Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

يتم دعم MRLS من قبل جائزة الدراسات العليا الأسترالية (APA) وجائزة معهد العلوم الحيوية الجزيئية للنهوض بالبحوث. تم دعم Wanida Phetsang من قبل جامعة كوينزلاند الدولية للمنح الدراسية (UQI) وجائزة IMB للدراسات العليا (IMBPA). لجنة الهدنة العسكرية هو زميل البحوث NHMRC المبدأ (APP1059354) ويحمل أيضا تعيين زميل أستاذي كسور في جامعة كوينزلاند، مع الوقت المتبقي له كرئيس تنفيذي لشركة Inflazome المحدودة، وهي شركة تطوير الأدوية لتلبية الاحتياجات السريرية غير الملباة في الأمراض الالتهابية. يتم دعم MATB جزئيًا من قبل منحة ويلكوم ترست الاستراتيجية WT1104797/Z/14/Z ومنحة تطوير NHMRC APP1113719. تم إجراء الفحص المجهري في المؤسسة الأسترالية لأبحاث السرطان (ACRF) / معهد العلوم الجزيئية البيولوجية مرفق تصوير بيولوجيا السرطان، الذي أنشئ بدعم من ACRF.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يعلنانه.

يجب أن يبدأ إنشاء مسبار مضاد حيوي فلوري ناجح بتخطيط ودراسة دقيقين للعقار الأم. وإذا لم يكن البحث عن الـ SAR معروفاً أو مستكشفاً بالكامل، فقد يلزم اختبار عدة خيارات للعثور على موقع يمكن تعديله بشكل انتقائي دون إلغاء النشاط البيولوجي. وبمجرد تحديد موقع/مواقع، يكون تركيب رابط الوات ضروري في كثير من الأحيان من أجل توفير المباعدة بين الموقع البيولوجي للعمل والفلوروفور غير النشط. يجب توخي الحذر من أن التفاعل المستخدم لإرفاق الرابط إلى المضادات الحيوية يترك مجموعة وظيفية مستقرة بيولوجيا، وتجنب، على سبيل المثال، استرات التي هي عرضة للانشقاق من قبل esterases في الجسم الحي. اعتمادا على التشكيل الجانبي الدوائية والدوائية للمضاد الحيوي، يمكن استخدام رابط الألكيل بسيطة، أو آخر ينبغي النظر في خيار أقل lipophilic مثل البولي ايثيلين جليكول (PEG) رابط. مع الرابط المرفقة ، يجب تقييم النشاط المضاد للبكتيريا لضمان أن تكون البلدان المتوسطة الدخل ضد البكتيريا ذات الصلة مشابهة للمركب الأم.
في هذا العمل، نوصي باستخدام Huigsen azide-alkyne [3+2] ديبولابالإضافة (انقر فوق الكيمياء، انظر الشكل 1)لligate الفلوروفور إلى المضادات الحيوية، لعدد من الأسباب. ردود الفعل انقر انتقائية للغاية، وهذا يعني أن حماية المجموعات التفاعلية على المضادات الحيوية ليست ضرورية، وعلاوة على ذلك، فإن رد الفعل يترك مستقرة، بيوية moiety triazole. يتم إدخال عنصر الأزيد إلى جزء المضادات الحيوية في إجراءاتنا ، حيث يتم إنجاز هذا بشكل عام بسهولة أكبر مع مجموعة متنوعة من الأنواع الهيكلية من إدخال ألكين. يتم وصف توليفات اثنين من الفلوروفوروفوريات المشتقة من الألكين هنا ، على الرغم من أنه يمكن استكشاف البعض الآخر إذا رغبت في ذلك. تم اختيار NBD و DMACA بسبب صغر حجمها ، مما يقلل من إمكانية التدخل في اختراق الخلايا والتفاعل المستهدف. يتم تنفيذ رد فعل النقر نفسه باستخدام الحفز النحاسي ، حيث يمكن استخدام Cu2 + (CuSO4، مع عامل تقليل حمض الأسكوربيك) أو Cu+ (CuI) ككاشف بدء. بعد تنقية(الشكل 2)، وينبغي بعد ذلك اختبار MICs كما هو الحال مع الأزيد. حتى مع النظر بعناية في اختيار الفلوروفور وموقع التعلق ، فمن الممكن ملاحظة نشاط المضادات الحيوية الضعيف. هذا لا يعني، مع ذلك، أن التحقيق غير نشط هو دون استخدام. كما هو موضح مع تحقيقات TMP ، قد لا تزال ترتبط المركبات ذات النشاط المضاد للبكتيريا الضعيفة بنفس هدف الدواء الأم. وهذا يمكن أن يتيح إجراء دراسات عن طريقة العمل وفحص الظواهر المؤدية إلى المقاومة، مثل efflux.
كما هو موضح في قسم البروتوكولات ، من الممكن تحليل الوسم البكتيري بواسطة المضادات الحيوية الفلورية باستخدام إما اختبار قياس الطيف البسيط(الشكل 3)أو قياس التدفق الخلوي(الشكل 4). كلا الطريقتين قادرة على قياس التراكم الخلوي ، وعن طريق إزالة الخلايا وفحص توطين الفلورسينس في اللايسات ، من الممكن تقييم التراكم داخل الخلايا. في هذا البروتوكول ، يتم وصف استخدام الليسوزيم لخلايا الخلايا ، لأن هذا هو سريع ، تقنية عالمية. كما تم استخدام حالات الانلاح الأخرى، مثل العلاج الليلي بالجليسين-HCl7،بنجاح. باستخدام هذه التقنية ، من الممكن دراسة تأثير efflux على تراكم المضادات الحيوية الخلوية ، وهي آلية رئيسية للمقاومة. إذا efflux هو موجود بالفعل في البكتيريا، وسوف يلاحظ عدم تراكم داخل الخلايا، على الرغم من أن هذا يمكن إنقاذها باستخدام مثبط اتفلوج مثل CCCP.
ويمكن أيضا إجراء المجهر لفحص بصري توطين التحقيق في البكتيريا المختلفة، وجمع المعلومات عن طريقة العمل، وربما أيضا المقاومة (انظر الشكل 5 للحصول على أمثلة تمثيلية). من أجل رؤية التعريب داخل البكتيريا ، مطلوب مجهر بؤري عالي الدقة ، مجهز بقدرات مثل SIM (المجهر الإضاءة المنظم) ، SR-SIM (Superresolution-SIM) ، Airyscan ، أو STED (استنفاد الانبعاثات المحفزة). وعلاوة على ذلك، ينبغي استخدام قسائم التغطية عالية الأداء، وإجراء تحليل ما بعد التصوير على برنامج مناسب (مثل فيجي، أو زن، أو إيماريس). تتم مقارنة توطين المسابير بالأصباغ التي تلطخ معماريات محددة ، مثل Hoechst-33342 (الأزرق ، الحمض النووي) ، Syto-9 (الأخضر ، الحمض النووي) ، وFM4-64FX (أحمر ، غشاء). وينبغي أن يتم اختيار الأصباغ لتتناسب مع المضادات الحيوية الفلورية، بحيث كل لون المستخدمة لديها الحد الأدنى من التداخل الطيفي. من أجل الحصول على أفضل الصور الممكنة ، قد تكون هناك حاجة إلى التحسين. على سبيل المثال، إذا كانت البكتيريا مزدحمة جدا على الشريحة، واتخاذ جزء فقط من بيليه علقت، ثم تمييع مع أكثر تصاعد المتوسطة. في المقابل، إذا كانت البكتيريا متناثرة جدا على الشريحة، ببساطة تبدأ مع المزيد من البكتيريا. في هذا البروتوكول ، يوصى باستخدام هلام حراري قابل للعكس متوافق مع الخلايا الحية (على سبيل المثال ، Cygel) لتصوير الخلايا الحية ، لأنه يشل البكتيريا (بما في ذلك البكتيريا المتحركة) ، ولكن تم استخدام الوسائط المتزايدة الأخرى أو الآغا روز بنجاح.
وعموماً، وعلى الرغم من التحديات التي قد تواجه في إعداد مشتقات المضادات الحيوية الفلورية النشطة بيولوجياً، فإن بساطة استخدامها وتعدد استخداماتها يجعلان هذه المسابير أدوات جذابة للبحث في المضادات الحيوية المضادة للميكروبات. العمل المستقبلي باستخدام المضادات الحيوية الفلورية لديه القدرة على توفير نظرة ثاقبة لآليات مقاومة المضادات الحيوية، وتحسين فهمنا لكيفية عمل المضادات الحيوية الحالية، والمساعدة في تطوير أدوية أفضل.

مقاومة مضادات الميكروبات هي أزمة متصاعدة تشكل تهديداً كبيراً لصحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. وقد تم الإبلاغ عن مقاومة معظم المضادات الحيوية، وظهرت العدوى الناجمة عن البكتيريا المقاومة لجميع الأدوية المتاحة سريريا. ومن أجل مكافحة ارتفاع معدل الوفيات، نحتاج إلى زيادة فهمنا لهذه الظاهرة المتعددة الأوجه والآليات والتفاعلات الأساسية بين المضادات الحيوية والبكتيريا. أحد الجوانب التي كانت تاريخيا سيئة الفهم هو نفاذ المضادات الحيوية إلى البكتيريا، جنبا إلى جنب مع ظواهر التراكم وefflux. هذه المعرفة أمر حاسم في تصميم أدوية جديدة وفهم آليات المقاومة. ومن ثم، فإن هذا يلعب دوراً حاسماً في بحوث AMR.
هناك نهجان رئيسيان يمكن اتخاذهما لقياس تركيز المضادات الحيوية: قياس الدواء مباشرة أو وضع علامات على موى مصمم لتسهيل القياس الكمي. على الرغم من أن وضع علامات على المضادات الحيوية يحسن الكشف ، فإن هذا يمكن أن ياضطراب النشاط البيولوجي للدواء ، مثل النشاط المضاد للميكروبات ونفاذيته. هذه ليست مشكلة للأساليب غير الموسومة; ومع ذلك، يمكن أن يكون الكشف تحديا. في السنوات القليلة الماضية ، أدت التطورات التكنولوجية إلى طفرة في البحوث باستخدام قياس الطيف الكتلي (MS) لقياس تركيز المضادات الحيوية مباشرة في البكتيريا1،2،3،4،5،6. وقد أظهرت هذه الدراسات أنه من الممكن دراسة تراكم داخل الخلايا في مجموعة متنوعة من البكتيريا، مع البكتيريا السلبية الغرام الأكثر دراسة على نطاق واسع. ثم تم ربط القياس الكمي لنفاذية الجزيء بالنشاط واستخدامها لإعلام تطوير الدواء2،3،4، على الرغم من الحذر يجب اتخاذه عند الخلط المباشر بين التراكم والنشاط المستهدف5. قبل تطور التصلب المتعدد ، كانت المضادات الحيوية الوحيدة التي يمكن قياس تركيزها مباشرة هي تلك التي تمتلك الفلورسين الأصيل ، مثل التتراسيكلين والكينولون8و9و10و11. وعلى الرغم من أن التراكم والتدفق الكمي محدودان بوضوح في نطاقهما، فقد تم فحصهما وقياسهما، مما يوضح فائدة القياس الكمي القائم على الفلورسينس.
وقد استخدمت المضادات الحيوية الموسومة لعدة عقود لدراسة التوزيعات، وأساليب العمل، والمقاومة، مع العلامات المشعة والفلورية شائعة. وللتحقيقات الموسومة بالراديو ميزة كونها مطابقة تقريباً للمركب الأصلي، ومن ثم فمن غير المرجح أن يكون النشاط البيولوجي مختلفاً اختلافاً كبيراً. وقد استخدمت النظائر مثل 3H و 14C و 15N بشكل متكرر بسبب بروز هذه العناصر في المضادات الحيوية ، وتم فحص مجموعة متنوعة من سقالات المضادات الحيوية1،10،12،13. وفي حين أن الكشف عن المسابير الراديوية بسيط، فإن هناك عدداً من الشواغل اللوجستية (مثل السلامة، ونصف العمر النظيري) التي حدت من استخدام هذا النهج. استراتيجية أخرى هي المضادات الحيوية الموسومة بالفلورسنت. ويمكن استخدام هذه المسابير لدراسة توزيع وطرق العمل والمقاومة للدواء الأم، وذلك باستخدام تكنولوجيا أبسط من مرض التصلب العصبي المتعدد ودون المشاكل اللوجستية للإشعاع8. العيب الرئيسي لهذا النهج هو أن المضادات الحيوية هي عموما جزيئات صغيرة نسبيا، وبالتالي إدخال موي الفلورسنت يشكل تغييرا كيميائيا كبيرا. يمكن أن يؤثر هذا التغيير على الخصائص الفيزيائية ونشاط مضاد للبكتيريا. لذلك ، يجب توخي الحذر لتقييم هذه العوامل من أجل توليد نتائج تمثل المضادات الحيوية الأم.
في هذا العمل ، يتم وصف طريقة لتوليف وتقييم واستخدام المضادات الحيوية الفلورية ، كما هو الحال في منشوراتنا السابقة14،15،16. ومن خلال العمل السابق، تم إعداد عدد من المضادات الحيوية الفلورية واستخدامها لأغراض متنوعة (انظر Stone et al.8). من أجل تقليل احتمال التأثير على النشاط البيولوجي ، يتم استخدام فلوروفوريات صغيرة جدًا في هذا العمل: النيتروبنزوكديازيول (NBD ، الأخضر) و 7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-chromen-4-yl (DMACA ، أزرق). علاوة على ذلك ، يتم وصف تقييم النشاط المضاد للبكتيريا باستخدام الحد الأدنى من تخفيف microbroth (MIC) ، بحيث يمكن قياس تأثير التعديلات على النشاط. يمكن استخدام هذه المسابير الموسومة بالفلورسنت في الاختبارات الطيفية الضوئية، وقياس التدفق الخلوي، والمجهر. مجموعة من التطبيقات الممكنة حيث تكمن ميزة المضادات الحيوية الفلورية. يمكن قياس التراكم الخلوي وتصنيفه وتصوره، وهو أمر غير ممكن باستخدام التصلب المتعدد وحده. ومن المؤمل أن تساعد المعرفة المكتسبة من خلال استخدام المضادات الحيوية الفلورية في فهمنا للمقاومة، ومكافحة المضادات الحيوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

المضادات الحيوية الفلورية هي أدوات بحثية متعددة الأغراض تستخدم بسهولة لدراسة مقاومة مضادات الميكروبات ، نظرًا لميزتها الكبيرة على الطرق الأخرى. لإعداد هذه المسابير، يتم تصنيع مشتقات الأزيد من المضادات الحيوية، ثم يقترن الكين فلوروفورس باستخدام أزيد-ألكين ديبولبالإضافةس فوق الكيمياء. بعد التنقية ، يتم اختبار نشاط المضادات الحيوية للمضادات الحيوية الفلورية عن طريق تقييم الحد الأدنى من التركيز المثبط. من أجل دراسة التراكم البكتيري ، يمكن استخدام قياس الطيف الضوئي أو قياس التدفق الخلوي ، مما يسمح بتحليل أبسط بكثير من الطرق التي تعتمد على مشتقات المضادات الحيوية المشعة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام المجهر التكوسي لفحص التوطين داخل البكتيريا، وتوفير معلومات قيمة حول طريقة العمل والتغيرات التي تحدث في الأنواع المقاومة. استخدام تحقيقات المضادات الحيوية الفلورية في دراسة مقاومة مضادات الميكروبات هو طريقة قوية مع الكثير من الإمكانات للتوسع في المستقبل.

الشكل 1 يوضح رد فعل الكيمياء انقر الرئيسية(A)لإعداد المضادات الحيوية الفلورية، ومع(B)أمثلة من هياكل المضادات الحيوية الفلورية المنشورة لدينا على أساس سيبروفلوكساسين (سيبرو)، تريميثوبريم (TMP)، وlinezolid. تم تصنيع جميع هذه المسابير من المضادات الحيوية المقابلة عن طريق وسيط الأزيد. ثم تم اقترانها بـ NBD و DMACA fluorophores ، كل منها يعمل بألكين.
ويبين الشكل 2 على سبيل المثال آثار LCMS من تفاعل نقرة ciprofloxacin-N3 و NBD-alkyne ، حيث يوصف الأزيد عند 3.2 دقيقة والمنتج في 3.8 دقيقة. الأطياف 3 إظهار تأثير التنقية، مع قمم خاطئة تختفي من آثار MS والأشعة فوق البنفسجية. يمكن قياس كل من النقاء وتقدم رد الفعل من خلال دمج ذروة المنتج وأي قمم الشوائب.
يوضح الشكل 3 النتائج النموذجية من تقييم التراكم داخل الخلايا عن طريق التحليل الطيفي الفلوري في وجود وعدم وجود efflux. في هذه التجربة، تم التعامل مع الإشريكية القولونية مع TMP-NBD مع أو بدون إضافة CCCP، الذي ينهار قوة دافع البروتون (PMF). كان الفلورية داخل الخلايا للبكتيريا أعلى بكثير عند المعالجة المسبقة مع CCCP ، مما يشير إلى أن الـ efflux قلل من التراكم في هذه البكتيريا. وتكررت هذه التجربة باستخدام البكتيريا التي تعاني من نقص في التولك، وعرض قدرة هذا الفحص لفحص تأثير مكونات مضخة efflux الفردية. في هذه الحالة ، على الرغم من وجود زيادة في الفلورسين داخل الخلايا مقارنة بالبكتيريا البرية ، لا يزال تراكم CCCP يزداد. هذه النتائج تشير إلى أن tolC يشارك inTMP efflux ولكن ليس الوحيد PMF محرك مضخة المعنية.
يوضح الشكل 4 نتيجة نفس التجربة كالشكل 2، ولكن مع التراكم الذي يقاس بقياس التدفق الخلوي بدلاً من التحليل الطيفي. ولوحظت نفس اتجاهات البيانات، مما يدل على أنه يمكن استخدام أي من التقنيين لدراسة ظاهرة التراكم بوساطة التسيفات داخل الخلايا.
الشكل 5 يظهر صور المجهر confocal التمثيلية من الغرام إيجابية(S. aureus)والبكتيريا السلبية الغرام(E. coli)المسمى مع TMP-NBD(1)وcipro-NBD(2 + 3)تحقيقات الفلورسنت، على التوالي. في كلتا الحالتين، تمت إضافة صبغة الغشاء الأحمر FM4-64FX من أجل مقارنة المشاركة في التعريب. بالنسبة لـ TMP-NBD ، تم استخدام صبغة الحمض النووي الأزرق Hoechst-33342 أيضًا. من خلال تراكب هذه الصور ، تم تصور توطين المضادات الحيوية في البكتيريا. المقارنة بين لوحات 2 و 3 يبين كيف تم فحص تأثير efflux، مع مثبط efflux CCCP المستخدمة في 2،مما أدى إلى تراكم داخل الخلايا. في اللوحة 3، لم يتم إضافة CCCP. وبالتالي ، efflux نشطة ولم ينظر إلى تراكم التحقيق.
الشكل 6 يظهر صور المجهر confocal التمثيلية من غرام إيجابية(S. aureus)البكتيريا المسمى مع DMACA المسمى أوكسازوليدينون التحقيق Lz-NBD. تمت إضافة صبغة الغشاء الأحمر FM4-64FX من أجل مقارنة المشاركة في التعريب ، كما تم استخدام صبغة الحمض النووي الأخضر Hoechst-33342. من خلال تراكب هذه الصور ، تم تصور توطين المضادات الحيوية في البكتيريا ، مما يظهر التعريب الداخلي المتميز عن الغشاء والحمض النووي.
ويبين الجدول 1 قيم هيئة التصنيع العسكري لثلاث سلاسل من المضادات الحيوية الفلورية، السيبروفلوكساسين، وتريميثوبريم (TMP)، وكلانزوليد (Lz)، مع بيانات قدمت للمضادات الحيوية الأم، NBD ومشتقات DMACA لكل منها. تم اختيار الأنواع التمثيلية لكل مضاد حيوي، بما في ذلك كل من الجرام الإيجابي والجرام السلبي. بالنسبة لسلسلة السيبروفلوكساسين ، فقد كلا المسبارين الفلوريين نشاط المضادات الحيوية مقارنة بالدواء الأم ، لكنهما احتفظا ببعض النشاط ضد جميع الأنواع. وبالمثل، فقدت تحقيقات خط الزوليد بعض النشاط، ولكنها ظلت مضادًا حيويًا متوسطًا إلى ضعيفًا. فقدت تحقيقات TMP تقريبا كل نشاط ضد البكتيريا نوع البرية، ولكن كانت نشطة ضد نقص efflux E. القولونية،مما يشير إلى أن فقدان النشاط المضاد للبكتيريا كان بسبب عدم وجود تراكم.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> الشكل 1: تركيب وبنية المسابير المشتقة من المضادات الحيوية. (أ)مخطط رد الفعل العام لتركيب مسابير المضادات الحيوية الفلورية من المضادات الحيوية الأزيدة والألكين-فلوروفوريات. (ب)هياكل تحقيقاتنا المنشورة على أساس سيبروفلوكساسين، تريميثوبريم، وlinezolid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> الشكل 2: قياس نقاء المسبار المشتق من المضادات الحيوية من قبل LCMS. آثار LCMS التحليلية من (1) غير مكتملة ، (2) كاملة ، و (3) HPLC تنقية ciprofloxacin - N3 + NBD - alkyne ردود الفعل انقر مما يدل على اختفاء المواد بدءا من الانتهاء من التفاعل ، وقمم متنوعة على تنقية. A = تتبع الأشعة فوق البنفسجية فيس (امتصاص في 250 نانومتر)، B = تتبع MS (الوضع الإيجابي والسلبي). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> الشكل 3: قياس قارئ الصفائح لتراكم المسبار المشتق من المضادات الحيوية. قياس الطيف الفلوري للتراكم الخلوي لـ TMP-NBD (50 ميكرومتر) في النوع البري (1، ATCC 25922)وtolC (2، ATCC 25922) E. القولونية المحتضنة(A)مع و(B)دون إضافة CCCP (100 ميكرومتر). تظهر الأهمية الإحصائية (**p ≤ 0.01؛ ***p ≤ 0.001) بين غياب أو وجود CCCP وبين النوع البريوtolCE. coli. البيانات المبلغ عنها هي متوسط ± SD لثلاث تجارب. يتم تكييف هذا الرقم من منشورنا السابق15، ويوضح استخدام التحليل الطيفي لتوضيح دور efflux على التراكم داخل الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> الشكل 4: قياس التدفق الخلوي لتراكم المسبار المشتق من المضادات الحيوية. قياس قياس الخلايا تدفق تراكم الخلوية باستخدام TMP-NBD في في النوع البري (1، ATCC 25922)وtolC (2، ATCC 25922) E. القولونية المحتضنة مع وبدون إضافة CCCP (100 ميكرومتر). يظهر متوسط نشاط الفلورسينس من 10000 حادث بكتيري ، الأهمية الإحصائية (***، p ≤ 0.001 ؛ ****، p ≤ 0.0001) بين غياب ووجود CCCP وبين النوع البريوTolCE. coli. البيانات المبلغ عنها هي متوسط ± SD لثلاث تجارب. يتم تكييف هذا الرقم من منشورنا السابق15، ويوضح استخدام قياس التدفق الخلوي لتوضيح دور efflux على التراكم داخل الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> الشكل 5: التصور المجهري التكوّر لتوطين مسبار NBD. صور المجهر كونالبؤر من 1) يعيش S. aureus المسمى مع Hoechst-33342 (الأزرق، الحمض النووي)، TMP-NBD (الأخضر)، FM4-64FX (أحمر، غشاء)، وتراكب؛ 2) يعيش E. القولونية تعامل مع CCCP (مثبط efflux) وصفت مع cipro-NBD (الأخضر)، FM4-64FX (الأحمر، غشاء)، وتراكب؛ 3) يعيش E. القولونية المسمى مع cipro-NBD (الأخضر)، FM4-64FX (الأحمر، غشاء)، وتراكب. هذا الرقم مقتبس من منشوراتنا السابقة15،16، ويوضح استخدام المجهر لفحص توطين المسبار ، بما في ذلك تأثير efflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> الشكل 6: التصور المجهري التكوّر لتوطين مسبار DMACA. صور المجهر كونتشاالبؤر من العيش S. aureus المسمى مع أوكسازوليدين التحقيق Lz-DMACA (الأزرق), Sytox الأخضر (الأخضر, الحمض النووي), وFM4-64FX (غشاء أحمر, غشاء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">هيئة التصنيع العسكري (ميكروغرام/مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">الانواع</td>
			<td>سلاله</td>
			<td>سيبرو</td>
			<td>سيبرو-NBD</td>
			<td>سيبرو دماكا</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>لاينزوليد (Lz)</td>
			<td>LZ-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المكورات العنقودية الأوريوس</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥ 64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>> 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>> 64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التهاب رئوي العقدي</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المكورات المعوية فيكيوم</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥ 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">كليبسيلا الالتهاب الرئوي</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥ 64</td>
			<td>32 - ≥ 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">إيتشيريشيا كولاي</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤ 0.004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>> 64</td>
			<td>> 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>متحولة ΟtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1 - ما إذا كانت هناك أنشطة المضادات الحيوية من تحقيقات المضادات الحيوية الفلورية على أساس سيبروفلوكساسين، تريميثوبريم، وlinezolid ضد السلالات البكتيرية المناسبة ذات الصلة سريريا، كما تقاس بالتحليل MIC MICRODILUTION مرق. في معظم الحالات ، فقدت المسابير بعض النشاط مقارنة بالدواء الأم ، ولكنها احتفظت ببعض فاعلية المضادات الحيوية القابلة للقياس (كافية لتكون مفيدة في دراسات أخرى).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

المضادات الحيوية الموسومة بالفلورسنت هي أدوات قوية يمكن استخدامها لدراسة جوانب متعددة من مقاومة مضادات الميكروبات. تصف هذه المقالة إعداد المضادات الحيوية الموسومة بالفلورسنت وتطبيقها لدراسة مقاومة المضادات الحيوية في البكتيريا. يمكن استخدام المسابير لدراسة آليات المقاومة البكتيرية (على سبيل المثال، efflux) عن طريق قياس الطيف الضوئي، وقياس التدفق الخلوي، والمجهر.

