyclodextrin att tömma kolesterol från Xenopus oocyter kan resultera i en ~ 40% minskning av kolesterolhalten36.
Här fokuserar vi på kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler genom tillämpning av cyklodextrin mättad med kolesterol, och av Xenopus oocyter med liposomer. Båda metoderna kan utnyttjas för att avgränsa effekten av ökade nivåer av kolesterol på proteinfunktion. Mekanismerna för kolesterolmodulering av proteinfunktion kan innebära direkta interaktioner8 och/eller indirekta effekter9. När kolesterol påverkar proteinfunktion via direkta interaktioner, effekten av en ökning av kolesterolnivåer på proteinaktivitet är sannolikt oberoende av celltyp, uttryckssystem, eller anrikning strategi. Till exempel använde vi dessa två metoder för att bestämma effekten av kolesterol på G-protein gated inåt korrigera kalium (GIRK) kanaler uttryckt i förmaksflimmermyocyter 37, hippocampus nervceller32,38, HEK29339 celler, och Xenopus oocyter32,37. De resultat som erhölls i dessa studier var konsekventa: i alla tre typerna av däggdjursceller och i amfibiska äggceller kolesterol upregulated GIRK kanal funktion (se representativa resultat avsnitt, figur 4, för hippocampus nervceller och motsvarande experiment i Xenopus äggceller). Dessutom var de observationer som gjorts i dessa studier också överensstämmer med resultaten av studier som utförts i förmaksflimmermyocyter 37,40 och hippocampus nervceller32,38 nyligen isolerade från djur som utsätts för en hög kolesterol diet40. Särskilt kolesterol anrikning av hippocampus nervceller med MβCD vände effekten av atorvastatin terapi som används för att ta itu med effekterna av det höga kolesterolet kost både på kolesterolnivåer och GIRK funktion38. I andra studier undersökte vi effekten av mutationer på kolesterolkänsligheten hos den inåtriktade reterbara kaliumkanalen Kir2.1 med både Xenopus oocyter och HEK293-celler41. Återigen var effekten av mutationerna på känsligheten i kanalen liknande i de två systemen.
Tillämpningarna av både anrikningsmetoder för att bestämma effekten av förhöjda kolesterolnivåer på molekylära, cellulära och organfunktion är många. I synnerhet är användningen av cyklodextrin-kolesterol komplex för att berika celler och vävnader mycket vanligt till stor del på grund av dess specificitet. Senaste exemplen på detta tillvägagångssätt är fastställandet av effekterna av kolesterol på HERG kanalaktivering och underliggande mekanismer42, upptäckten att kolesterol aktiverar G proteinkopplade receptorn utjämnas för att främja Igelkott signalering43, och identifiering av den roll som kolesterol i stamceller biomekanik och adipogenesis genom membran-associerade länkare proteiner44. I vårt eget arbete använde vi anrikning av däggdjursvävnad med MβCD:kolesterolkomplex för att studera effekten av kolesterolanrikning på grundläggande funktion och den farmakologiska profilen av kalcium- och spänningsgated kanaler av stor ledning (BK, MaxiK) i kärlmustatur35,,45,46. I andra studier använde vi fosfolipid-baserade dispersion strategi för att berika Xenopus oocyter med kolesterol för att bestämma roller i olika regioner i Kir2.1 och GIRK kanaler i kolesterol känslighet41,47,48,49, samt att bestämma förmodade kolesterol bindande platser i dessa kanaler32,,50,51.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PE 25Mg in Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840022C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol 100Mg Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-034-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Tank</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S35818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Syringe 100uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe 25uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>8120-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Support Stand</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-STAN5X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Clamp, 3-Prong</td>
			<td>Homescience Tools</td>
			<td>CE-CLPUNIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D rotator mixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D 1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR781602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>nexAir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers 40ml-1L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td>CU1526MA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-136-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber bottles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-251-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Disposable Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>13-678-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp&#8482; BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td>FIsher</td>
			<td>97-990E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocytes</td>
			<td>Xenoocyte&#8482;</td>
			<td>10005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>weight 250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath incubator with shaker</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51221080</td>
			<td>Lowest shaker setting O/N 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAE0088-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4%</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI H2O</td>
			<td>University DI source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides 75x25mm Frosted</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15978A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip</td>
			<td>Diagger</td>
			<td>G15972B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Revlon</td>
			<td>771 Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-901-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Securline Lab Marker II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648205-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10mL Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28150-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KimWipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Sartorus</td>
			<td>py-p112s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Denver instrument</td>
			<td>Model 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ETOH</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>211USP/NF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steno book</td>
			<td>Staples</td>
			<td>163485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of mammalian tissues and xenopus oocytes with cholesterol

Kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler, inklusive Xenopus oocyter som används för att studera cellfunktion, kan åstadkommas med hjälp av en mängd olika metoder. Här beskriver vi två viktiga metoder som används för detta ändamål. Först beskriver vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med hjälp av cyklodextrin mättad med kolesterol med hjälp av cerebrala artärer (vävnader) och hippocampus nervceller (celler) som exempel. Denna metod kan användas för alla typer av vävnad, celler eller cellinjer. Ett alternativt tillvägagångssätt för kolesterolanrikning innebär användning av lipoprotein med låg densitet (LDL). Fördelen med detta tillvägagångssätt är att den använder en del av den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen. Cyklodextrinmetoden kan dock användas för att berika alla celltyper av intresse med kolesterol, är LDL-metoden begränsad till celler som uttrycker LDL-receptorer (t.ex. leverceller, benmärgsbaserade celler såsom blod leukocyter och vävnadsmakrofager) och anrikningsnivån beror på koncentrationen och rörligheten hos LDL-receptorn. Dessutom, LDL partiklar inkluderar andra lipider, så kolesterol leverans är ospecificerad. För det andra beskriver vi hur man berikar Xenopus oocyter med kolesterol med hjälp av en fosfolipid-baserad dispersion (dvs. liposomer) som innehåller kolesterol. Xenopus oocyter utgör ett populärt heterologt uttryckssystem som används för att studera cell- och proteinfunktion. För både cyclodextrin-baserade kolesterol anrikning strategi av däggdjur vävnad (cerebrala artärer) och för fosfolipid-baserade kolesterol anrikning strategi Xenopus oocyter, visar vi att kolesterolnivåerna når en maximal efter 5 min inkubation. Denna nivå av kolesterol förblir konstant under längre perioder av inkubation (t.ex. 60 min). Tillsammans, dessa data utgör grunden för optimerade tidsmässiga förhållanden för kolesterol anrikning av vävnader, celler, och Xenopus oocyter för funktionella studier som syftar till att ifrågasätta effekterna av kolesterol anrikning.

Användningen av cyklodextrin mättad med kolesterol som ett sätt att berika vävnader och celler med kolesterol är väl etablerad. Här visar vi först tillämpningen av denna allmänt använda metoden för berika råtta cerebrala artärer med kolesterol med hjälp av MβCD mättad med kolesterol. Figur 1A visar ett exempel på ett avbildad cerebralt artär glatt muskelskikt och visar den koncentrationsberoende ökningen av filipin-associe...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol at JoVE.com

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Två metoder för kolesterol anrikning presenteras: tillämpningen av cyclodextrin mättad med kolesterol för att berika däggdjur vävnader och celler, och användningen av kolesterol-berikade fosfolipid-baserade dispersioner (liposomer) för att berika Xenopus äggceller. Dessa metoder är avgörande för att bestämma effekterna av förhöjda kolesterolnivåer i molekylär, cellulär, och organfunktion.

