7.1K Views
•
13:48 min
•
January 18th, 2020
DOI :
January 18th, 2020
•0:00
Title
2:01
Protocol
12:04
Results
12:41
Conclusion
Transcript
क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन अनुक्रमण, या ChIP-seq के बाद, एक तकनीक है कि प्रतिलेखन कारकों, हिस्टोन संशोधनों, और अन्य डीएनए से जुड़े प्रोटीन के नियामक लक्ष्यों की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सीआईपी-सेक्यू में कोशिकाओं को काटा जाता है और डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन दिया जाता है । फॉर्मलडिहाइड के साथ वीवो में डीएनए से पार किया जाता है।
कोशिकाओं को lysed कर रहे हैं, सेल सामग्री जारी करने और क्रोमेटिन से कम १० आधार जोड़े के टुकड़ों में कतरनी है, आमतौर पर २०० और ६०० आधार जोड़े के बीच । डीएनए, लक्षित प्रोटीन के साथ बातचीत, एंटीबॉडी का उपयोग कर इम्यूनोप्रिपिटेटेड है और डी-क्रॉसलिंकिंग द्वारा अलग किया जाता है। डीएनए प्रोटीन क्रॉसलिंक उलट जाते हैं और आरएनए और प्रोटीन पचा जाते हैं।
डीएनए शुद्ध है, पुस्तकालयों में बनाया है, और अनुक्रम । ChIP-seq डेटा का उपयोग विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों या सेल प्रकारों में प्रतिलेखन कारकों के अंतर बाध्यकारी खोजने के लिए भी किया जा सकता है। प्रारंभ में, सीआईपी को माइक्रोएरे पर संकरण के माध्यम से किया गया था।
हालांकि, तकनीकी प्रगति, अनुक्रमण के लिए वित्तीय बाधाओं को कम करने, और बड़े पैमाने पर उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पादन के कारण ChIP-अनुक्रमण पसंदीदा तरीका बन गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के साथ ChIP-seq प्रदर्शन करने की तकनीकों का प्रदर्शन करेंगे, जो लगातार और पुराने संक्रमणों का एक प्रमुख स्रोत है। ChIP-seq साल्मोनेला टाइपिम्यूरियम बायोफिल्म और प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जाएगा, मास्टर बायोफिल्म नियामक, सीएसजीडी को लक्षित करने के लिए, दो सेल प्रकारों में अंतर बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए ।
इस वीडियो में, हम फसल के लिए बायोफिल्म की उचित मात्रा निर्धारित करने, एक प्लैंक्टोनिक नियंत्रण नमूने को सामान्य करने, क्रॉसलिंकर एक्सेस के लिए बायोफिल्म को समरूप बनाने और उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए नियमित ChIP-seq कदम प्रदर्शन करने की तकनीकों का प्रदर्शन करेंगे। लकीर प्लेट साल्मोनेला एंटिका कालोनियों को अलग करने और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए एक पौंड आगर प्लेट पर हमारे टाइपहिमुरियम की सेवा करते हैं । लकीर की थाली से एक से तीन कालोनियों के साथ पांच एमएल पौंड शोरबा टीका और सात घंटे के लिए मिलाते हुए या विकास लॉग इन करने के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 नैनोमीटर पर फ्लास्क संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व का पता लगाएं और एक ओडी 600 सेल संस्कृति के बराबर या नौ कोशिकाओं को नौ कोशिकाओं में 10 जोड़ें जिसमें एक प्रतिशत ट्राइप्टोन के 100 मिलीलीटर होते हैं। 13 घंटे तक झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । बायोफिल्म कोशिकाएं एकत्रित गुच्छे के रूप में दिखाई देती हैं और एकल प्लैंक्टोनिक कोशिकाएं बादल मीडिया में होती हैं।
बायोफिल्म अत्यधिक प्रतिरोधी हैं और ट्यूबों और पिपेट युक्तियों के किनारों से चिपके रहते हैं। हम शुरू में बायोफिल्म को स्थानांतरित करने के लिए वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करते हैं और मीडिया में प्रोटीन क्रॉसलिंकिंग सब्सट्रेट्स को हटाने के लिए क्रॉसलिंकिंग से तुरंत पहले गर्म पीबीएस का उपयोग करते हैं। शोधकर्ताओं को बायोफिल्म को फिर से निलंबित करने के लिए एक उपयुक्त समाधान खोजने की आवश्यकता हो सकती है ।