تصور المقاومة البكتيرية باستخدام تحقيقات المضادات الحيوية الفلورية

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

يسمح إعداد المضادات الحيوية الفلورية بتقييم توطين هذه الكواشف العلاجية داخل البكتيريا من خلال تقنيات تحليلية مريحة مثل القياس الطيفي والمجهري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السهولة التي يمكن بها تحديد توطين المضادات الحيوية. هذا التعريب هو ذات الصلة لعدد من الظواهر بما في ذلك efflux.لتنفيذ إجراء رد فعل انقر فوق، ضع مضاد حيوي azide من الفائدة في قارورة أسفل مستديرة وإضافة 25 ملليلتر من البيروتانول العالي و 25 ملليلتر من الماء لكل ملليمول من الأزيد إلى قارورة. إضافة الفلوروفور الكاين أعدت إلى المحلول وسخنا رد فعل إلى 50 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف 0.6 مكافئ من كبريتات النحاس و2.4 مكافئ من حمض الأسكوربيك إلى القارورة.يحرك رد الفعل لمدة ساعة واحدة أو حتى تحليل من قبل LCMS يشير إلى الانتهاء من التفاعل. ثم تبريد وتنقية رد فعل حسب الاقتضاء للسقالة المضادات الحيوية. هنا، مفتاح مفتاح فوق التفاعل الكيميائي لإعداد المضادات الحيوية الفلورية مع أمثلة من هيكل توليفها من المضادات الحيوية المقابلة عبر وسيط أزيد على أساس سيبروفلوكساسين، linezolid، ويتم عرض تريميتهوبريم.في هذه الآثار الطيفية الكتلة الكروماتوغرافية السائلة من أزيدي سيبروفلوكساسين ورد فعل انقر على الكينة الوطنية، تم استلثار azide في 3.2 دقيقة والمنتج كان مُلَح في 3.8 دقيقة. يمكن أن يتبع التقدم في رد فعل النقرة اختفاء قمة azide. في هذه الأطياف، يمكن تصور تأثير التطهير مع القمم الخاطئة تختفي.لتقييم النشاط المضاد للميكروبات من المضادات الحيوية توليفها, مخزون الجلسرين سلسلة من السلالات البكتيرية المناسبة للسقالة المضادات الحيوية على لوحات LB agar وتنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، واختيار مستعمرة واحدة من كل لوحة والثقافة المستعمرات بين عشية وضحاها في خمسة ملليلتر من CAMHB لكل ثقافة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تمييع الثقافات حوالي 40 مرة في CAMHB الطازجة وتنمو البكتيريا إلى منتصف مرحلة السجل مع كثافة بصرية في 600 نانومتر بين 0.4 و 0.8.المقبل, إعداد حلول الأسهم من كل مضاد حيوي الفلورسنت في 1.28 ملليغرام لكل ملليلتر في 20٪ ثنائي الفينيل السلفيد في الماء المعقم وإضافة 10 ميكرولترات من المضادات الحيوية إلى كل بئر من العمود الأول من لوحة 96 جيدا. أضف 90 ميكرولترات من CAMHB إلى كل بئر من العمود الأول و50 ميكرولترات إلى جميع الآبار الأخرى. ثم قم بإجراء تخفيف متسلسل مزدوج عبر اللوحة.بعد خلط دقيق، تمييع الثقافات مرحلة منتصف سجل إلى ما يقرب من مرة واحدة 10 إلى وحدة تشكيل مستعمرة السادسة لكل ملليلتر وإضافة 50 ميكرولترات من كل ثقافة إلى آبار التخفيف للحصول على تركيز النهائي من حوالي خمس مرات 10 إلى مستعمرة الخامسة تشكيل وحدات لكل ملليلتر. عندما تم مطلي جميع البكتيريا، ووضع الأغطية على لوحات واحتضان الثقافات لمدة 18 إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية دون اهتزاز. في اليوم التالي، فحص بصريا لوحات.وسيكون الحد الأدنى من تركيز التثبيط هو أدنى مستوى تركيز جيد دون نمو واضح. لتحليل تراكم التحقيق, الأسهم الجلسرين سلسلة من السلالات البكتيرية على لوحات LB أجار لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، اختر مستعمرة واحدة من الصحن لثقافة بين عشية وضحاها في مرق الlysogeny في 37 درجة مئوية.في صباح اليوم التالي ، تمييع ثقافة بين عشية وضحاها ما يقرب من 50 أضعاف في الوسط الطازج. عندما تصل الثقافة إلى منتصف مرحلة السجل ، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وdedeant المتوسطة. إعادة تعليق البكتيريا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي البكتيريا مرة أخرى.Decant فائقة و resuspend بيليه غسلها في برنامج تلفزيوني إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر من اثنين. إضافة 10.1 ميكرولترات من 10 ملليمتر CCCP في برنامج تلفزيوني إلى ملليلتر واحد من البكتيريا واحتضان البكتيريا في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من 10 إلى 100 محلول المضادات الحيوية الفلورية الدقيقة في برنامج تلفزيوني.بعد حضانة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي أربع مرات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة في غسل. بعد الغسيل ، تحلل البكتيريا مع 180 ميكرولترات من عازلة التحلل و 70 ميكرولترات من lysozyme. بعد 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، تجميد ذوبان البكتيريا ثلاث مرات في ناقص 78 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على التوالي.بعد الجولة الأخيرة من التجميد ذوبان، سونيكات العينة لمدة 20 دقيقة تليها حضانة 30 دقيقة في 65 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، وجمع العينة lysed عن طريق الطرد المركزي والضغط على محتويات الأنبوب من خلال غشاء مرشح 10 كيلودالتون. غسل المرشح أربع مرات مع 100 ميكرولترات من الماء لكل غسل و aliquot كل غسل في آبار فردية من أسفل مسطحة سوداء 96 جيدا لوحة.ثم قياس كثافة الفلوريسين على قارئ لوحة مع الإثارة والطول الموجي الانبعاثات المناسبة لفلوروفور. هذه النتائج النموذجية من تقييم تراكم داخل الخلايا عن طريق التحليل الطيفي الفلوري في وجود وعدم وجود ايفلاكس تبين أن الفلورية داخل الخلايا من البكتيريا أعلى بكثير بعد المعالجة المسبقة مع CCCP مما يدل على أن efflux يقلل من تراكم داخل البكتيريا. في هذه الصور المجهرية confocal تمثيلية من البكتيريا السلبية الغرام إيجابية غرام، توطين المضادات الحيوية داخل البكتيريا يمكن تصور بعد العلاج CCCP.ولا يلاحظ وجود هذه الظاهرة عند إضافة أي من الـ CCCP. عند استخدام المضادات الحيوية الفلورية، يجب مراعاة المعلومات التي تهدف إلى جمعها وتأكد من مراعاة البروتوكول الذي سيكون أكثر فائدة عند الحصول على هذه البيانات. بعد توليفها، يمكن استخدام المضادات الحيوية الفلورية لدراسة عدد من العمليات البكتيرية بما في ذلك التفاعلات هدف المخدرات وتعديلات المقاومة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

فحوصات لدراسة دور فيترونيكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

المضادات الحيوية Dereplication باستخدام منصة مقاومه المضادات الحيوية

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...