染色质免疫沉淀，然后测序，或ChIP-seq，是一种技术，可用于发现转录因子，组蛋白修饰，和其他DNA相关蛋白质的调控目标。在ChIP-seq中，细胞被收获和DNA结合蛋白。与体内的DNA与甲醛交叉链接。
细胞被裂化，释放细胞内分，染色质被剪切成小于1000个碱基对的片段，通常介于200到600个碱基对之间。DNA与目标蛋白相互作用，使用抗体进行免疫沉淀，通过脱交链接进行分离。DNA蛋白交联被逆转，RNA和蛋白质被消化。
DNA被净化，制作成库，并排序。ChIP-seq 数据还可用于查找不同环境条件或细胞类型的转录因子的差分结合。最初，ChIP 是通过微阵列的杂交执行的。
然而，由于技术进步、降低测序的财务障碍以及大量高质量数据输出，ChIP测序已成为首选方法。在该协议中，我们将演示使用细菌生物膜（持续和慢性感染的主要来源）执行 ChIP-seq 的技术。ChIP-seq 将在沙门氏菌酪细胞生物膜和浮游生物细胞上进行，针对主生物膜调节剂 CSGD，以确定两种细胞类型的差分结合。
在本次视频中，我们将演示确定适当数量的生物膜收获、对浮游生物控制样品进行标准化、使生物膜均质以进行交联器访问以及执行常规 ChIP-seq 步骤以获得高质量测序结果的技术。条纹板沙门氏菌肠服务我们的酪蛋白在LB加糖板隔离菌落和孵化在37摄氏度过夜。接种5 mL LB 肉汤，从条纹板中接种 1 到 3 个菌落，并在 37 摄氏度下孵育，摇晃 7 小时或记录生长。
使用分光光度计查找 600 纳米的烧瓶培养的光学密度，并将一个 OD 600 等效细胞培养或 10 添加到 9 个细胞中，该烧瓶含有 100 毫升的 1% tryptone。在28摄氏度下孵育，摇晃13小时。生物膜细胞以聚合片形式出现，单浮游细胞在多云介质中。
生物膜具有很强的耐药性，粘在管子和移液器尖端的两侧。我们使用条件介质最初移动生物膜，并在交联之前立即使用温暖的 PBS 去除介质中的蛋白质交联基质。研究人员可能需要找到一个合适的解决方案来重新悬浮生物膜。
将烧瓶培养在离心管中，在12000G下以12000G的离心机在10摄氏度下10分钟。将上清液放入 0.2 微米过滤器单元和真空过滤器中。等分瓶培养成管和离心以慢速分离两种细胞类型。
生物膜细胞在管底的颗粒中，单细胞在多云上清液中。将含有浮游细胞的上流液放入离心管中，供以后使用。建议将25微克的DNA作为ChIP-seq实验的输入。
在我们的案例中，30毫克的生物膜产生大约25微克的DNA。由于生物膜聚合物含有丰富的蛋白质细胞外材料，因此它竞争交联器，并可能导致免疫沉淀的不相等的交联产品。提出了一种蛋白质测定方法，通过蛋白质浓度测定等量细胞物质。
在这种情况下，6个OD 600浮游细胞作为30毫克生物膜的对照进行收获。生物膜由湿重收获，生物膜的群落养殖单位可以使用显示的转化因子找到。鼓励研究人员通过均质化和滴稀释找到生物膜形成物种的转化因子。
将生物膜颗粒重新悬浮在一毫升的调节性 tryptone 中，并移入预重的两毫升扣盖或螺帽管中。在11，000G下离心1分钟，从管中取出上一代，并精确称重管。用生物膜从管的重量中减去管的重量，以找到集料的重量。
它应该在目标生物膜重量的10%以内。加入一毫升的PBS和涡流，重新悬浮生物膜聚合体。将上经剂从低速离心分配到离心管中。
使用分光光度计以 600 纳米测量浮游细胞的光密度，并计算最终 OD 600 的 600 所需的体积。将弗洛拉离心机冷却至 10 摄氏度，并使用 Flora 离心机对浮游生物细胞进行颗粒化。在10摄氏度下以10000G离心10分钟。
拆下上一液，重新悬浮 PBS 中的颗粒。使用分光光度计重新测量浮游细胞的 OD 600，将六个 OD 600 浮游细胞的体积分配到两毫升卡扣或螺帽管中。生物膜聚合体必须分离，以允许交联器访问细胞。
浮游生物细胞处理方式与生物膜细胞相同，以减少变量。在搅拌机中使用金属珠子比玻璃组织均质器更容易分解生物膜。无菌，在每个管中加入一个灭菌金属珠。
