Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

MRLS støttes af en australsk Postgraduate Award (APA) og et institut for Molecular Biosciences Research Advancement Award. Wanida Phetsang blev støttet af UQ International Scholarship (UQI) og IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC er en NHMRC princip forsker (APP1059354) og har også en fraktioneret professoriel forskning stipendiat udnævnelse på University of Queensland, med sin resterende tid som administrerende direktør for Inflazome Ltd, en virksomhed, der udvikler lægemidler til at løse kliniske uopfyldte behov i inflammatorisk sygdom. MATB støttes delvist af Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z og NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi blev udført på Australian Cancer Research Foundation (ACRF) / Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som blev etableret med støtte fra ACRF.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

Forfatterne har intet at erklære.

Oprettelsen af en vellykket fluorescerende antibiotika sonde skal begynde med omhyggelig planlægning og overvejelse af SAR af moderselskabet stof. Hvis SAR ikke er kendt eller fuldt udforsket, kan det være nødvendigt at teste flere muligheder for at finde et sted, der kan ændres selektivt uden at afskaffe biologisk aktivitet. Når et sted/erne er blevet identificeret, er det ofte vigtigt at installere et linker moiety for at give steric afstand mellem det biologiske virkningssted og den inaktive fluorophore. Man skal være omhyggelig med, at den reaktion, der anvendes til at fastgøre linkeren til antibiotikummet, efterlader en biostabil funktionel gruppe, der for eksempel undgår estere, der er modtagelige for spaltning af esteraser in vivo. Afhængigt af antibiotikumts farmakodynamiske og farmakokinetiske profil kan der anvendes en simpel alkyllinker, eller ser det ud til, at der er en mindre lipofile mulighed, såsom en polyethylenglycol (PEG). Med linker en vedhæftet, den antibakterielle aktivitet bør vurderes for at sikre MIC mod relevante bakterier svarer til den forælder sammensatte.
I dette arbejde anbefaler vi brug af Huigsen azide-alkyne [3+2] dipolar cycloaddition (klik kemi, se figur 1)til ligatfluorophore til antibiotika, af en række årsager. Klik reaktioner er meget selektiv, hvilket betyder, at beskyttelse af reaktive grupper på antibiotika ikke er nødvendig, og yderligere, reaktionen efterlader en stabil, biokompatibel triazol moiety. Azide komponent introduceres til antibiotika del i vores procedurer, da dette generelt er lettere at udføre med en række strukturelle typer end indførelsen af en alkyne. Synteterne af to alkyne-derivatiserede fluorophorer er beskrevet her, selv om andre kunne udforskes, hvis det ønskes. NBD og DMACA blev valgt på grund af deres lille størrelse, hvilket minimerede muligheden for at forstyrre celleindtrængning og målinteraktion. Selve klikreaktionen udføres ved hjælp af kobberkatalyse, hvor enten Cu2+ (CuSO4, med et ascorbinsyrereduktionsmiddel) eller Cu+ (CuI) kan anvendes som startreagens. Efter rensning (figur 2)bør mIC'erne derefter testes som med azide. Selv med nøje overvejelse af fluorophore valg og sted for fastgørelse, er det muligt, at dårlig antibiotikaaktivitet vil blive observeret. Dette betyder dog ikke, at en inaktiv sonde er uden brug. Som vist med TMP sonder, forbindelser med dårlig antibakteriel aktivitet kan stadig binde sig til det samme mål som moderselskabet stof. Dette kan gøre det muligt at undersøge virkningstilstanden og undersøge fænomener, der fører til resistens, såsom udstrømning.
Som beskrevet i afsnittet protokoller er det muligt at analysere bakteriel mærkning af fluorescerende antibiotika ved hjælp af enten en simpel spektrofotometrianalyse (figur 3) eller flowcytometri (figur 4). Begge metoder er i stand til at kvantificere cellulær akkumulering, og ved lysing celler og undersøge fluorescens lokalisering i lysate, er det muligt at vurdere intracellulære ophobning. I denne protokol beskrives brugen af lysozym til cellelyse, da dette er en hurtig, universel teknik. Andre lysis tilstande, såsom natten behandling med glycin-HCl7, er også blevet anvendt med succes. Ved hjælp af denne teknik, er det muligt at undersøge virkningen af efflux på antibiotika cellulære ophobning, som er en vigtig mekanisme af resistens. Hvis efflux er faktisk til stede i bakterier, en mangel på intracellulære ophobning vil blive observeret, selv om dette kan reddes ved hjælp af en efflux hæmmer som CCCP.
Mikroskopi kan også udføres for visuelt at inspicere sonde lokalisering i forskellige bakterier, samle oplysninger om virkningsmekanisme, og potentielt også modstand (se figur 5 for repræsentative eksempler). For at se lokalisering inden for bakterier kræves der et konfokalmikroskop med høj opløsning, der er udstyret med funktioner som SIM (struktureret belysningsmikroskopi), SR-SIM (superopløsning-SIM), Airyscan eller STED (stimuleret emissionsudtynding). Desuden bør der anvendes højtydende dæksedler, og der foretages analyse efter billedbehandling på en passende software (f.eks. Lokalisering af sonder sammenlignes med farvestoffer, der pletter specifikke arkitekturer, såsom Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), Syto-9 (grøn, nukleinsyre), og FM4-64FX (rød, membran). Valget af farvestoffer bør foretages for at matche fluorescerende antibiotika, således at hver farve, der anvendes har minimal spektrale overlapning. For at opnå de bedst mulige billeder kan optimering være påkrævet. For eksempel, hvis bakterier er for overfyldt på diaset, tage kun en del af den suspenderede pellet, derefter fortyndes med mere montering medium. I modsætning hertil, hvis bakterier er for sparsomme på diaset, skal du blot starte med flere bakterier. I denne protokol anbefales brugen af en termovenbar gel, der er kompatibel med levende celler (f.eks. Cygel), til levende cellebilleddannelse, da det immobiliserer bakterier (herunder motilebakterier), men andre monteringsmedier eller agarose er også blevet anvendt med succes.
Samlet set, på trods af udfordringer, der kan blive konfronteret med udarbejdelsen af en biologisk aktiv fluorescerende antibiotikaderivater, enkelheden i deres anvendelse og deres alsidighed gør disse sonder attraktive værktøjer til forskning i AMR. Fremtidigt arbejde med fluorescerende antibiotika har potentiale til at give indsigt i mekanismer af antibiotikaresistens, forbedre vores forståelse af, hvordan de nuværende antibiotika fungerer, og støtte udviklingen af bedre lægemidler.

Antimikrobiel resistens (AMR) er en stigende krise, som udgør en stor trussel mod menneskers sundhed rundt om i verden. Resistens over for de fleste antibiotika er blevet rapporteret, og infektioner forårsaget af bakterier resistente over for alle klinisk tilgængelige lægemidler er på vej frem. For at bekæmpe stigningen i AMR, er vi nødt til at øge vores forståelse af dette mangesidede fænomen og de underliggende mekanismer og interaktioner mellem antibiotika og bakterier. Et aspekt, der er blevet historisk dårligt forstået, er gennemtrængelighed af antibiotika til bakterier, sammen med fænomener af akkumulering og efflux. Denne viden er afgørende for udformningen af nye lægemidler og forståelse mekanismer af resistens. Derfor spiller dette en afgørende rolle i AMR forskning.
Der er to hovedtilgange, der kan træffes for at måle antibiotikakoncentration: måling af lægemidlet direkte eller mærkning med en moiety designet til at lette kvantificering. Selv om tagging antibiotika forbedrer påvisning, Dette kan forstyrre den biologiske aktivitet af lægemidlet, såsom antimikrobiel aktivitet og gennemtrængelighed. Dette er ikke et problem for umærkede metoder; Det kan dog være en udfordring at detektere. I de seneste år har teknologiske fremskridt ført til et boom i forskning ved hjælp af massespektrometri (MS) til direkte at måle antibiotikakoncentrationen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Disse undersøgelser har vist, at det er muligt at studere intracellulær ophobning i en række forskellige bakterier, med gram-negative bakterier de mest undersøgte. Kvantificeringen af molekylepermeabilitet er derefter blevet kædet sammen med aktivitet og anvendes til at informere om lægemiddeludvikling2,3,4, selv om der skal udvises forsigtighed , når der skal udvises direkte sammenblanding af akkumulering og målaktivitet5. Forud for ms udvikling, de eneste antibiotika, hvis koncentration kunne måles direkte var dem, der besidder iboende fluorescens, såsom tetracyklin og quinoloner8,9,10,11. Selv om akkumulering og udstrømning tydeligvis var begrænset, blev akkumulering og udstrømning undersøgt og kvantificeret, hvilket illustrerer nytten af fluorescensbaseret kvantificering.
Tagged antibiotika har været brugt i mange årtier til at studere distributioner, virkningsformer, og resistens, med radioaktive og fluorescerende tags er fælles. Radio-tagged sonder har den fordel, at være næsten identisk med moderselskabet sammensatte, derfor den biologiske aktivitet er usandsynligt, at være væsentligt anderledes. Isotoper som 3H, 14C og 15N er ofte blevet anvendt på grund af disse elementers fremtrædende plads i antibiotika, og en række antibiotikastilladser er blevet undersøgt1,10,12,13. Selv om detekteringen af radiosonder er enkel, er der en række logistiske problemer (f.eks. sikkerhed, isotophalveringstid), som har begrænset brugen af denne tilgang. En anden strategi er fluorescerende-mærkede antibiotika. Disse sonder kan bruges til at undersøge fordelingen og virkningsmåder og modstand af moderselskabet stof, ved hjælp af enklere teknologi end MS og uden logistiske problemer med stråling8. Den største ulempe ved denne fremgangsmåde er, at antibiotika generelt er relativt små molekyler, og derfor udgør indførelsen af en fluorescerende moiety en betydelig kemisk ændring. Denne ændring kan påvirke fysiokemiske egenskaber og antibakteriel aktivitet. Det skal derfor sikres, at disse faktorer vurderes, så der kan opnås resultater, der er repræsentative for moderantibiotika.
I dette arbejde beskrives en metode til at syntetisere, vurdere og bruge fluorescerende antibiotika, som i vores tidligere publikationer14,15,16. Gennem tidligere arbejde er en række fluorescerende antibiotika blevet tilberedt og anvendt til forskellige formål (se Stone et al.8). For at minimere sandsynligheden for at påvirke biologisk aktivitet anvendes meget små fluorophorer i dette arbejde: nitrobenzoxadiazole (NBD, grøn) og7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-chromen-4-yl (DMACA, blå). Endvidere beskrives vurderingen af antibakteriel aktivitet ved hjælp af den mikrobrote fortyndingsmindstehæmningskoncentration (MIC), således at virkningen af ændringer på aktiviteten kan måles. Disse fluorescerende-mærkede sonder kan bruges i spektrofotometriske analyser, flow cytometri, og mikroskopi. Rækken af mulige anvendelser er, hvor fordelen ved fluorescerende antibiotika ligger. Cellulære akkumulering kan kvantificeres, kategoriseres og visualiseres, noget ikke muligt ved hjælp af MS alene. Det er håbet, at den viden, der opnås ved brug af fluorescerende antibiotika vil støtte i vores forståelse af resistens, og kampen mod AMR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

Fluorescerende antibiotika er multipurpose forskningsværktøjer, der er let anvendes til undersøgelse af antimikrobiel resistens, på grund af deres betydelige fordel i forhold til andre metoder. For at forberede disse sonder, azide derivater af antibiotika er syntetiseret, derefter kombineret med alkyne-fluorophores ved hjælp af azide-alkyne dipolar cycloaddition ved klik kemi. Efter rensning testes fluorescerende antibiotikaantibiotikas antibiotikaaktivitet ved hjælp af en minimal hæmatorisk koncentrationsvurdering. For at studere bakteriel akkumulering, enten spektrofotometri eller flow cytometri kan anvendes, giver mulighed for meget enklere analyse end metoder afhængige af radioaktivt antibiotika derivater. Desuden kan konfokal mikroskopi bruges til at undersøge lokalisering i bakterierne, hvilket giver værdifulde oplysninger om virkningsmekanisme og ændringer, der forekommer i resistente arter. Brugen af fluorescerende antibiotikasonder i studiet af antimikrobiel resistens er en kraftfuld metode med stort potentiale for fremtidig ekspansion.

Figur 1 Illustrerer de vigtigste klik kemi reaktion (A) for fremstilling af fluorescerende antibiotika, og med (B) eksempler på strukturer af vores offentliggjorte fluorescerende antibiotika baseret på ciprofloxacin (cipro), trimethoprim (TMP), og linezolid. Disse sonder blev alle syntetiseret fra de tilsvarende antibiotika via en azide mellemliggende. De blev derefter koblet til NBD og DMACA fluorophores, hver funktionaliseret med en alkyne.
Figur 2 viser eksempel LCMS spor fra en ciprofloxacin-N3 og NBD-alkyne klik reaktion, hvor azide euted på 3,2 min og produktet på 3,8 min. Sammenligning 1 og 2 viser, hvordan udviklingen af klik reaktion kunne følges af forsvinden af azide peak (af UV eller MS detektor). Spectra 3 demonstrere virkningen af rensning, med fejlagtige toppe forsvinder fra MS og UV spor. Både renhed og reaktionsfremskridt kan kvantificeres ved integration af produkttoppen og eventuelle renhedsspidser.
Figur 3 viser typiske resultater af vurderingen af intracellulær akkumulering ved fluorescensspektroskopi i nærvær og fravær af efflux. I dette eksperiment blev E. coli behandlet med TMP-NBD med eller uden tilsætning af CCCP, som kollapser protonens drivkraft (PMF). Bakteriernes intracellulære fluorescens var betydeligt højere, når de blev forbehandlet med CCCP, hvilket indikerer, at efflux reducerede akkumuleringen i disse bakterier. Dette eksperiment blev gentaget ved hjælp af bakterier mangelfuld i tolC, viser kapaciteten af denne analyse til at undersøge virkningen af de enkelte efflux pumpe komponenter. I dette tilfælde, selv om der var en stigning i intracellulær fluorescens i forhold til den vilde type bakterier, CCCP ophobning stadig steget. Disse resultater viser, at TolC deltager i TMP efflux, men er ikke den eneste PMF-drev pumpe involveret.
Figur 4 viser resultatet af det samme eksperiment som figur 2, men med akkumuleringen målt ved flowcytometri i stedet for spektroskopi. De samme datatendenser blev observeret, hvilket viser, at begge teknikker kan anvendes til at undersøge fænomenet efflux medieret intracellulær akkumulering.
Figur 5 viser repræsentative konfokale mikroskopibilleder af grampositive (S. aureus) og gramnegative bakterier (E. coli) mærket med henholdsvis TMP-NBD (1) og cipro-NBD ( 2+ 3) fluorescerende sonder. I begge tilfælde blev det røde membranfarvestof FM4-64FX tilføjet for at sammenligne co-lokalisering. For TMP-NBD blev det blå nukleinsyrefarvefarve, Hoechst-33342 også anvendt. Ved at overlejre disse billeder blev lokaliseringen af antibiotika i bakterierne visualiseret. Sammenligning af paneler 2 og 3 viser, hvordan virkningen af efflux blev undersøgt, med efflux hæmmer CCCP anvendes i 2, hvilket resulterer i intracellulær akkumulering. I panel 3blev der ikke tilføjet nogen CCCP. Derfor er efflux aktiv, og ingen sonde ophobning blev set.
Figur 6 viser repræsentative konfokale mikroskopibilleder af Gram-positive (S. aureus)bakterier mærket med DMACA-mærket oxazolidinone sonde Lz-NBD. Den røde membran farvestof FM4-64FX blev tilføjet for at sammenligne co-lokalisering, og den grønne nukleinsyre farvestof Hoechst-33342 blev også brugt. Ved at overlejre disse billeder, lokalisering af antibiotika i bakterierne blev visualiseret, viser intern lokalisering adskiller sig fra membranen og nukleinsyre.
Tabel 1 viser MIC-værdier for tre serier af fluorescerende antibiotika, ciprofloxacin, trimethoprim (TMP) og linezolid (Lz), med data præsenteret for moderantibiotika, NBD og DMACA derivater af hver. Repræsentative arter for hvert antibiotikum blev valgt, herunder både gram-positiv og gram-negativ. For ciprofloxacin serien, begge fluorescerende sonder mistet antibiotikaaktivitet i forhold til moderselskabet stof, men beholdt nogle aktivitet mod alle arter. Tilsvarende linezolid sonder mistet nogle aktivitet, men forblev en moderat til svag antibiotikum. TMP sonder mistet næsten al aktivitet mod vilde type bakterier, men var aktive mod efflux mangelfuld E. coli, hvilket indikerer, at tabet af antibakterielaktivitet skyldtes manglende ophobning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> Figur 1: Syntese og strukturer af antibiotika-afledte sonder. A) Den generelle reaktionsordning for syntese af fluorescerende antibiotikasonder fra azid-antibiotika og alkyne-fluorophorer. (B) Strukturerne i vores offentliggjorte sonder baseret på ciprofloxacin, trimethoprim, og linezolid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> Figur 2: MÅLING af antibiotikaafledt sonderenhed ved LCMS. Analytiske LCMS spor fra (1) ufuldstændige, (2) komplet, og (3) HPLC renset ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne klik reaktioner viser forsvinden af udgangsmateriale ved reaktionsafslutning, og diverse toppe på rensning. A = UV-Vis spor (absorbans ved 250 nm), B = MS spor (positiv og negativ tilstand). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> Figur 3: Pladelæsermåling af antibiotikabaseret sondeakkumulering. Fluorescensspektroskopisk måling af cellulær akkumulering af TMP-NBD (50 μM) i vildtype (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkuberet (A) med ogb) uden tilsætning af CCCP (100 μM). Statistisk signifikans (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) påvises mellem fraværet eller tilstedeværelsen af CCCP og mellem vildtype og ΔtolCE. coli. De indberettede data er den gennemsnitlige ± SD for tre forsøg. Dette tal er tilpasset fra vores tidligere publikation15, og illustrerer brugen af spektroskopi til at belyse den rolle, som efflux på intracellulære ophobning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> Figur 4: Flow cytometri måling af antibiotika-afledt sonde ophobning. Flow cytometri måling af cellulær akkumulering ved hjælp af TMP-NBD i i vild type (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkuberet med og uden tilsætning af CCCP (100 μM). Medianfluorescensaktivitet påvises fra 10.000 bakteriehændelser, Statistisk signifikans (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) vises mellem fraværet og tilstedeværelsen af CCCP og mellem vildtype og ΔtolCE. coli. De indberettede data er den gennemsnitlige ± SD for tre forsøg. Dette tal er tilpasset fra vores tidligere publikation15, og illustrerer brugen af flow cytometri til at belyse den rolle, som efflux på intracellulære ophobning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> Figur 5: Konfokal mikroskopivisualisering af NBD-sondelokalisering. Konfokale mikroskopi billeder af 1) levende S. aureus mærket med Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), TMP-NBD (grøn), FM4-64FX (rød, membran), og overlejret; 2) levende E. coli behandlet med CCCP (efflux hæmmer) mærket med cipro-NBD (grøn), FM4-64FX (rød, membran), og overlejret; 3) levende E. coli mærket med cipro-NBD (grøn), FM4-64FX (rød, membran), og overlejret. Dette tal er tilpasset fra vores tidligere publikationer15,16, og illustrerer brugen af mikroskopi til at undersøge sonde lokalisering, herunder virkningen af efflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> Figur 6: Konfokal mikroskopivisualisering af DMACA-sondelokalisering. Konfokale mikroskopi billeder af levende S. aureus mærket med oxazolidinone sonde Lz-DMACA (blå), Sytox grøn (grøn, nukleinsyre), og FM4-64FX (rød, membran). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">MIC (μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Arter</td>
			<td>Stamme</td>
			<td>Cipro</td>
			<td>Cipro-NBD</td>
			<td>Cipro-DMACA</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>Linezolid (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Streptococcus pneumoniae</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Enterococcus faecium</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Escherichia coli delte et link.</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤0,004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>>64</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>Mutant ΔtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Antibiotikaaktiviteter af fluorescerende antibiotika sonder baseret på ciprofloxacin, trimethoprim, og linezolid mod passende klinisk relevante bakterielle stammer, målt ved bouillon mikrodilution MIC analyser. I de fleste tilfælde mistede sonderne en vis aktivitet i forhold til moderlægemidlet, men beholdt en målelig antibiotikastyrke (tilstrækkelig til at være nyttige i yderligere undersøgelser).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescerende mærkede antibiotika er kraftfulde værktøjer, der kan bruges til at studere flere aspekter af antimikrobiel resistens. Denne artikel beskriver udarbejdelsen af fluorescerende mærkede antibiotika og deres anvendelse til at studere antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan bruges til at studere mekanismer af bakteriel resistens (f.eks, efflux) ved spektrofotometri, flow cytometri, og mikroskopi.

Visualisering af bakteriel resistens ved hjælp af fluorescerende antibiotika sonder

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Fremstilling af fluorescerende antibiotika giver mulighed for vurdering af lokaliseringen af disse terapeutiske reagenser i bakterier gennem bekvem analytiske teknikker såsom spektrofotometri og mikroskopi. Den største fordel ved denne teknik er den lethed, hvormed antibiotika lokalisering kan bestemmes. Denne lokalisering er relevant for en række fænomener, herunder efflux.For at udføre klik En reaktion procedure, placere azide antibiotikum af interesse i en rund bundkolbe og tilsæt 25 milliliter tert-butanol og 25 milliliter vand pr. millimole azide til kolben. Tilsæt den forberedte fluorophore alkyne til opløsningen og varm reaktionen til 50 grader Celsius. Dernæst tilsættes 0,6 ækvivalenter kobbersulfat og 2,4 ækvivalenter ascorbinsyre til kolben.Reaktionen omrøres i en time, eller indtil analyse af LCMS indikerer, at reaktionen er afsluttet. Derefter afkøles og renses reaktionen efter behov for antibiotikumsets stillads. Her er nøglen klik kemi reaktion til fremstilling af fluorescerende antibiotika med eksempler på strukturen syntetiseret fra de tilsvarende antibiotika via en azide mellemliggende baseret på ciprofloxacin, linezolid, og trimethoprim er vist.I disse væskekromatografi massespektrometri spor fra en ciprofloxacin azide og en NBD alkyne klik reaktion, azide blev eluted på 3,2 minutter, og produktet blev eluted på 3,8 minutter. Forløbet af klikreaktionen kan efterfølges af, at azide-toppen forsvinder. I disse spektre kan virkningen af rensningen visualiseres med fejlagtige toppe, der forsvinder.At vurdere den antimikrobielle aktivitet af syntetiseret antibiotikum, streak glycerol lagre af bakterielle stammer egnet til antibiotika stillads på LB agar plader og dyrke kulturer natten over ved 37 grader Celsius. Den næste morgen, vælge en enkelt koloni fra hver plade og kultur kolonierne natten over i fem milliliter CAMHB pr kultur ved 37 grader Celsius. Den næste dag, fortyndes kulturer ca 40-fold i frisk CAMHB og vokse bakterier til midten log fase med en optisk tæthed på 600 nanometer mellem 0,4 og 0,8.Dernæst forberede lageropløsninger af hver fluorescerende antibiotikum på 1,28 mg pr. milliliter i 20% dimethylsulfoxid i sterilt vand og tilsæt 10 mikroliter af antibiotika til hver brønd af den første kolonne af en 96-brønd plade. Tilføj 90 mikroliter CAMHB til hver brønd i den første kolonne og 50 mikroliter til alle de andre brønde. Derefter udføre en seriel dobbelt fortynding på tværs af pladen.Efter grundig blanding fortyndes mellemstammefasekulturerne til ca. en gange 10 til den sjette koloni, der danner enheder pr. milliliter, og der tilsættes 50 mikroliter af hver kultur til fortyndingsbrøndene for at opnå en endelig koncentration på ca. fem gange 10 til den femte koloni, der danner enheder pr. milliliter. Når alle bakterierne er blevet belagt, skal du placere låg på pladerne og inkubere kulturerne i 18 til 24 timer ved 37 grader Celsius uden at ryste. Den næste dag, visuelt inspicere pladerne.Den mindste hæmning koncentration vil være den laveste koncentration godt uden synlig vækst. Til sondeakkumuleringsanalyse, stribeglycerol lagre af de bakterielle stammer på LB agar plader for en overnatning inkubation ved 37 grader Celsius. Den næste morgen, vælge en enkelt koloni fra pladen til natten kultur i lysogene bouillon på 37 grader Celsius.Den næste morgen, fortynde natten kultur ca 50-fold i frisk medium. Når kulturen når midten log fase, pellet bakterierne ved centrifugering og dekantere mediet. Opslæm bakterierne i en milliliter PBS og centrifuge bakterierne igen.Dekanter supernatanten og opsalt den vaskede pellet i PBS til en optisk tæthed ved 600 nanometer på to. Tilsæt 10,1 mikroliter på 10 millimolar CCCP i PBS til en milliliter bakterier og inkuber bakterierne ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Ved inkubationens afslutning opsamles bakterierne ved centrifugering og pellets i en milliliter på 10 til 100 mikromolarlymulorescerende antibiotikumopløsning i PBS.Efter 30 minutters inkubation ved 37 grader Celsius vaskes cellerne ved centrifugering fire gange i en milliliter kold PBS pr. vask. Efter vask, lyse bakterier med 180 mikroliter af lysis buffer og 70 mikroliter af lysozym. Efter 30 minutter ved 37 grader Celsius, fryse-tø bakterierne tre gange ved minus 78 grader Celsius i fem minutter og 34 grader Celsius i 15 minutter hhv.Efter den sidste runde af fryse-optøning, sonikere prøven i 20 minutter efterfulgt af en 30 minutters inkubation ved 65 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning udtages den lysede prøve ved centrifugering, og rørindholdet belastes gennem en 10 kilodaltonfiltermembran. Vask filteret fire gange med 100 mikroliter vand pr vask og aliquot hver vask i individuelle brønde af en sort flad bund 96-brønd plade.Derefter måle fluorescens intensitet på en pladelæser med excitation og emission bølgelængder passer til fluorophore. Disse typiske resultater fra vurderingen af intracellulær akkumulering ved fluorescensspektroskopi i nærvær og fravær af efflux viser, at bakteriernes intracellulære fluorescens er signifikant højere efter forbehandling med CCCP, hvilket indikerer, at efflux reducerer akkumuleringen i bakterierne. I disse repræsentative konfokale mikroskopi billeder af Gram positive og Gram negative bakterier, lokalisering af antibiotika i bakterierne kan visualiseres efter CCCP behandling.Dette fænomen er ikke observeret, når ingen CCCP er tilføjet. Når du bruger fluorescerende antibiotika, være opmærksom på, hvilke oplysninger du sigter mod at indsamle og være sikker på at overveje, hvilken protokol vil være mest nyttigt, når de får disse data. Efter deres syntese, fluorescerende antibiotika kan bruges til at studere en række bakterielle processer, herunder lægemiddel mål interaktioner og resistens modifikationer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En-dags Workflow ordningen for bakteriepatogen Detection og antimikrobiel resistens fra blodkulturer

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering af bakterielt toksin Inducerede Responses Brug af Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hurtig screening af HIV revers transkriptase og Integrase hæmmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Fremstilling af en blodkultur Pellet til hurtig bakteriel identifikation og antibiotikaresistens undersøgelserne

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays til at studere rollen, som Vitronectin i bakteriel adhæsion og Serum modstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering af IL-22-udtrykkende Lymfocytter Brug Reporter Mus

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering af Candida albicans i murine mave-tarmkanalen ved hjælp fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotika-Dereplication ved hjælp af antibiotikaresistens platformen

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Etablering af en Porcine Ex Vivo Hornhinde Model for at studere medicinske behandlinger mod bakteriel Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...