10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12, 000 G पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में फ्लास्क संस्कृति लीजिए । सुपरनेट को 0.2 माइक्रोमीटर फिल्टर यूनिट और वैक्यूम फिल्टर में डिमांट करें। दो सेल प्रकारों को अलग करने के लिए धीमी गति से ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में अलीकोट फ्लास्क संस्कृति।
बायोफिल्म कोशिकाएं ट्यूब के नीचे पैलेट में होती हैं और सिंगल सेल्स बादल सुपरनेट में होते हैं । बाद के लिए एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं युक्त सुपरनेटेट। 25 माइक्रोग्राम डीएनए की सिफारिश की जाती है जो ChIP-seq प्रयोगों के लिए इनपुट के रूप में होता है।
हमारे मामले में, 30 मिलीग्राम बायोफिल्म डीएनए के लगभग 25 माइक्रोग्राम उपज । चूंकि बायोफिल्म समुच्चय में प्रोटीनसीय बाह्य बाह्य सामग्री की बहुतायत होती है, इसलिए यह क्रॉसलिंकर के लिए प्रतिस्पर्धा करता है और इसके परिणामस्वरूप इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के लिए प्रस्तुत असमान क्रॉसलिंक उत्पाद हो सकता है। प्रोटीन एकाग्रता द्वारा समकक्ष सेल सामग्री निर्धारित करने के लिए एक प्रोटीन परख का सुझाव दिया जाता है।
इस मामले में, बायोफिल्म के 30 मिलीग्राम के लिए नियंत्रण के रूप में छह ओडी 600 प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को काटा जाता है। बायोफिल्म को गीले वजन से काटा जाता है और बायोफिल्म की कॉलोनी कृषि इकाइयों को दिखाए गए रूपांतरण कारक का उपयोग करके पाया जा सकता है। शोधकर्ताओं को बायोफिल्म बनाने वाली प्रजातियों के रूपांतरण कारक को खोजने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जो वे समरूपता और ड्रॉप कमजोर पड़ने के साथ काम करते हैं।
वातानुकूलित ट्राइप्टोन के एक मिलीलीटर में बायोफिल्म गोली को फिर से निलंबित करें और एक पूर्व-तौला दो मिलीलीटर स्नैप कैप या स्क्रू कैप ट्यूब में चले जाएं। 11, 000 जी पर एक मिनट के लिए सेंट्रलाइज ट्यूब से सुपरनेट निकालें और ट्यूब का सही वजन करें। समुच्चय के वजन को खोजने के लिए बायोफिल्म के साथ ट्यूब के वजन से ट्यूब वजन घटाएं।
यह लक्ष्य बायोफिल्म वजन के 10% के भीतर होना चाहिए। बायोफिल्म समुच्चय को फिर से निलंबित करने के लिए पीबीएस और भंवर का एक मिलीलीटर जोड़ें। धीमी गति से अपकेंद्री से अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सुपरनेट बांटना।
एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 600 नैनोमीटर पर प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं के ऑप्टिकल घनत्व को मापें और छह में से अंतिम ओडी 600 के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। फ्लोरा सेंट्रलाइज को 10 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और फ्लोरा सेंट्रलाइज का इस्तेमाल करते हुए प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को गोली दें । 10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10, 000 ग्राम पर सेंट्रलाइज ।
सुपरनेट निकालें और पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं के ओडी 600 को फिर से मापा जाता है और छह ओडी 600 प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं की मात्रा को दो मिलीलीटर स्नैप कैप या स्क्रू कैप ट्यूब में वितरित करता है। बायोफिल्म समुच्चय को क्रॉसलिंकर को कोशिकाओं तक पहुंचने की अनुमति देने के अलावा तोड़ा जाना चाहिए।
प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को चर को कम करने के लिए बायोफिल्म कोशिकाओं के समान ही माना जाता है। एक मिक्सर मिल में धातु मोतियों का उपयोग कांच के ऊतकों समरूपता की तुलना में अलग बायोफिल्म को तोड़ने के लिए अधिक प्रभावी हो सकता है। aseptically, प्रत्येक ट्यूब में एक निष्फल धातु मनका जोड़ें।