Anrikning av däggdjursvävnader och Xenopus Oocyter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Förhöjt kolesterol är en stor riskfaktor för hjärt-och neurodegenerativa sjukdomar. Våra protokoll ger värdefulla verktyg för att studera både fysiologiska och mekanistiska konsekvenser av hyperkolesterolemi. Dessa förfaranden kan utföras med hjälp av grundläggande lab utrustning, och är tillämpliga på celler, vävnader, och Xenopus oocyter.Kolesterol är en viktig komponent i cellulära membran i hela kroppen. Dessa tekniker kan utnyttjas för att studera effekterna av förhöjda nivåer av kolesterol i någon celltyp. Dissekera artärerna är det svåraste steget.Avlägsna försiktigt artären från hjärnan, utan att sträcka eller skada kärlvävnaden. Lipider är mycket känsliga, och att arbeta med dem är mer av en konst än en vetenskap. Video demonstration ger en guide för att lära sig hur man hanterar lipider noggrant.För att förbereda kolesterol mättade metyl-beta-cyklodextrin lösning, först lägga 064 gram metyl-beta-cyklodextrin till 10 milliliter PBS, omrörning lösningen med en omrörning bar, för att säkerställa att metyl-beta-cyklodextrin helt upplöses. Tillsätt sedan 0024 gram kolesterolpulver till kolven, och rör om lösningen kraftigt, med hjälp av en spatel för att bryta upp så många kolesterolbitar som möjligt. När nästan allt kolesterol har lösts, försegla kolven med minst två lager paraffin film.Och skaka kolven på ca 30 svängningar per minut i en 37 grader Celsius vattenbad över natten. Efter åtta till 16 timmar, kyl lösningen till rumstemperatur, innan du filtrerar blandningen genom en 22 mikrometer polyetersulfon spruta filter i en klass flaska. För däggdjur cerebral artär anrikning, skörda hjärnan från en 250 till 300 gram Sprague Dawley råtta i en bägare av PBS på is, innan du överför hjärnan till en vaxad dissekering skål, under en dissekera mikroskop, som innehåller precis tillräckligt PBS att dränka vävnaden.Säkra hjärnan med två till tre stift, se till att de inte tränger in i blodkärlen. Och använda skarpa tlyktor och små kirurgiska saxar för att försiktigt dissekera hjärnartärerna och deras grenar som utgör Circle of Willis vid basen av hjärnan. Därefter sköljer du kort upp till en centimeter långa artärsegment i PBS, innan de sköljas i tillräckligt med kolesterolberikande lösning för att täcka vävnaderna.För att bestämma eventuella förändringar i kolesterolnivån, använd en färsk flaska filipinpulver för att förbereda en 10 milligram per milliliter stamlösning av färgämnet i dimetylsulfoxid, och tvätta kolesterolberikade vävnader med tre fem minuters tvättar i färska PBS. Efter den sista tvätten, fixera artärsegmenten i 4%paraformaldehyd i 15 minuter på is, skyddad från ljus, innan de permeabiliserar proverna i 5%Triton i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, tvätta vävnaderna med tre fem minuters tvättar i PBS på en shaker, innan du lägger till proverna till en 25 mikrogram per milliliter slutlig koncentration av filipin färgämne lösning, under en timme vid rumstemperatur, skyddad från ljus.Vid slutet av inkubationen, tvätta artärbitarna tre gånger som visats, följt av en kort sköljning med destillerat vatten. Efter den sista tvätten, använd en lab vävnad för att absorbera överflödig vätska, och montera artärerna på en bild med hjälp av en lämplig montering medium. Täck försiktigt artärerna med en cover slip, var noga med att undvika rullande eller vridning av vävnaden, och låt bilden torka i 24 timmar vid rumstemperatur, skyddad från ljus.När monteringsmediet är torrt, förseglar du täckslitkanterna med klart nagellack, och låt lacket torka i 10 till 15 minuter. Sedan, bild vävnaden med en excitation av 340 till 380 nanometer, och ett utsläpp av 385 till 470 nanometer. För att förbereda fosfolipid baserad spridning, kombinera 200 mikroliter av 10 milligram per milliliter kloroform upplöst lipidlösning, L-alfa-fosfatidytylethanolamin, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoscholine, och kolesterol i en 12 milliliter glasrör.Avdunsta kloroformen i huven under en ström av kväve, innan du suspendera lipider i 800 mikroliter av buffrade 150 millimol kaliumklorid och 10 millimolar