Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq)

La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación, o ChIP-seq, es una técnica que se puede utilizar para descubrir los objetivos reguladores de los factores de transcripción, modificaciones de histonas y otras proteínas asociadas al ADN. En ChIP-seq, las células se cosechan y la proteína de unión al ADN. está ligado al ADN in vivo con formaldehído.

Las células están a la an celosía, liberando el contenido de la célula y la cromatina se corta en fragmentos de menos de 1000 pares base, generalmente entre 200 y 600 pares base. El ADN, que interactúa con la proteína diana, se inmunoprecipita mediante anticuerpos y se aísla mediante desvinculación. Los reticulamientos de proteínas de ADN se invierten y se digieren el ARN y la proteína.

El ADN se purifica, se convierte en bibliotecas y se secuencia. Los datos ChIP-seq también se pueden utilizar para encontrar la unión diferencial de factores de transcripción en diferentes condiciones ambientales o tipos de células. Inicialmente, ChIP se realizaba a través de la hibridación en un microarray.

Sin embargo, la secuenciación de ChIP se ha convertido en el método preferido debido a los avances tecnológicos, la disminución de las barreras financieras a la secuenciación y la producción masiva de datos de alta calidad. En este protocolo, demostraremos técnicas de realización de ChIP-seq con biopelículas bacterianas, una fuente importante de infecciones persistentes y crónicas. ChIP-seq se realizará en la biopelícula de salmonela typhimurium y las células planctónicas, dirigidas al regulador maestro de biopelícula, CSGD, para determinar la unión diferencial en los dos tipos de células.

En este vídeo, demostraremos técnicas para determinar la cantidad adecuada de biopelícula para cosechar, normalizar una muestra de control planctónico, homogeneizar biopelícula para el acceso entre reticulantes y realizar pasos rutinarios de ChIP-seq para obtener resultados de secuenciación de alta calidad. Plato de rayas salmonella enterica servir nuestro typhimurium en un plato de agar LB para aislar colonias e incubar a 37 grados Celsius durante la noche. Inocular el caldo LB de cinco ml con una a tres colonias de la placa de la raya e incubar a 37 grados centígrados con temblor durante siete horas o para registrar el crecimiento.

Encuentre la densidad óptica del cultivo del matraz a 600 nanómetros, utilizando un espectrofotómetro y agregue un OD 600 equivalente de cultivo celular o 10 a las nueve células a un matraz Erlenmeyer que contenga 100 mililitros de un solo porcentaje de triptona. Incubar a 28 grados centígrados con temblor durante 13 horas. Las células de biopelícula aparecen como escamas agregadas y las células planctónicas individuales están en los medios nublados.

Biofilm son altamente resistentes y se adhieren a los lados de los tubos y puntas de pipeta. Utilizamos medios acondicionados para mover biopelícula inicialmente y utilizar PBS caliente inmediatamente antes de reticular para eliminar sustratos de reticulación de proteínas en los medios. Es posible que los investigadores necesiten encontrar una solución adecuada para volver a suspender el biopelícula.

Recoger el cultivo del matraz en un tubo centrífugo y centrifugar a 12.000 G durante 10 minutos a 10 grados centígrados. Decantar el sobrenadante en una unidad de filtro de 0,2 micrómetros y filtro de vacío. Cultivo de matraz alícuota en tubos y centrífuga a velocidad lenta para separar los dos tipos de células.

Las células de biopelícula están en el pellet en la parte inferior del tubo y las células individuales están en el sobrenadante turbio. Pipetear el sobrenadante que contiene células planctónicas en un tubo de centrífuga para más adelante. Se recomiendan 25 microgramos de ADN como entrada para experimentos ChIP-seq.

En nuestro caso, 30 miligramos de biopelícula producen aproximadamente 25 microgramos de ADN. Dado que los agregados de biopelícula tienen una abundancia de material extracelular proteínico, compite por el reticulante y puede dar lugar a un producto reticulado desigual presentado para inmunoprecipitación. Se sugiere un ensayo proteico para determinar el material celular equivalente por concentración de proteínas.