30 हर्ट्ज में पांच मिनट के लिए एक मिक्सर मिल का उपयोग कर समरूप। इस बात की पुष्टि करने के लिए कुल ट्यूबों का निरीक्षण करें कि धातु मनका से बचने के लिए होमोजेनाइज्ड कोशिकाओं को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले बायोफिल्म को अलग कर दिया गया है। पीबीएस के साथ एक मिलीलीटर के लिए मात्रा लाओ।
इस बिंदु पर, इनपुट कोशिकाओं की गणना करने के लिए ड्रॉप कमजोर करने का कार्य करना वैकल्पिक है। एक प्रतिशत की अंतिम एकाग्रता के लिए नमूना ट्यूबों में ताजा फॉर्मलडिहाइड वितरित करें। एक घूर्णन पहिया पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
एक घूर्णन पहिया पर कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए क्रॉस-लिंकिंग और इनक्यूबेट करने के लिए 125 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता में ग्लाइसिन जोड़ें। कोशिकाओं को धोने और अतिरिक्त क्रॉसलिंकर को हटाने के लिए, 8, 000 जी पर तीन मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सुपरनेट को हटा दें। प्रोटीज अवरोधकों और फिल्टर निष्फल पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
लाइसिस बफर के 600 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। आंशिक रूप से एक नई ट्यूब पर ले जाएं जिसमें आईपी कमजोर पड़ने वाले बफर के 1.4 मिलीलीटर होते हैं। डेढ़ से दो घंटे तक बर्फ पर रखें और कभी-कभी भंवर।
कुछ प्रतिरोधी सामग्री ट्यूबों में रह सकती है। हालांकि, एक लंबी इनक्यूबेशन अवधि और कभी-कभी भंवर के अलावा एकत्रित सामग्री टूट जाएगी और शेष को सोनीफिकेशन के दौरान तोड़ दिया जाएगा। सोनिकेटर ट्यून करें।
15 मिलीलीटर ट्यूब को बर्फ की एक बीकर में रखें और जांच को ट्यूब के अंदर रखें। 30 सेकंड के पांच सोनिकेशन फटने के लिए 20 से 40 प्रतिशत पर पल्स और सोनीशन राउंड के बीच शांत। सेल लमेट से पहले बादल दिखाई देंगे और सोनीफिकेशन के बाद स्पष्ट दिखाई देंगे।
उपजी सामग्री को हटाने के लिए, चार डिग्री पर 10 मिनट के लिए 8, 000 जी पर अपकेंद्रित्र और काले गोली से बचने, एक नई ट्यूब में supernatant बांटना । सोनिकेटर ऊर्जा हस्तांतरण और सेल प्रकार प्रतिरोध अलग हो सकता है इसलिए एक सोनीशन परख को सोनीशन राउंड की संख्या खोजने की सिफारिश की जाती है जो डाउनस्ट्रीम लाइब्रेरी तैयार करने और अनुक्रमण के लिए आवश्यक खंड आकार सीमा का उत्पादन करेगा। इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के लिए एक 1.35 मिलीलीटर एलिकोट और इनपुट डीएनए के रूप में 1 200 माइक्रोलीटर एलिकोट में ध्वनियुक्त डीएनए वितरित करें।
इनपुट नियंत्रण को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि डी-क्रॉसलिंकिंग और पचाने के कदम न हो जाए। लक्ष्य प्रोटीन के लिए अपनी विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए एंटीबॉडी का परीक्षण करने के बाद, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन ट्यूबों में एंटीबॉडी जोड़ें और एक घूर्णन पहिया पर रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और तीन घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
मोतियों को चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके ट्यूबों के किनारों पर बांधें और वॉश करें। कोल्ड आईपी वॉश बफर वन के 750 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं। कोल्ड आईपी वॉश बफर दो के 750 माइक्रोलीटर के साथ एक धोएं।
और पीएच आठ में ठंडे ते के ७५० माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं । वॉश के दौरान ट्यूबों को मैग्नेटिक स्टैंड पर रखें। प्रत्येक ट्यूब में आईपी एल्यूशन बफर के 450 माइक्रोलीटर जोड़ें और हर पांच मिनट में कोमल भंवर के साथ 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