Tris HEPES lösning. Sedan försegla röret med paraffin film, och försiktigt sonikera röret innehållet på 80 kilohertz i 10 minuter, tills en mjölkig blandning bildas. För kolesterol anrikning av Xenopus oocytes, använd skarpa tövövädrar för att störa äggstockssäcken från en kvinnlig Xenopus laevis groda i flera regioner, och placera äggstockbitar i en 60 millimeters tallrik med fem milliliter kalciumfri ND96 kompletteras med 5 milligram per milliliter kollagensmedel.Skaka vävnaden på en orbital shaker vid 60 svängningar per minut i 15 minuter vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, använd en överföringspipett med en bred spets för att kraftigt pipett som innehåller lösningen fem till 10 gånger för att isolera de enskilda äggcellerna, och skölj snabbt den mörka äggcellslösningen med färsk kalciumfri ND96 tills lösningen blir transparent. Därefter överför 90 mikroliter av kolesterolberikad fosfolipid baserad spridning i en brunn av en 96 väl platta, och lägga till upp till sex äggceller till brunnen med så lite medium som möjligt.Placera 96 brunnsplattan på en tredimensionell plattformsrotator i fem till 10 minuter. Tillsätt sedan en droppe ND96 till brunnen, och överföra kolesterolberikade äggceller till en 35 millimeters platta som innehåller ND96 för deras omedelbara analys. Här visar ett exempel på en avbildad cerebral artär glatt muskulatur lager koncentrationen beroende ökning av filipin associerade fluorescens erhålls vid vävnad anrikning med ökande koncentrationer av kolesterol.Noterbart tre timmar efter behandlingen med methyl-beta-cyklodextrin kolesterolkomplex kolesterolet komplexa kolesterolnivåerna minskade med cirka 50%jämfört med deras nivå omedelbart efter anrikningen. Medan en en timmes inkubationstid används vanligen för att berika vävnaderna och cellerna med kolesterol under denna metod, är fem minuters inkubation vanligtvis tillräcklig för att uppnå en statistiskt signifikant ökning av cerebral arteriell kolesterolhalt som bestäms av kolesteroloxidas baserad biokemisk analys. Medan ingen signifikant förändring observeras i kolesterolnivåer i Xenopus oocyter berikad med kontroll fosfolipid baserade dispersioner saknar kolesterol, kolesterolnivåer ökar betydligt efter bara fem minuters behandling med de fosfolipid baserade dispersioner som inkluderar kolesterol, och kvar på denna nivå när inkubationstiden ökas till 60 minuter.Effektiviteten av den cyklodextrin baserade metoden för att berika celler är också visat i nervceller nyligen isolerade från CA1 regionen hippocampus. Faktum är att inkubation av nervceller i metyl-beta-cyklodextrin mättad med kolesterol i 60 minuter resulterar i en över två gånger ökning av kolesterolnivåer, som bedöms av filipin associerade fluorescens. Sammantaget är de två viktigaste stegen för dessa förfaranden förbereder kolesterol anrikning blandningen och säkerställa integriteten i arteriell vävnad.Efter kolesterolanrikning kan man studera funktionen hos de proteiner som påverkas av hyperkolesterolemi. Förmågan att berika celler med kolesterol underlättade studiet av förhöjda kolesterolnivåer i kardiomyocyter och nervceller. Användningen av oocyter gjorde det möjligt för oss att undersöka hur kolesterol binder till jonkanaler.En labbrock och handskar hon alltid bäras för detta protokoll. Kloroform och paraformaldehyd ska användas under en rökhuv och kasseras som farligt avfall.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spänningsklämma Fluorometry in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyter Användande Fluorescerande Onaturliga Aminosyror

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anrikning av tvättmedel-olösligt Protein aggregat från människahjärnan efter döden

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vävnader färgas med självlysande konjugerade Oligothiophenes av Hyperspektrala Confocal Microscopy och fluorescens livstid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Anrikning av Native Lipoproteinpartiklar med mikroRNA och efterföljande bestämning av deras absoluta/relativa mikroRNA innehåll och deras cellulära överföringshastigheten

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...