在 30 赫兹下使用搅拌机磨机进行 5 分钟的同质化。观察聚合管，确认生物膜已分离，然后再将均质细胞转移到新的1.5毫升管中，避免金属珠。使用 PBS 将体积达到一毫升。
此时，可选地执行滴稀释以枚举输入单元格。将新鲜的甲醛分配到样品管中，最终浓度为百分之一。在旋转轮的室温下孵育30分钟。
将甘氨酸加入125毫摩尔的最终浓度，在旋转轮的室温下淬火交链接并孵育5分钟。要清洗细胞并去除多余的交联器，请以8000G的离心机进行三分钟，然后取出上一代。在蛋白酶抑制剂和500微升过滤器中重新悬浮颗粒，对PBS进行消毒。
将颗粒重新悬浮在600微升的解解缓冲液中，并在冰上孵育10分钟。将部分利酸盐移动到含有 1.4 毫升 IP 稀释缓冲液的新管中。在冰上保持一个半小时到两个小时，偶尔也会有漩涡。
一些耐磨材料可能留在管子中。然而，一个漫长的潜伏期和偶尔的涡旋将分解聚合材料，其余的将在声波过程中被打破。调谐声波器。
将 15 毫升管放在冰杯中，将探针放在管内。脉冲在20%至40%的五个声波爆发30秒和冷却之间的声波回合。细胞乳酸在声波化前会出现多云，在声波化后会变得清晰。
为了去除沉淀材料，在8000G下离心10分钟，在4度下将上分液放入新管中，避免黑颗粒。声波器能量传递和细胞类型电阻可能不同，因此建议进行声波检测，以查找能够产生下游库准备和测序所需的片段大小范围的声波化轮数。将声波DNA分配成一个1.35毫升的等分物，用于免疫沉淀和一个200微升等分作为输入DNA。
将输入控制温度控制在零下 80 摄氏度，直到去交叉链接和消化步骤。在测试抗体以确保其靶蛋白特异性后，将抗体加入免疫沉淀管，并在旋转轮上以四摄氏度过夜孵育。加入50微升的蛋白质G磁珠，在4摄氏度的旋转轮上孵育3小时。
使用磁性支架将珠子绑在管子的两侧，然后进行清洗。用 750 微升冷 IP 洗涤缓冲液洗涤两次。用 750 微升的冷 IP 洗涤缓冲液洗一个。
并在 pH 8 时用 750 微升的冷 TE 洗两次。在洗涤过程中，将管子放在磁性支架上。在每个管中加入450微升的IP洗脱缓冲液，在65摄氏度下孵育30分钟，每5分钟轻轻旋转一次。
使用磁性支架将珠子绑在管子的两侧。等待至少两分钟，直到溶液清除，然后将清除的溶液分配到新的 1.5 毫升管中。要反转交联并消化RNA，请加入两微克RNase 8，并在每管中加入0.3摩尔的最终浓度中加入氯化钠。
在65摄氏度下孵育超过6小时或过夜。要消化蛋白质，将180微克的蛋白酶K加入到每个管中，并在45摄氏度下孵育3至5小时。净化DNA
磁珠是将ChIP期间回收的少量DNA与细菌细胞隔离的首选。然而，基于柱状或苯氯仿萃取可以充分恢复ChIP DNA。纯化后，使用与所选测序平台兼容的试剂盒，从纯化的 ChIP DNA 中编写库。
ChIP DNA 库通常需要添加最小数量的适配器并执行 PCR 扩增周期的最大数量。通过生物分析器检查库大小，使用库或 QPCR 库定量套件检查库浓度。池库，然后根据所选平台的规范进行排序。
对ChIP-seq数据进行分析需要评分碱基质量、修剪低质量碱基、将装配读取与参考基因组对齐、调用峰值、将峰值与基因关联，以及分析过度表示的绑定图案。ChIP-seq 数据通常具有较低的背景级别。由免疫沉淀所针对的蛋白质控制的DNA将被丰富，并将作为至少高于背景两倍的峰值出现。
在这段视频中，我们描述了在沙门氏菌生物膜和单一浮游细胞上执行ChIP-seq的方法，这些细胞在由转录因子控制的基因中产生丰富的DNA峰值。自然界中大多数细菌生命被认为存在于生物膜中，多达40%的人类疾病被认为与生物膜有关。因此，它们产生了巨大的医疗和经济影响。
然而，生物膜具有耐药性，更难枚举、破开和操纵。研究人员可以使用我们描述的ChIP-seq技术来收获适当数量的生物膜，使生物膜均质化，lyse细胞，声波，进行免疫沉淀，纯化和序列DNA从其他生物膜形成细菌物种。