मोतियों को चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके ट्यूबों के किनारों पर बांधें। समाधान स्पष्ट होने तक कम से कम दो मिनट प्रतीक्षा करें और फिर एक नए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्वीकृत समाधान वितरित करें। क्रॉसलिंक को रिवर्स करने और आरएनए को पचाने के लिए, आरएनएएस आठ के दो माइक्रोग्राम जोड़ें और प्रत्येक ट्यूब में 0.3 मोलर की अपनी अंतिम एकाग्रता में सोडियम क्लोराइड जोड़ें।
छह घंटे से अधिक या रात भर के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । प्रोटीन को पचाने के लिए, प्रत्येक ट्यूब में 180 माइक्रोग्राम प्रोटीन के जोड़ें और तीन से पांच घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। डीएनए को शुद्ध करें।
बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ ChIP के दौरान बरामद डीएनए की छोटी मात्रा को अलग करने के लिए चुंबकीय मोती पसंद किए जाते हैं । हालांकि, कॉलम आधारित या फेनिल्हलोफॉर्म निष्कर्षण पर्याप्त रूप से Chip डीएनए ठीक हो सकता है। शुद्धिकरण के बाद, पुस्तकालयों को शुद्ध सीआईपी डीएनए से एक किट का उपयोग करके तैयार किया जाता है जो चयनित अनुक्रमण मंच के साथ संगत है।
ChIP डीएनए पुस्तकालयों अक्सर एडाप्टर की न्यूनतम राशि जोड़ने और पीसीआर प्रवर्धन चक्र की अधिकतम संख्या प्रदर्शन की आवश्यकता होती है । एक बायोएनालाइजर द्वारा पुस्तकालय के आकार की जांच करें और एक क्यूबिट या क्यूपीसीआर लाइब्रेरी क्वांटिफिकेशन किट के साथ पुस्तकालय एकाग्रता की जांच करें। पुस्तकालयों पूल और चयनित मंच के विनिर्देश के अनुसार अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ें।
ChIP-seq डेटा के विश्लेषण के लिए स्कोरिंग बेस गुणवत्ता की आवश्यकता होती है, कम गुणवत्ता वाले ठिकानों को ट्रिम करना, एक असेंबली को संरेखित करना एक संदर्भ जीनोम में पढ़ता है, चोटियों को बुलाना, चोटियों को जीन के साथ जोड़ना, और अधिक प्रतिनिधित्व वाले बाध्यकारी रूपांकनों का विश्लेषण करना। ChIP-seq डेटा आमतौर पर पृष्ठभूमि का एक कम स्तर है । इम्यूनोप्रिपिपिटेशन द्वारा लक्षित प्रोटीन द्वारा नियंत्रित डीएनए समृद्ध होगा और चोटियों के रूप में दिखाई देगा जो पृष्ठभूमि से कम से दो गुना ऊपर हैं।
इस वीडियो में, हमने साल्मोनेला बायोफिल्म और एकल प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं पर ChIP-seq प्रदर्शन करने के तरीकों का वर्णन किया है जो ब्याज के प्रतिलेखन कारक द्वारा नियंत्रित जीन पर समृद्ध डीएनए की चोटियों की पैदावार करते हैं । प्रकृति में जीवाणु जीवन के बहुमत बायोफिल्म्स में मौजूद है और मानव रोगों के ४०% तक बायोफिल्म से संबंधित माना जाता है । इसलिए उनके पास भारी चिकित्सा और आर्थिक प्रभाव हैं ।
हालांकि, बायोफिल्म प्रतिरोधी है और गणना करने के लिए अधिक कठिन है, खुला तोड़ने के लिए, और हेरफेर करने के लिए । शोधकर्ता उन चैआईपी-सेक्यू तकनीकों का उपयोग कर सकते हैं, जिनका हमने बायोफिल्म की उचित मात्रा में फसल करने, बायोफिल्म को समरूप बनाने, lyse कोशिकाओं, सोनीकेट, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन, शुद्ध और अनुक्रम डीएनए को अन्य बायोफिल्म बनाने वाली जीवाणु प्रजातियों से समरूप बनाने के लिए वर्णित किया है।
क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (ChIP-seq) के साथ मिलकर एक विधि है जिसका उपयोग ट्रांसक्रिप्शन कारकों और जीनोमिक दृश्यों के बीच बातचीत स्थापित करने के लिए किया जाता है जो वे नियंत्रित करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइथिमुरियम बैक्टीरियल बायोफिल्म का उपयोग करते हुए बैक्टीरियल बायोफिल्म्स के साथ ChIP-seq प्रदर्शन करने के लिए तकनीकों को रेखांकित करता है।
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved