Oppdagelse CsgD regulere mål inne Salmonella biofilm benytter kromatin Immunutfelling og høy-produksjon sekvensering (flis-SEQ)

Kromatin immunforekomst etterfulgt av sekvensering, eller ChIP-seq, er en teknikk som kan brukes til å oppdage de regulatoriske målene for transkripsjonsfaktorer, histone modifikasjoner, og andre DNA-tilknyttede proteiner. I ChIP-seq høstes celler og DNA-bindende protein. er krysset knyttet til DNA in vivo med formaldehyd.

Celler lyses, frigjør celleinnholdet og kromatin er skåret inn i fragmenter på mindre enn 1000 basispar, vanligvis mellom 200 og 600 basispar. DNA, som samhandler med målproteinet, er immunforeskrevet ved hjelp av antistoff og isolert ved avkobling. DNA protein krysskoblinger reverseres og RNA og protein fordøyes.

DNA er renset, gjort til biblioteker, og sekvensert. ChIP-seq data kan også brukes til å finne differensial binding av transkripsjonsfaktorer i ulike miljøforhold eller celletyper. I utgangspunktet ble ChIP utført gjennom hybridisering på en mikroarray.

ChIP-sekvensering har imidlertid blitt den foretrukne metoden på grunn av teknologiske fremskritt, avtagende økonomiske barrierer for sekvensering og massiv dataproduksjon av høy kvalitet. I denne protokollen vil vi demonstrere teknikker for å utføre ChIP-seq med bakterielle biofilmer, en viktig kilde til vedvarende og kroniske infeksjoner. ChIP-seq vil bli utført på salmonella typhimurium biofilm og planktoniske celler, rettet mot master biofilm regulator, CSGD, for å bestemme differensial binding i de to celletyper.

I denne videoen vil vi demonstrere teknikker for å bestemme riktig mengde biofilm å høste, normalisere til en planktonisk kontrollprøve, homogenisere biofilm for krysskoblingstilgang og utføre rutinemessige ChIP-seq-trinn for å oppnå sekvenseringsresultater av høy kvalitet. Streak plate salmonella enterica serverer vårt typhimurium på en LB agar plate for å isolere kolonier og inkubere ved 37 grader Celsius over natten. Inokuler fem ml LB kjøttkraft med en til tre kolonier fra strekplaten og inkubere ved 37 grader Celsius med risting i syv timer eller for å logge vekst.

Finn den optiske tettheten av kolbekulturen på 600 nanometer, ved hjelp av et spektrofotometer og legg til en OD 600 tilsvarende cellekultur eller 10 til de ni cellene til en Erlenmeyer kolbe som inneholder 100 milliliter på en prosent tryptone. Inkuber ved 28 grader Celsius med risting i 13 timer. Biofilmceller vises som aggregerte flak og enkeltplantoniske celler er i det overskyede mediet.

Biofilm er svært motstandsdyktige og holder seg til sidene av rør og pipettespisser. Vi bruker bevisste medier til å flytte biofilm i utgangspunktet og bruke varm PBS umiddelbart før krysskobling for å fjerne proteinkrysskoblingssnitter i media. Forskere må kanskje finne en passende løsning for å re-suspendere biofilm i.

Samle kolbekulturen i et sentrifugerør og sentrifuge ved 12.000 G i 10 minutter ved 10 grader Celsius. Dekanter supernatanten til en 0,2 mikrometerfilterenhet og vakuumfilter. Aliquot kolbe kultur i rør og sentrifuge i lav hastighet for å skille de to celletyper.

Biofilmceller er i pelleten nederst på røret og enkeltceller er i det overskyede supernatant. Pipette supernatanten som inneholder planktoniske celler i et sentrifugerør for senere. 25 mikrogram DNA anbefales som inngang for ChIP-seq eksperimenter.

I vårt tilfelle gir 30 milligram biofilm ca. 25 mikrogram DNA. Siden biofilmaggregater har en overflod av proteinaceous ekstracellulært materiale, konkurrerer det om crosslinker og kan resultere i ulikt kryssbundet produkt presentert for immunforeskrivning. En proteinanalyse for å bestemme tilsvarende cellemateriale ved proteinkonsentrasjon foreslås.

I dette tilfellet høstes seks OD 600 planktoniske celler som en kontroll for 30 milligram biofilm. Biofilm høstes av våt vekt og kolonien oppdrett enheter av biofilm kan bli funnet ved hjelp av konverteringsfaktoren vist. Forskere oppfordres til å finne konverteringsfaktoren til biofilmformingsartene de arbeider med ved homogenisering og dråpefortynninger.

Re-suspendere biofilm pellet i en milliliter betinget tryptone og flytte inn i en pre-veid to milliliter snap cap eller en skrue cap rør. Sentrifuge i ett minutt ved 11.000 G.Fjern supernatanten fra røret og vei røret nøyaktig. Trekk rørvekten fra vekten av røret med biofilm for å finne vekten av aggregater.

Det bør være innenfor 10% av målet biofilm vekt. Tilsett en milliliter PBS og vortex for å suspendere biofilmaggregater på igjen. Dispenser supernatanten fra sentrigering med lav hastighet i sentrifugerør.

Mål den optiske tettheten av planktoniske celler ved 600 nanometer ved hjelp av et spektrofotometer og beregn det nødvendige volumet for en endelig OD 600 av seks. Avkjøl Flora-sentrifugen til 10 grader Celsius og pellet planktoniske celler ved hjelp av Flora-sentrifugen. Sentrifuge ved 10.000 G i 10 minutter ved 10 grader Celsius.

Fjern supernatant og re-suspendere pellet i PBS. Mål OD 600 av planktoncellene ved hjelp av et spektrofotometer og dispenser volumet av seks OD 600 planktoniske celler i en to milliliter snap cap eller skrue cap tube. Biofilmaggregater må brytes fra hverandre for å tillate krysskobling for å få tilgang til celler.

Planktoniske celler behandles på samme måte som biofilmceller for å redusere variabler. Bruk av metallperler i en miksermølle kan være mer effektivt for å bryte fra hverandre biofilm enn glassvev homogenisatorer. Aseptisk, legg til en sterilisert metallperle til hver av rørene.

Homogenisere ved hjelp av en miksermølle i fem minutter ved 30 Hertz. Vær oppmerksom på at aggregerte rør for å bekrefte at biofilmen er brutt fra hverandre før de overfører de homogeniserte cellene til et nytt 1,5 milliliter rør, og unngår metallperlen. Ta volumet til én milliliter med PBS.

På dette punktet er det valgfritt å utføre dråpefortynninger for å liste opp inndataceller. Dispenser fersk formaldehyd i prøverør til en endelig konsentrasjon på én prosent. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur på et roterende hjul.

Legg glycin til en endelig konsentrasjon på 125 millimolar for å slukke krysskobling og inkubere i fem minutter ved romtemperatur på et roterende hjul. For å vaske cellene og fjerne overflødig krysskobling, sentrifuge i tre minutter ved 8000 G og fjern det overnaturlige. Re-suspendere pellet i protease hemmere og 500 mikroliter filter sterilisert PBS.

Re-suspendere pellet i 600 mikroliter lysis buffer og inkubere på is i 10 minutter. Flytt den delvise lysate til et nytt rør som inneholder 1,4 milliliter IP-fortynningsbuffer. Hold på isen i en og en halv til to timer og vortex av og til.

Noe motstandsdyktig materiale kan forbli i rørene. Imidlertid vil en lang inkubasjonsperiode og sporadisk vortexing bryte fra hverandre aggregert materiale og resten vil bli brutt under sonikering. Still inn sonicatoren.

Legg 15 milliliter røret i et beger med is og plasser sonden inne i røret. Puls på 20 til 40 prosent for fem sonikeringsutbrudd på 30 sekunder og avkjøl mellom sonikeringsrunder. Cellelylaten vil virke overskyet før sonikering og vil vises klart etter sonikering.

For å fjerne utfellingsmaterialet, sentrifuge ved 8 000 G i 10 minutter ved fire grader og dispenser supernatanten inn i et nytt rør, unngår den svarte pelleten. Sonicator energioverføring og celletype motstand kan variere så en sonikering analyse anbefales å finne antall sonikering runder som vil produsere fragmentstørrelsesområdet som kreves for nedstrøms bibliotek forberedelse og sekvensering. Dispenser sonicated DNA i en 1,35 milliliter aliquot for immunprecipitation og en 200 mikroliter aliquot som input DNA.

Hold inngangskontrollen på minus 80 grader Celsius til de-krysskobling og fordøye trinn. Etter å ha testet antistoffene for å sikre deres spesifisitet for målproteinet, legg til antistoffet til immunforekomstrør og inkubere ved fire grader Celsius over natten på et roterende hjul. Tilsett 50 mikroliter protein G magnetiske perler og inkuber ved fire grader Celsius på et roterende hjul i tre timer.

Bind perlene til sidene av rørene ved hjelp av et magnetisk stativ og utfør vasker. Vask to ganger med 750 mikroliter kald IP-vaskebuffer en. Vask en med 750 mikroliter kald IP-vaskebuffer to.

Og vask to ganger med 750 mikroliter kald TE ved pH åtte. Hold rørene på magnetstativet under vaskene. Tilsett 450 mikroliter ip-elutionbuffer til hvert rør og inkuber ved 65 grader Celsius i 30 minutter med mild vortexing hvert femte minutt.

Bind perlene til sidene av rørene ved hjelp av et magnetisk stativ. Vent minst to minutter til oppløsningen er klar og dispenser deretter den klarede løsningen til et nytt 1,5 milliliter rør. For å reversere krysskoblinger og fordøye RNA, legg til to mikrogram RNase åtte og tilsett natriumklorid til din endelige konsentrasjon på 0,3 molar i hvert rør.

Inkuber ved 65 grader Celsius i mer enn seks timer eller over natten. For å fordøye protein, tilsett 180 mikrogram proteinase K til hvert rør og inkubere ved 45 grader Celsius i tre til fem timer. Rens DNA-et.

Magnetiske perler foretrekkes for å isolere de små mengdene DNA som utvinnes under ChIP med bakterielle celler. Imidlertid kan kolonnebasert eller fenylklorformekstraksjon tilstrekkelig gjenopprette ChIP DNA. Etter rensing er biblioteker utarbeidet fra renset ChIP DNA ved hjelp av et sett som er kompatibelt med den valgte sekvenseringsplattformen.

ChIP DNA-biblioteker krever ofte å legge til minimum antall adaptere og utføre maksimalt antall PCR-forsterkningssykluser. Sjekk bibliotekstørrelsen etter en bioanalyzer og kontroller bibliotekkonsentrasjonen med en cubit eller et QPCR-bibliotek kvantifiseringssett. Pool bibliotekene og fortsett med sekvensering i henhold til den valgte plattformens spesifikasjon.

Analyse av ChIP-seq-data krever skåring av basiskvalitet, trimming av baser av lav kvalitet, samkjøre en samling leser til et referansegenom, kaller topper, knytter topper til gener og analyserer overrepresenterte bindende motiver. ChIP-seq data har vanligvis et lavt nivå av bakgrunn. DNA som styres av proteinet målrettet av immunforebukk vil bli beriket og vil vises som topper som er minst to ganger over bakgrunnen.

I denne videoen har vi beskrevet metoder for å utføre ChIP-seq på salmonellabiofilm og enkeltplantoniske celler som gir topper av beriket DNA på gener kontrollert av transkripsjonsfaktoren av interesse. Mesteparten av bakterielivet i naturen antas å eksistere i biofilmer, og opptil 40% av menneskelige sykdommer antas å være biofilmrelatert. Så de har enorme medisinske og økonomiske konsekvenser.

Imidlertid er biofilm motstandsdyktig og vanskeligere å liste opp, bryte åpen og manipulere. Forskere kan bruke ChIP-seq teknikkene vi beskrev for å høste en passende mengde biofilm, homogenisere biofilmen, lyse celler, sonicate, utføre immunforutsigelse, rense og sekvensere DNA fra andre biofilmdannende bakterielle arter.