En este caso, seis células planctónicas OD 600 se cosechan como control de 30 miligramos de biopelícula. Biofilm se cosecha por peso húmedo y las unidades de cultivo de colonias de biopelícula se pueden encontrar utilizando el factor de conversión mostrado. Se alienta a los investigadores a encontrar el factor de conversión de la especie formadora de biopelículas con la que trabajan mediante homogeneización y diluciones de caída.

Vuelva a suspender el pellet de biopelícula en un mililitro de triptona acondicionada y muévase a una tapa de presión de dos mililitros prepesada o un tubo de tapa de tornillo. Centrifugar durante un minuto a 11.000 G.Retire el sobrenadante del tubo y pese el tubo con precisión. Restar el peso del tubo del peso del tubo con biopelícula para encontrar el peso de los agregados.

Debe estar dentro del 10% del peso de la biopelícula objetivo. Agregue un mililitro de PBS y vórtice para volver a suspender los agregados de biopelícula. Dispensar el sobrenadante de centrifugación a velocidad lenta en tubos centrífugos.

Mida la densidad óptica de las células planctónicas a 600 nanómetros utilizando un espectrofotómetro y calcule el volumen requerido para un OD final 600 de seis. Enfríe la centrífuga Flora a 10 grados Centígrados y pelete las células planctónicas usando la centrífuga Flora. Centrifugar a 10.000 G durante 10 minutos a 10 grados centígrados.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en PBS. Remesure el OD 600 de las células planctónicas utilizando un espectrofotómetro y dispensar el volumen de seis células planctónicas OD 600 en una tapa de presión de dos mililitros o tubo de tapa de tornillo. Los agregados de biopelícula deben separarse para permitir que el reticulador acceda a las células.

Las células planctónicas se tratan de la misma manera que las células de biopelícula para reducir las variables. El uso de perlas metálicas en un molino mezclador puede ser más eficaz para romper la biopelícula que los homogeneizadores de tejido de vidrio. Adenúdamente, agregue un cordón de metal esterilizado a cada uno de los tubos.

Homogeneizar utilizando un molino mezclador durante cinco minutos a 30 Hertz. Observe los tubos agregados para confirmar que la biopelícula se ha roto antes de transferir las células homogeneizadas a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, evitando el cordón metálico. Lleve el volumen a un mililitro con PBS.

En este punto, es opcional realizar diluciones de colocación para enumerar las celdas de entrada. Dispensar formaldehído fresco en tubos de muestra a una concentración final del uno por ciento. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en una rueda giratoria.

Añadir glicina a una concentración final de 125 mililitros para apagar la reticulación e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Para lavar las células y eliminar el exceso de reticulante, centrifugar durante tres minutos a las 8.000 G y retire el sobrenadante. Re-suspender el pellet en inhibidores de la proteasa y 500 microlitros de PBS esterilizado por filtro.

Vuelva a suspender el pellet en 600 microlitros de tampón de lelisis e incubar sobre hielo durante 10 minutos. Mueva el izado parcial a un nuevo tubo que contenga 1,4 mililitros de búfer de dilución IP. Mantener en hielo durante una hora y media a dos horas y vórtice de vez en cuando.

Algunos materiales resistentes pueden permanecer en los tubos. Sin embargo, un largo período de incubación y vórtices ocasionales romperán el material agregado y el resto se romperá durante la sonicación. Sintonice el sonicador.

Coloque el tubo de 15 mililitros en un vaso de hielo y coloque la sonda dentro del tubo. Pulso de 20 a 40 por ciento para cinco ráfagas de sonicación de 30 segundos y enfríe entre las rondas de sonicación. El izado celular aparecerá turbio antes de la sonicación y aparecerá claro después de la sonicación.

Para eliminar el material precipitado, centrifugar a 8.000 G durante 10 minutos a cuatro grados y dispensar el sobrenadante en un nuevo tubo, evitando el pellet negro. La transferencia de energía de Sonicator y la resistencia al tipo de célula pueden diferir, por lo que se recomienda un ensayo de sonicación para encontrar el número de rondas de sonicación que producirán el rango de tamaño de fragmento requerido para la preparación y secuenciación de la biblioteca aguas abajo. Dispensar ADN sonicado en una alícuota de 1,35 mililitros para inmunoprecipitación y una alícuota de 200 microlitios como ADN de entrada.

Mantenga el control de entrada a menos 80 grados Centígrados hasta que se crucen los pasos de descruciente y digerido. Después de probar los anticuerpos para asegurar su especificidad para la proteína diana, agregue el anticuerpo a los tubos de inmunoprecipitación e incubar a cuatro grados Celsius durante la noche en una rueda giratoria. Añadir 50 microlitros de proteína G cuentas magnéticas e incubar a cuatro grados Celsius en una rueda giratoria durante tres horas.

Enlazar las perlas a los lados de los tubos utilizando un soporte magnético y realizar lavados. Lavar dos veces con 750 microlitros de tampón de lavado IP en frío uno. Lave uno con 750 microlitros de tampón de lavado IP en frío dos.

Y lavar dos veces con 750 microlitros de TE frío a pH ocho. Mantenga los tubos en el soporte magnético durante los lavados. Agregue 450 microlitros de tampón de elución IP a cada tubo e incubar a 65 grados Celsius durante 30 minutos con un vórtice suave cada cinco minutos.

Une las perlas a los lados de los tubos usando un soporte magnético. Espere al menos dos minutos hasta que la solución esté clara y luego dispense la solución despejada a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Para revertir los reticulantes y digerir el ARN, agregue dos microgramos de RNase ocho y agregue cloruro de sodio a su concentración final de 0,3 molares en cada tubo.

Incubar a 65 grados centígrados durante más de seis horas o durante la noche. Para digerir la proteína, agregue 180 microgramos de proteinasa K a cada tubo e incubar a 45 grados Celsius durante tres a cinco horas. Purificar el ADN.

Se prefieren perlas magnéticas para aislar las pequeñas cantidades de ADN recuperadas durante el ChIP con células bacterianas. Sin embargo, la extracción a base de columnas o de fenilcloroformo puede recuperar adecuadamente el ADN ChIP. Después de la purificación, las bibliotecas se preparan a partir de ADN ChIP purificado utilizando un kit que es compatible con la plataforma de secuenciación seleccionada.

Las bibliotecas de ADN ChIP a menudo requieren agregar la cantidad mínima de adaptadores y realizar el número máximo de ciclos de amplificación de PCR. Compruebe el tamaño de la biblioteca mediante un bioanalizador y compruebe la concentración de la biblioteca con un cubit o un kit de cuantificación de biblioteca QPCR. A la vez, a la piscina de las bibliotecas y proceda con la secuenciación de acuerdo con las especificaciones de la plataforma seleccionada.

El análisis de los datos ChIP-seq requiere puntuar la calidad base, recortar bases de baja calidad, alinear las lecturas de un ensamblaje con un genoma de referencia, llamar picos, asociar picos con genes y analizar motivos de unión sobre-representados. Los datos ChIP-seq suelen tener un bajo nivel de fondo. El ADN controlado por la proteína a la que se dirige la inmunoprecipitación se enriquecerá y aparecerá como picos que son al menos dos veces por encima del fondo.

En este video, hemos descrito métodos para realizar ChIP-seq en biopelícula de salmonela y células planctónicas únicas que producen picos de ADN enriquecido en genes controlados por el factor de transcripción de interés. Se cree que la mayoría de la vida bacteriana en la naturaleza existe en biopelículas y hasta el 40% de las enfermedades humanas están relacionadas con biopelículas. Así que tienen enormes impactos médicos y económicos.

Sin embargo, el biofilm es resistente y más difícil de enumerar, abrir y manipular. Los investigadores pueden utilizar las técnicas ChIP-seq que describimos para cosechar una cantidad adecuada de biopelícula, homogeneizar la biopelícula, lyse cells, sonicar, realizar inmunoprecipitación, purificar y secuenciar ADN de otras especies bacterianas formadoras de biopelículas.