7.1K Views
•
13:48 min
•
January 18th, 2020
DOI :
January 18th, 2020
•0:00
Title
2:01
Protocol
12:04
Results
12:41
Conclusion
Transcript
Chromatin immunprecipitation följt av sekvensering, eller ChIP-seq, är en teknik som kan användas för att upptäcka de reglerande målen för transkriptionsfaktorer, histonmodifieringar och andra DNA-associerade proteiner. I ChIP-seq skördas celler och DNA-bindande protein. är korskopplad till DNA in vivo med formaldehyd.
Celler är lysed, släppa cellinnehållet och kromatin är skjuvning i fragment av mindre än 1000 baspar, vanligtvis mellan 200 och 600 baspar. DNA, interagera med målproteinet, är immunutskriven med hjälp av antikropp och isoleras genom de-crosslinking. DNA-protein crosslinks är omvända och RNA och protein smälts.
DNA:t renas, görs till bibliotek, och sekvenseras. ChIP-seq-data kan också användas för att hitta differentiell bindning av transkriptionsfaktorer i olika miljöförhållanden eller celltyper. Inledningsvis utfördes ChIP genom hybridisering på en microarray.
ChIP-sekvensering har dock blivit den metod som föredras på grund av tekniska framsteg, minskande finansiella hinder för sekvensering och massiv högkvalitativ dataproduktion. I detta protokoll kommer vi att demonstrera tekniker för att utföra ChIP-seq med bakteriella biofilmer, en stor källa till långlivade och kroniska infektioner. ChIP-seq kommer att utföras på salmonella typhimurium biofilm och planktonceller, med inriktning på master biofilm regulator, CSGD, att fastställa differentialbindning i de två celltyperna.
I den här videon kommer vi att demonstrera tekniker för att bestämma lämplig mängd biofilm att skörda, normalisera till ett planktoniskt kontrollprov, homogenisera biofilm för crosslinker-åtkomst och utföra rutinmässiga ChIP-seq-steg för att få högkvalitativa sekvenseringsresultat. Streak plate salmonella enterica tjäna vår typhimurium på en LB agar platta att isolera kolonier och inkubera på 37 grader Celsius över natten. Inokulera fem mL LB buljong med en till tre kolonier från strimma plattan och inkubera på 37 grader Celsius med skakning i sju timmar eller att logga tillväxt.
Hitta den optiska densiteten av kolvenskulturen vid 600 nanometer, med hjälp av en spektrofotometer och tillsätt en OD 600-motsvarighet till cellodling eller 10 till de nio cellerna till en Erlenmeyerkolv som innehåller 100 milliliter av en procent tryptone. Inkubera vid 28 grader Celsius med skakning i 13 timmar. Biofilmceller visas som aggregerade flingor och enstaka planktoniska celler är i grumliga medier.
Biofilm är mycket resistenta och fastnar på sidorna av rör och pipettspetsar. Vi använder betingade medier för att flytta biofilm initialt och använda varm PBS omedelbart innan tvärbindning för att avlägsna protein crosslinking substrat i media. Forskare kan behöva hitta en lämplig lösning för att åter upphäva biofilm i.
Samla kolven kulturen i ett centrifugrör och centrifug vid 12, 000 G i 10 minuter vid 10 grader Celsius. Dekantera supernatanten till en 0,2 mikrometerfilterenhet och vakuumfilter. Alikvotkolvkultur i rör och centrifug i långsam hastighet för att separera de två celltyperna.
Biofilmceller är i pelleten längst ner på röret och enstaka celler är i den grumliga supernatanten. Pipettera supernatanten som innehåller planktoniska celler till ett centrifugrör för senare. 25 mikrogram DNA rekommenderas som indata för ChIP-seq-experiment.
I vårt fall, 30 milligram biofilm avkastning cirka 25 mikrogram DNA. Eftersom biofilm aggregat har ett överflöd av proteinaceous extracellulära material, den konkurrerar om crosslinker och kan resultera i ojämlika crosslinked produkt presenteras för immunoprecipitation. En proteinanalys för att bestämma likvärdigt cellmaterial genom proteinkoncentration föreslås.
I detta fall skördas sex OD 600 planktoniska celler som en kontroll för 30 milligram biofilm. Biofilm skördas efter våtvikt och koloniuppfödningsenheterna i biofilm kan hittas med hjälp av den konverteringsfaktor som visas. Forskare uppmuntras att hitta omvandlingsfaktorn för biofilmen bildar arter de arbetar med genom homogenisering och släpp utspädningar.
Åter upphäva biofilm pelleten i en milliliter konditionerad tryptone och flytta in i en pre-vägd två milliliter snäpplock eller en skruv lock rör. Centrifugera i en minut vid 11, 000 G.Ta bort supernatanten från röret och väg röret exakt. Subtrahera röret vikt från vikten av röret med biofilm för att hitta vikten av aggregat.
Det bör vara inom 10%av målet biofilm vikt. Lägg till en milliliter PBS och virvel för att åter upphäva biofilm aggregat. Dispensera supernatanten från långsam hastighetscentrifugering i centrifugrör.
Mät den optiska densiteten hos de planktoniska cellerna vid 600 nanometer med hjälp av en spektrofotometer och beräkna den volym som krävs för en slutlig OD 600 av sex. Kyl Floracentrifugen till 10 grader Celsius och pelleta planktoncellerna med hjälp av Floracentrifugen. Centrifugera vid 10, 000 G i 10 minuter vid 10 grader Celsius.
Ta bort supernatanten och dra upp pelleten på ny lydnad i PBS. Mät om OD 600 av de planktoniska cellerna med hjälp av en spektrofotometer och fördela volymen på sex OD 600 planktonceller i ett två milliliter snäpplock eller skruvlocksrör. Aggregat för biofilm måste brytas isär för att crosslinker ska kunna komma åt celler.
Planktoniska celler behandlas på samma sätt som biofilmceller för att minska variabler. Använda metall pärlor i en mixer kvarn kan vara mer effektivt för att bryta isär biofilm än glas vävnad homogenisatorer. Aseptiskt, tillsätt en steriliserad metallpärla till var och en av rören.
Homogenisera med hjälp av en mixerkvarn i fem minuter vid 30 Hertz. Observera aggregatrör för att bekräfta att biofilmen har brutits sönder innan de homogeniserade cellerna överförs till ett nytt 1,5 milliliterrör, varigenom metallpärlorna undviks. Ta volymen till en milliliter med PBS.
Vid denna punkt är det valfritt att utföra släpp utspädningar för att räkna upp indataceller. Dispensera färsk formaldehyd i provrör till en slutlig koncentration på en procent. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur på ett roterande hjul.
Tillsätt glycin till en slutkoncentration på 125 millimolar för att släcka tvärbindning och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur på ett roterande hjul. För att tvätta cellerna och avlägsna överskott crosslinker, centrifug i tre minuter vid 8, 000 G och ta bort supernatanten. Åter upphäva pelleten i proteashämmare och 500 mikroliter av filtersteriliserad PBS.
Åter upphäva pelleten i 600 mikroliter av lysbuffert och inkubera på is i 10 minuter. Flytta den partiella lysate till ett nytt rör som innehåller 1,4 milliliter IP-utspädningsbuffert. Håll på is i en och en halv till två timmar och virvel ibland.
Visst motståndskraftigt material kan finnas kvar i rören. Men en lång inkubationstid och enstaka vortexing kommer att bryta isär aggregerat material och resten kommer att brytas under ultraljudsbehandling. - Stäm sonicatorn.
Placera 15 milliliterröret i en bägare av is och placera sonden inuti röret. Puls på 20 till 40 procent för fem ultraljudsbehandling skurar av 30 sekunder och svalna mellan ultraljudsbehandling rundor. Cellen lysate kommer att visas grumlig innan ultraljudsbehandling och kommer att visas klart efter ultraljudsbehandling.
För att ta bort utfällt material, centrifug vid 8, 000 G i 10 minuter vid fyra grader och fördela supernatanten i ett nytt rör, undvika den svarta pelleten. Sonicator energiöverföring och celltyp motstånd kan skilja sig så en ultraljudsbehandling assay rekommenderas att hitta antalet ultraljudsbehandling rundor som kommer att producera fragmentet storleksintervall som krävs för nedströms bibliotek förberedelse och sekvensering. Dispensera sonicated DNA i en 1.35 milliliter aliquot för immunoprecipitation och en 200 microliter aliquot som ingång DNA.
Håll indatakontrollen vid minus 80 grader Celsius tills de-crosslinking och smälta steg. Efter att ha testat antikropparna för att säkerställa deras specificitet för målproteinet, tillsätt antikroppen till immunprecipitationsrör och inkubera vid fyra grader Celsius över natten på ett roterande hjul. Tillsätt 50 mikroliter protein G magnetiska pärlor och inkubera i fyra grader Celsius på ett roterande hjul i tre timmar.
Bind pärlorna till sidorna av rör med hjälp av ett magnetiskt stativ och utför tvättar. Tvätta två gånger med 750 mikroliter av kall IP-tvättbuffert en. Tvätta en med 750 mikroliter av kall IP-tvättbuffert två.
Och tvätta två gånger med 750 mikroliter av kall TE vid pH åtta. Håll rören på magnetstativ under tvättarna. Tillsätt 450 mikroliter IP elueringsbuffert till varje rör och inkubera i 65 grader Celsius i 30 minuter med skonsam virvelning var femte minut.
Bind pärlorna mot rörens sidor med hjälp av ett magnetiskt stativ. Vänta minst två minuter tills lösningen är klar och dispensera sedan den rensade lösningen till ett nytt 1,5 milliliterrör. För att vända korslänkar och smälta RNA, tillsätt två mikrogram RNase åtta och tillsätt natriumklorid till din slutliga koncentration av 0,3 molar i varje rör.
Inkubera vid 65 grader Celsius i mer än sex timmar eller över natten. För att smälta protein, tillsätt 180 mikrogram proteinas K till varje rör och inkubera vid 45 grader Celsius i tre till fem timmar. Rena DNA: t.
Magnetiska pärlor är att föredra för att isolera de små mängderna DNA som återvinns under ChIP med bakterieceller. Kolumnbaserad eller fenylklorform extraktion kan dock återhämta chIP DNA på ett tillfredsställande sätt. Efter rening bereds biblioteken från renat ChIP DNA med hjälp av ett kit som är kompatibelt med den valda sekvenseringsplattformen.
ChIP DNA-bibliotek kräver ofta att man lägger till minsta mängd adaptorer och utför det maximala antalet PCR-förstärkningscykler. Kontrollera biblioteksstorleken efter en bioanalyzer och kontrollera bibliotekskoncentrationen med en cubit eller en QPCR-bibliotekskvantifieringssats. Poola biblioteken och fortsätt med sekvensering enligt den valda plattformens specifikation.
Analys av ChIP-seq-data kräver poängsättning baskvalitet, trimning låg kvalitet baser, anpassa en församling läser till en referens genom, ringer toppar, associera toppar med gener, och analysera överrepresenterade bindning motiv. ChIP-seq data har oftast en låg nivå av bakgrund. DNA som styrs av det protein som är riktat mot immunoprecipitation kommer att berikas och kommer att visas som toppar som är minst tvåfaldiga ovanför bakgrunden.
I denna video har vi beskrivit metoder för att utföra ChIP-seq på salmonella biofilm och enda planktoniska celler som ger toppar av berikat DNA vid gener som kontrolleras av transkriptionsfaktorn av intresse. Majoriteten av bakterielivet i naturen tros finnas i biofilmer och upp till 40%av mänskliga sjukdomar tros vara biofilmsrelaterade. Så de har enorma medicinska och ekonomiska konsekvenser.
Biofilm är dock resistent och svårare att räkna upp, bryta upp, och att manipulera. Forskare kan använda ChIP-seq tekniker vi beskrev för att skörda en lämplig mängd biofilm, homogenisera biofilm, lyse celler, sonikera, utföra immunprecipitation, rena och sekvens DNA från andra biofilmbildande bakteriearter.
Kromatin immunoprecipitation tillsammans med nästa generations sekvensering (ChIP-SEQ) är en metod som används för att etablera interaktioner mellan transkriptionsfaktorerna och de genomiska sekvenser de styr. Detta protokoll beskriver tekniker för att utföra ChIP-SEQ med bakteriella biofilmer, med hjälp av salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium bakteriell biofilm som ett exempel.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved