Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung, oder ChIP-Seq, ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die regulatorischen Ziele von Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen und anderen DNA-assoziierten Proteinen zu entdecken. In ChIP-seq werden Zellen geerntet und DNA-bindendes Protein. mit Formaldehyd mit DNA in vivo verbunden ist.

Die Zellen werden lysiert, der Zellinhalt freisetzt und Chromatin wird in Fragmente von weniger als 1000 Basenpaaren, in der Regel zwischen 200 und 600 Basenpaaren, geschert. DIE DNA, die mit dem Zielprotein interagiert, wird mit Antikörpern immunpräzipiert und durch De-Vernetzung isoliert. DNA-Protein-Kreuzverbindungen werden umgekehrt und RNA und Protein verdaut.

Die DNA wird gereinigt, in Bibliotheken umgewandelt und sequenziert. ChIP-seq-Daten können auch verwendet werden, um differentiale Bindung von Transkriptionsfaktoren in verschiedenen Umgebungsbedingungen oder Zelltypen zu finden. Zunächst wurde ChIP durch Hybridisierung auf einem Mikroarray durchgeführt.

Die ChIP-Sequenzierung ist jedoch aufgrund technologischer Fortschritte, abnehmender finanzieller Hindernisse für die Sequenzierung und einer massiven qualitativ hochwertigen Datenausgabe zur bevorzugten Methode geworden. In diesem Protokoll zeigen wir Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, einer der Hauptursachen für anhaltende und chronische Infektionen. ChIP-seq wird auf Salmonellentyphimurium-Biofilm und planktonischen Zellen durchgeführt werden, die auf den Master-Biofilm-Regulator, CSGD, abzielen, um die Differentialbindung in den beiden Zelltypen zu bestimmen.

In diesem Video zeigen wir Techniken zur Bestimmung der geeigneten Menge an Biofilm für die Ernte, zur Normalisierung zu einer planktonischen Kontrollprobe, zur Homogenisierung von Biofilm für den Anschlusszugriff und zur Durchführung routinemäßiger ChIP-Seq-Schritte, um qualitativ hochwertige Sequenzierungsergebnisse zu erzielen. Streak Platte Salmonella enterica dienen unserem Typhimurium auf einer LB Agarplatte, um Kolonien zu isolieren und bei 37 Grad Celsius über Nacht zu brüten. Fünf mL LB Brühe mit ein bis drei Kolonien von der Streifenplatte impfen und bei 37 Grad Celsius mit Schütteln für sieben Stunden bebrüten oder DasWachstum protokollieren.

Finden Sie die optische Dichte der Kolbenkultur bei 600 Nanometern, indem Sie ein Spektralphotometer verwenden, und fügen Sie ein OD 600-Äquivalent der Zellkultur oder 10 zu den neun Zellen zu einem Erlenmeyerkolben hinzu, der 100 Milliliter eines Prozenttryptons enthält. Bei 28 Grad Celsius mit Schütteln 13 Stunden bebrüten. Biofilmzellen erscheinen als aggregierte Flocken und einzelne planktonische Zellen befinden sich in den trüben Medien.

Biofilm sind sehr widerstandsfähig und kleben an den Seiten von Rohren und Pipettenspitzen. Wir verwenden konditionierte Medien, um Biofilm zunächst zu bewegen und verwenden warme PBS unmittelbar vor der Vernetzung, um Proteinvernetzungssubstrate in den Medien zu entfernen. Forscher müssen möglicherweise eine geeignete Lösung finden, um Biofilm wieder in suspendieren.

Sammeln Sie die Kolbenkultur in einem Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 12.000 G für 10 Minuten bei 10 Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand in eine 0,2 Mikrometer-Filtereinheit und einen Vakuumfilter. Aliquot Kolbenkultur in Röhren und Zentrifuge mit langsamer Geschwindigkeit, um die beiden Zelltypen zu trennen.

Biofilmzellen befinden sich im Pellet am Boden der Röhre und einzelne Zellen im trüben Überstand. Pipette der Überstand, der planktonische Zellen enthält, in ein Zentrifugenrohr für später. 25 Mikrogramm DNA werden als Input für ChIP-seq-Experimente empfohlen.

In unserem Fall ergeben 30 Milligramm Biofilm etwa 25 Mikrogramm DNA. Da Biofilmaggregate eine Fülle von proteinhaltigem extrazellulärem Material haben, konkurriert es um Vernetzen und kann zu ungleichen vernetzten Produkten führen, die für die Immunpräzipitation präsentiert werden. Es wird ein Proteintest zur Bestimmung des äquivalenten Zellmaterials durch Proteinkonzentration vorgeschlagen.

In diesem Fall werden sechs OD 600 planktonische Zellen als Kontrolle für 30 Milligramm Biofilm geerntet. Biofilm wird durch Nassgewicht geerntet und die Koloniezuchteinheiten des Biofilms können mit dem gezeigten Umrechnungsfaktor gefunden werden. Die Forscher werden ermutigt, den Umrechnungsfaktor der Biofilmbildenden Arten zu finden, mit denen sie durch Homogenisierung und Tropfenverdünnungen arbeiten.

Das Biofilmpellet in einem Milliliter konditioniertem Trypton wieder aufhängen und in eine vorgewogene Zwei-Milliliter-Snap-Cap oder ein Schraubverschlussrohr bewegen. Zentrifuge für eine Minute bei 11.000 G. Entfernen Sie den Überstand aus dem Rohr und wiegen Sie das Rohr genau. Subtrahieren Sie das Rohrgewicht vom Gewicht des Rohres mit Biofilm, um das Gewicht der Aggregate zu finden.

Es sollte innerhalb von 10% des Ziel-Biofilmgewichts liegen. Fügen Sie einen Milliliter PBS und Wirbel hinzu, um Biofilmaggregate wieder aufzuhängen. Geben Sie den Überstand aus der langsamen Geschwindigkeitszentrifugation in Zentrifugenrohre.

Messen Sie die optische Dichte der planktonischen Zellen mit einem Spektralphotometer bei 600 Nanometern und berechnen Sie das benötigte Volumen für eine endgültige OD 600 von sechs. Kühlen Sie die Flora-Zentrifuge auf 10 Grad Celsius und pellet die planktonischen Zellen mit der Flora-Zentrifuge. Zentrifuge bei 10.000 G für 10 Minuten bei 10 Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in PBS wieder auf. Messen Sie die OD 600 der planktonischen Zellen mit einem Spektralphotometer neu und geben Sie das Volumen von sechs PLANktonzellen OD 600 in ein zwei Milliliter-Snapcap oder Schraubverschlussrohr. Biofilmaggregate müssen auseinandergebrochen werden, damit vernetzende Zellen zugreifen können.

Planktonische Zellen werden auf die gleiche Weise behandelt wie Biofilmzellen, um Variablen zu reduzieren. Die Verwendung von Metallperlen in einer Mischermühle kann effektiver sein, um Biofilm aufzubrechen als Glasgewebehomogenisatoren. Aseptisch, fügen Sie eine sterilisierte Metallperle zu jedem der Rohre.

Mit einer Mischmühle fünf Minuten lang bei 30 Hertz homogenisieren. Beobachten Sie Aggregatrohre, um zu bestätigen, dass der Biofilm auseinandergebrochen wurde, bevor Sie die homogenisierten Zellen in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr übertragen, wodurch die Metallperle vermieden wird. Bringen Sie das Volumen mit PBS auf einen Milliliter.

An diesem Punkt ist es optional, Tropfenverdünnungen durchzuführen, um Eingabezellen aufzuzählen. Frisches Formaldehyd in Probenröhrchen auf eine Endkonzentration von einem Prozent geben. 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad inkubieren.

Glycin zu einer Endkonzentration von 125 Millimolar hinzufügen, um die Vernetzung zu löschen und fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad zu brüten. Um die Zellen zu waschen und überschüssigen Vernetzen zu entfernen, Zentrifugieren Sie für drei Minuten bei 8.000 G und entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in Protease-Inhibitoren und 500 Mikroliter Filter sterilisierte PBS wieder aus.

Das Pellet in 600 Mikroliter Lysepuffer wieder aufhängen und 10 Minuten auf Eis brüten. Verschieben Sie das Partilysat in ein neues Rohr, das 1,4 Milliliter IP-Verdünnungspuffer enthält. Eineinhalb bis zwei Stunden auf Eis halten und gelegentlich Wirbel machen.

Einige widerstandsfähige Materialien können in den Rohren verbleiben. Eine lange Inkubationszeit und gelegentliche Wirbel werden jedoch aggregiertes Material auseinanderbrechen und der Rest wird während der Beschallung gebrochen. Tune den Beschallungsgerät.

Legen Sie die 15 Milliliter Tube in einen Becher Eis und legen Sie die Sonde in die Röhre. Puls bei 20 bis 40 Prozent für fünf Beschallungsausbrüche von 30 Sekunden und kühlen zwischen Beschallungsrunden ab. Das Zelllysat erscheint vor der Beschallung trüb und nach der Beschallung klar.

Um ausgefälltes Material zu entfernen, Zentrifuge bei 8 000 G für 10 Minuten bei vier Grad und geben Sie den Überstand in ein neues Rohr, um das schwarze Pellet zu vermeiden. Die Energieübertragung von Sonicator und der Zelltypwiderstand können unterschiedlich sein, sodass ein Beschallungstest empfohlen wird, um die Anzahl der Beschallungsrunden zu ermitteln, die den Fragmentgrößenbereich erzeugen, der für die Nachflussbibliotheksvorbereitung und -sequenzierung erforderlich ist. Geben Sie beschallte DNA in ein 1,35 Milliliter Aliquot für Immunpräzipitation und einen 200-Mikroliter-Aliquot als Eingabe-DNA.

