Het ontdekken van de regulatoire doelen van CsgD in salmonella biofilm met Chromatin-immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (chip-SEQ)

Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door sequencing, of ChIP-seq, is een techniek die kan worden gebruikt om de regelgevende doelstellingen van transcriptiefactoren, histone-modificaties en andere DNA-geassocieerde eiwitten te ontdekken. In ChIP-seq worden cellen geoogst en DNA-bindend eiwit. is gekruist-gekoppeld aan DNA in vivo met formaldehyde.

Cellen worden gelysed, het vrijgeven van de celinhoud en chromatine wordt scherven in fragmenten van minder dan 1000 basisparen, meestal tussen de 200 en 600 basisparen. DNA, interactie met het doeleiwit, wordt immuunprecipiteerd met behulp van antilichaam en geïsoleerd door de-crosslinking. DNA eiwit crosslinks worden omgekeerd en RNA en eiwit worden verteerd.

Het DNA wordt gezuiverd, gemaakt in bibliotheken, en gesequenced. ChIP-seq-gegevens kunnen ook worden gebruikt om differentiële binding van transcriptiefactoren in verschillende omgevingsomstandigheden of celtypen te vinden. Aanvankelijk werd ChIP uitgevoerd door middel van hybridisatie op een microarray.

ChIP-sequencing is echter de voorkeursmethode geworden als gevolg van technologische vooruitgang, afnemende financiële belemmeringen voor sequencing en enorme gegevensproductie van hoge kwaliteit. In dit protocol zullen we technieken demonstreren voor het uitvoeren van ChIP-seq met bacteriële biofilms, een belangrijke bron van aanhoudende en chronische infecties. ChIP-seq zal worden uitgevoerd op salmonella typhimurium biofilm en planktonische cellen, gericht op de master biofilm regulator, CSGD, om differentiële binding in de twee celtypen te bepalen.

In deze video zullen we technieken demonstreren om de juiste hoeveelheid biofilm te bepalen om te oogsten, te normaliseren naar een planktonisch controlemonster, biofilm te homogeniseren voor crosslinkertoegang en routinematige ChIP-seq-stappen uit te voeren om hoogwaardige sequencing-resultaten te verkrijgen. Streak plaat salmonella enterica serveren onze typhimurium op een LB agar plaat te isoleren kolonies en uitbroeden op 37 graden Celsius 's nachts. Inenting vijf mL LB bouillon met een tot drie kolonies van de streep plaat en incubeer op 37 graden Celsius met schudden voor zeven uur of om groei te loggen.

Zoek de optische dichtheid van de kolfcultuur op 600 nanometer, met behulp van een spectrofotometer en voeg een OD 600 equivalent van celcultuur of 10 aan de negen cellen aan een Erlenmeyer fles met 100 milliliter van een procent tryptone. Incubeer bij 28 graden Celsius met schudden voor 13 uur. Biofilm cellen verschijnen als geaggregeerde vlokken en enkele planktoncellen zijn in de troebele media.

Biofilm zijn zeer resistent en vasthouden aan de zijkanten van buizen en pipet tips. We gebruiken geconditioneerde media om biofilm in eerste instantie te verplaatsen en gebruik maken van warme PBS vlak voor crosslinking om eiwit crosslinking substraten in de media te verwijderen. Onderzoekers kunnen nodig zijn om een geschikte oplossing te vinden om opnieuw op te schorten biofilm in.

Verzamel de kolfcultuur in een centrifugebuis en centrifuge op 12.000 G gedurende 10 minuten bij 10 graden Celsius. Decanteer de supernatant in een filterunit van 0,2 micrometer en vacuümfilter. Aliquot fles cultuur in buizen en centrifuge op lage snelheid om de twee celtypes te scheiden.

Biofilm cellen zijn in de pellet aan de onderkant van de buis en enkele cellen zijn in de troebele supernatant. Pipette de supernatant met planktonische cellen in een centrifuge buis voor later. 25 microgram DNA wordt aanbevolen als input voor ChIP-seq experimenten.

In ons geval levert 30 milligram biofilm ongeveer 25 microgram DNA op. Aangezien biofilmaggregaten een overvloed aan eiwithoudend extracellulair materiaal hebben, concurreert het om crosslinker en kan het resulteren in ongelijke crosslinked product gepresenteerd voor immunoprecipitatie. Een eiwittest om gelijkwaardig celmateriaal door eiwitconcentratie te bepalen wordt voorgesteld.

In dit geval worden zes OD 600 planktoncellen geoogst als een controle voor 30 milligram biofilm. Biofilm wordt geoogst door nat gewicht en de kolonie landbouw eenheden van biofilm kan worden gevonden met behulp van de conversie factor getoond. Onderzoekers worden aangemoedigd om de conversiefactor te vinden van de biofilmvormende soorten waarmee ze werken door homogenisatie en druppelverdunningen.

Schors de biofilmpellet opnieuw in een milliliter geconditioneerde tryptone en ga naar een voorgewogen twee milliliter snap cap of een schroefdopbuis. Centrifuge gedurende een minuut op 11,000 G.Verwijder de supernatant uit de buis en weeg de buis nauwkeurig. Trek het buisgewicht af van het gewicht van de buis met biofilm om het gewicht van aggregaten te vinden.

Het moet binnen 10% van de beoogde biofilm gewicht. Voeg een milliliter PBS en vortex toe om biofilmaggregaten opnieuw op te schorten. Doe de supernatant van langzame snelheid centrifugatie in centrifugebuizen.

Meet de optische dichtheid van de planktoncellen op 600 nanometer met behulp van een spectrofotometer en bereken het vereiste volume voor een laatste OD 600 van zes. Koel de Flora centrifuge tot 10 graden Celsius en pellet de planktoncellen met behulp van de Flora centrifuge. Centrifuge op 10.000 G gedurende 10 minuten bij 10 graden Celsius.

Verwijder de supernatant en hang de pellet opnieuw op in PBS. Hermeting van de OD 600 van de planktoncellen met behulp van een spectrofotometer en het volume van zes OD 600 planktoncellen in een twee milliliter snap cap of schroefdop buis. Biofilm aggregaten moeten uit elkaar worden gehaald om crosslinker toegang te geven tot cellen.

Planktoncellen worden op dezelfde manier behandeld als biofilmcellen om variabelen te verminderen. Het gebruik van metalen kralen in een mixer molen kan effectiever zijn voor het breken van biofilm dan glasweefsel homogenisatoren. Aseptisch, voeg een gesteriliseerde metalen kraal aan elk van de buizen.

Homogeniseren met behulp van een mengmolen gedurende vijf minuten op 30 Hertz. Observeer geaggregeerde buizen om te bevestigen dat de biofilm is afgebroken voordat de gehomogeniseerde cellen naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter worden overgebracht, waardoor de metalen kraal wordt vermeden. Breng het volume naar een milliliter met PBS.

Op dit punt is het optioneel om druppelverdunningen uit te voeren om invoercellen op te sommen. Breng verse formaldehyde in monsterbuizen af tot een uiteindelijke concentratie van één procent. 30 minuten incuren bij kamertemperatuur op een draaiend wiel.

Voeg glycine toe aan een laatste concentratie van 125 millimolar om kruisverband te blussen en vijf minuten bij kamertemperatuur op een draaiend wiel uit te broeden. Om de cellen te wassen en overtollige crosslinker te verwijderen, centrifugeer gedurende drie minuten op 8,000 G en verwijder de supernatant. Schort de pellet opnieuw op in proteaseremmers en 500 microliter filtergesteriliseerde PBS.

Stel de pellet opnieuw op in 600 microliters lysebuffer en incubbate op ijs gedurende 10 minuten. Verplaats het gedeeltelijke lysaat naar een nieuwe buis met 1,4 milliliter IP-verdunningsbuffer. Blijf op ijs voor anderhalf tot twee uur en vortex af en toe.

Er kan een resistent materiaal in de buizen achterblijven. Echter, een lange incubatietijd en af en toe vortexing zal breken geaggregeerde materiaal en de rest zal worden gebroken tijdens sonicatie. Stem de sonicator af.

Plaats de buis van 15 milliliter in een bekerglas ijs en plaats de sonde in de buis. Pulse op 20 tot 40 procent voor vijf sonicatie uitbarstingen van 30 seconden en koel tussen sonicatie rondes. De cel lysate zal verschijnen troebel voor sonicatie en zal duidelijk verschijnen na sonicatie.