Halten Sie die Eingabesteuerung bei minus 80 Grad Celsius, bis die Schritte zum Entnetzen und Verdauen deaktiviert werden. Nach dem Testen der Antikörper, um ihre Spezifität für das Zielprotein zu gewährleisten, fügen Sie den Antikörper zu Immunpräzipitationsröhrchen hinzu und brüten bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem rotierenden Rad. 50 Mikroliter Protein G-Magnetperlen hinzufügen und bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad drei Stunden lang brüten.

Binden Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer an die Seiten von Rohren und führen Sie Wähvorgänge durch. Zweimal mit 750 Mikroliter kaltem IP-Waschpuffer waschen. Waschen Sie einen mit 750 Mikroliter kalten IP-Waschpuffer zwei.

Und zweimal mit 750 Mikroliter kaltem TE bei pH-Wert acht waschen. Halten Sie die Rohre während der Wähzweiungen auf dem magnetischen Ständer. Fügen Sie 450 Mikroliter IP-Elutionspuffer in jede Röhre und inkubieren bei 65 Grad Celsius für 30 Minuten mit sanften Wirbeln alle fünf Minuten.

Binden Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer an die Seiten von Rohren. Warten Sie mindestens zwei Minuten, bis die Lösung klar ist, und geben Sie die gelöschte Lösung dann auf ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Um Kreuzverbindungen umzukehren und RNA zu verdauen, fügen Sie zwei Mikrogramm RNase acht hinzu und fügen Sie Natriumchlorid zu Ihrer Endkonzentration von 0,3 Mol in jeder Röhre hinzu.

Bei 65 Grad Celsius für mehr als sechs Stunden oder über Nacht inkubieren. Um Protein zu verdauen, fügen Sie 180 Mikrogramm Proteinase K in jede Röhre und inkubieren bei 45 Grad Celsius für drei bis fünf Stunden. Reinigen Sie die DNA.

Magnetische Perlen werden bevorzugt für die Isolierung der kleinen Mengen an DNA während ChIP mit Bakterienzellen zurückgewonnen. Eine säulenbasierte oder phenylchlorforme Extraktion kann jedoch die ChIP-DNA angemessen wiederherstellen. Nach der Reinigung werden Bibliotheken aus gereinigter ChIP-DNA mit einem Kit hergestellt, das mit der ausgewählten Sequenzierungsplattform kompatibel ist.

ChIP-DNA-Bibliotheken erfordern häufig das Hinzufügen der minimalen Anzahl von Adaptern und die maximale Anzahl von PCR-Verstärkungszyklen. Überprüfen Sie die Bibliotheksgröße mit einem Bioanalyzer und überprüfen Sie die Bibliothekskonzentration mit einem Cubit oder einem QPCR-Bibliotheksquantifizierungskit. Bündeln Sie die Bibliotheken, und fahren Sie mit der Sequenzierung gemäß der Spezifikation der ausgewählten Plattform fort.

Die Analyse von ChIP-seq-Daten erfordert die Bewertung der Basisqualität, das Trimmen von Basen von geringer Qualität, das Ausrichten einer Assembly liest sich an einem Referenzgenom, ruft Spitzen auf, assoziiert Spitzen mit Genen und analysiert überrepräsentierte Bindungsmotive. ChIP-seq-Daten haben in der Regel einen niedrigen Hintergrund. DNA, die durch das Protein kontrolliert wird, das durch Immunpräzipitation angegriffen wird, wird angereichert und erscheint als Spitzen, die mindestens zweifach über dem Hintergrund liegen.

In diesem Video haben wir Methoden beschrieben, um ChIP-seq auf Salmonellen-Biofilm und einzelnen planktonischen Zellen durchzuführen, die Spitzen der angereicherten DNA bei Genen ergeben, die durch den Transkriptionsfaktor von Interesse gesteuert werden. Der Großteil des bakteriellen Lebens in der Natur wird angenommen, dass in Biofilmen vorhanden ist und bis zu 40% der menschlichen Krankheiten werden angenommen, dass biofilmbedingt. Sie haben also enorme medizinische und wirtschaftliche Auswirkungen.

Biofilm ist jedoch resistent und schwieriger aufzuzählen, aufzubrechen und zu manipulieren. Die Forscher können die von uns beschriebenen ChIP-Seq-Techniken verwenden, um eine angemessene Menge an Biofilm zu ernten, den Biofilm zu homogenisieren, Lysezellen zu homogenisieren, zu beschallen, Immunpräzipitation durchzuführen, DNA von anderen biofilmbildenden Bakterienarten zu reinigen und zu sequenzieren.