Om neergeslagen materiaal te verwijderen, centrifuge op 8, 000 G gedurende 10 minuten op vier graden en de supernatant in een nieuwe buis, het vermijden van de zwarte pellet. Sonicator energieoverdracht en celtypeweerstand kunnen verschillen, zodat een sonicatietest wordt aanbevolen om het aantal sonicatierondes te vinden dat het fragmentgroottebereik zal produceren dat nodig is voor downstream bibliotheekvoorbereiding en -sequencing. Doseer gesoniceerd DNA in één 1,35 milliliter aliquot voor immunoprecipitatie en één 200 microliter aliquot als input-DNA.

Houd de invoercontrole op min 80 graden Celsius tot de-crosslinking en verteren stappen. Na het testen van de antilichamen om hun specificiteit voor het doeleiwit te waarborgen, voeg het antilichaam toe aan immunoprecipitatiebuizen en incubbate bij vier graden Celsius 's nachts op een roterend wiel. Voeg 50 microliter eiwit G magnetische kralen en incubeer op vier graden Celsius op een roterend wiel gedurende drie uur.

Bind de kralen aan de zijkanten van buizen met behulp van een magnetische standaard en voer wasbeurten uit. Was twee keer met 750 microliters koude IP-wasbuffer een. Was een met 750 microliters van koude IP wasbuffer twee.

En was twee keer met 750 microliters koude TE bij pH acht. Houd de buizen op de magnetische standaard tijdens de wasbeurten. Voeg 450 microliters IP elution buffer toe aan elke buis en broed gedurende 30 minuten in op 65 graden Celsius met zachte vortexing om de vijf minuten.

Bind de kralen aan de zijkanten van buizen met behulp van een magnetische standaard. Wacht ten minste twee minuten tot de oplossing duidelijk is en geef vervolgens de gewiste oplossing af aan een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Om crosslinks om te keren en RNA te verteren, voeg twee microgram RNase acht toe en voeg natriumchloride toe aan uw uiteindelijke concentratie van 0,3 molaire in elke buis.

Incubeer op 65 graden Celsius voor meer dan zes uur of 's nachts. Om eiwit te verteren, voeg 180 microgram proteinase K toe aan elke buis en broed gedurende drie tot vijf uur in op 45 graden Celsius. Zuiver het DNA.

Magnetische kralen hebben de voorkeur voor het isoleren van de kleine hoeveelheden DNA teruggevonden tijdens ChIP met bacteriële cellen. Echter, kolom gebaseerde of fenylchloroform extractie kan adequaat herstellen ChIP DNA. Na zuivering worden bibliotheken bereid uit gezuiverd ChIP-DNA met behulp van een kit die compatibel is met het geselecteerde sequencing-platform.

ChIP DNA-bibliotheken vereisen vaak het toevoegen van de minimale hoeveelheid adapters en het uitvoeren van het maximale aantal PCR-versterkingscycli. Controleer de grootte van de bibliotheek door een bioanalyzer en controleer de concentratie van de bibliotheek met een cubit of een QPCR-bibliotheekkwantificeringskit. Bundel de bibliotheken en ga verder met sequencing volgens de specificatie van het geselecteerde platform.

Analyse van ChIP-seq-gegevens vereist scoringsbasiskwaliteit, het trimmen van lage kwaliteit bases, het afstemmen van een assemblage leest op een referentiegenoom, roept pieken aan, associeert pieken met genen en analyseert oververtegenwoordigde bindingsmotieven. ChIP-seq-gegevens hebben meestal een laag achtergrondniveau. DNA dat wordt gecontroleerd door het eiwit gericht op immunoprecipitatie zal worden verrijkt en zal verschijnen als pieken die ten minste twee keer boven de achtergrond.

In deze video hebben we methoden beschreven om ChIP-seq uit te voeren op salmonella biofilm en enkele planktoncellen die pieken van verrijkt DNA oplevert bij genen gecontroleerd door de transcriptiefactor van belang. De meerderheid van bacteriële leven in de natuur wordt gedacht te bestaan in biofilms en tot 40% van de menselijke ziekten worden verondersteld te zijn biofilm gerelateerd. Ze hebben dus enorme medische en economische gevolgen.

Biofilm is echter resistent en moeilijker op te sommen, open te breken en te manipuleren. Onderzoekers kunnen de ChIP-seq technieken gebruiken die we beschreven hebben om een geschikte hoeveelheid biofilm te oogsten, de biofilm te homogeniseren, cellen te lyse, sonicaat, immunoprecipitatie uit te voeren, DNA te zuiveren en te sequentie van andere biofilmvormende bacteriële soorten.