Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

MRLS wordt ondersteund door een Australian Postgraduate Award (APA) en een Institute for Molecular Biosciences Research Advancement Award. Wanida Phetsang werd ondersteund door UQ International Scholarship (UQI) en IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC is een NHMRC principe research fellow (APP1059354) en heeft ook een fractionele professorial onderzoek collega-benoeming aan de Universiteit van Queensland, met zijn resterende tijd als CEO van Inflazome Ltd, een bedrijf dat geneesmiddelen ontwikkelt om klinische onvervulde behoeften bij ontstekingsziekte aan te pakken. MATB wordt mede ondersteund door Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z en NHMRC Development grant APP1113719. Microscopie werd uitgevoerd op de Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, die werd opgericht met de steun van de ACRF.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

De oprichting van een succesvolle fluorescerende antibioticum sonde moet beginnen met zorgvuldige planning en overweging van de SAR van de ouder drug. Als de SAR niet bekend of volledig wordt onderzocht, moeten mogelijk verschillende opties worden getest om een locatie te vinden die selectief kan worden gewijzigd zonder de biologische activiteit af te schaffen. Zodra een site/s is geïdentificeerd, is de installatie van een linkermoiety vaak essentieel om een steric afstand te bieden tussen de biologische plaats van handeling en het inactieve fluoroffere. Er moet voor worden gezorgd dat de reactie die wordt gebruikt om de linker aan het antibioticum te bevestigen, een biostabiele functionele groep achterlaat, waardoor bijvoorbeeld esters worden vermeden die gevoelig zijn voor decolleté door esterases in vivo. Afhankelijk van het farmacodynamische en farmacokinetische profiel van het antibioticum kan een eenvoudige alkyl-linker worden gebruikt, of anders moet een minder lipofiele optie zoals een linkerpolyethyleenglycol (PEG) worden overwogen. Met de linker eraan moet de antibacteriële activiteit worden beoordeeld om ervoor te zorgen dat de MIC's tegen relevante bacteriën vergelijkbaar zijn met de bovenliggende verbinding.
In dit werk raden we het gebruik van Huigsen azide-alkyne [3+2] dipolaire cycloaddition (klik chemie, zie figuur 1) aan om fluorophore te ligate neigen tot antibioticum, om een aantal redenen. Klikreacties zijn zeer selectief, wat betekent dat bescherming van reactieve groepen op het antibioticum niet nodig is, en verder laat de reactie een stabiele, biocompatibele triazole moiety achter. De azide component wordt geïntroduceerd in het antibioticum gedeelte in onze procedures, omdat dit over het algemeen gemakkelijker wordt bereikt met een verscheidenheid van structurele types dan de invoering van een alkyne. De syntheses van twee alkyne-derivatized fluorophores worden hier beschreven, hoewel anderen indien gewenst kunnen worden onderzocht. NBD en DMACA werden gekozen vanwege hun kleine omvang, waardoor de mogelijkheid van interferentie met celpenetratie en doelinteractie tot een minimum werd beperkt. De klikreactie zelf wordt uitgevoerd met behulp van koperkatalyse, waarbij cu2+ (CuSO4, met een ascorbinezuur) of Cu+ (CuI) als startreagens kan worden gebruikt. Na zuivering (figuur 2), moeten de MIC's vervolgens worden getest zoals bij de azide. Zelfs met zorgvuldige overweging van fluorophore keuze en de plaats van gehechtheid, is het mogelijk dat een slechte antibiotica activiteit zal worden waargenomen. Dit betekent echter niet dat een inactieve sonde zonder gebruik is. Zoals getoond met de TMP sondes, verbindingen met een slechte antibacteriële activiteit kan nog steeds binden aan hetzelfde doel als de moederdrug. Dit kan studies mogelijk maken naar de werkingswijze en het onderzoeken van verschijnselen die leiden tot resistentie, zoals de Efflux.
Zoals beschreven in de protocollen sectie, is het mogelijk om bacteriële etikettering te analyseren door de fluorescerende antibiotica met behulp van een eenvoudige spectrofotometrie test (Figuur 3) of flow cytometrie (figuur 4). Beide methoden zijn in staat om cellulaire accumulatie te kwantificeren, en door cellen te lyseren en fluorescentielokisatie in lysaat te onderzoeken, is het mogelijk om intracellulaire accumulatie te beoordelen. In dit protocol wordt het gebruik van lysozyme voor cellyse beschreven, omdat dit een snelle, universele techniek is. Andere lysisaandoeningen, zoals 's nachts behandeling met glycine-HCl7, zijn ook met succes gebruikt. Met behulp van deze techniek is het mogelijk om de impact van efflux op de cellulaire accumulatie van antibiotica te bestuderen, wat een belangrijk mechanisme van resistentie is. Als efflux inderdaad aanwezig is in de bacteriën, zal een gebrek aan intracellulaire accumulatie worden waargenomen, hoewel dit kan worden gered met behulp van een efflux-remmer zoals CCCP.
Microscopie kan ook worden uitgevoerd om de lokalisatie van sondes in verschillende bacteriën visueel te inspecteren, waarbij informatie wordt verkregen over de werkingswijze en mogelijk ook resistentie (zie figuur 5 voor representatieve voorbeelden). Om lokalisatie binnen bacteriën te zien, is een confocale microscoop met hoge resolutie vereist, uitgerust met mogelijkheden zoals SIM (gestructureerde verlichtingsmicroscopie), SR-SIM (superresolutie-SIM), Airyscan of STED (gestimuleerde emissie-uitputting). Bovendien moeten hoogwaardige afdekkingsbonnen worden gebruikt en moeten nabeeldvormingsanalyses worden uitgevoerd op een geschikte software (bijvoorbeeld FIJI, Zen of Imaris). Lokalisatie van sondes wordt vergeleken met kleurstoffen die specifieke architecturen bevlekken, zoals Hoechst-33342 (blauw, nucleïnezuur), Syto-9 (groen, nucleïnezuur) en FM4-64FX (rood, membraan). De keuze van kleurstoffen moet worden gemaakt om het fluorescerende antibioticum wedstrijd, zodat elke gebruikte kleur heeft minimale spectrale overlap. Om de best mogelijke beelden te verkrijgen, kan optimalisatie nodig zijn. Bijvoorbeeld, als bacteriën te druk op de glijbaan, neem slechts een deel van de zwevende pellet, dan verdunnen met meer montage medium. In tegenstelling, als bacteriën zijn te schaars op de dia, gewoon beginnen met meer bacteriën. In dit protocol wordt het gebruik van een thermoomkeerbare gel die compatibel is met levende cellen (bijvoorbeeld Cygel) aanbevolen voor live celbeeldvorming, omdat het bacteriën immobiliseert (inclusief motile bacteriën), maar ook andere montagemedia of agarose zijn met succes gebruikt.
Over het algemeen maken de eenvoud van het gebruik en hun veelzijdigheid deze sondes, ondanks de uitdagingen waarmee zij geconfronteerd kunnen worden bij de bereiding van een biologisch actieve fluorescerende antibioticaderivaten, aantrekkelijke instrumenten voor onderzoek in AMR. Toekomstig werk met fluorescerende antibiotica heeft het potentieel om inzicht te geven in mechanismen van antibioticaresistentie, ons begrip te verbeteren van hoe de huidige antibiotica werken en de ontwikkeling van betere geneesmiddelen te helpen.

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een toenemende crisis die een grote bedreiging vormt voor de menselijke gezondheid over de hele wereld. Resistentie tegen de meeste antibiotica is gemeld, en infecties veroorzaakt door bacteriën resistent tegen alle klinisch beschikbare geneesmiddelen zijn in opkomst. Om de opkomst van AMR tegen te gaan, moeten we ons begrip van dit veelzijdige fenomeen en de onderliggende mechanismen en interacties tussen antibiotica en bacteriën vergroten. Een aspect dat historisch slecht is begrepen is de permeatie van antibiotica in bacteriën, samen met de verschijnselen van accumulatie en efflux. Deze kennis is cruciaal bij het ontwerpen van nieuwe geneesmiddelen en het begrijpen van mechanismen van resistentie. Dit speelt dan ook een cruciale rol in AMR-onderzoek.
Er zijn twee belangrijke benaderingen die kunnen worden genomen om de concentratie van antibiotica te meten: het direct meten van het medicijn of het taggen met een moiety die is ontworpen om kwantificering te vergemakkelijken. Hoewel het taggen van het antibioticum de detectie verbetert, kan dit de biologische activiteit van het medicijn verstoren, zoals antimicrobiële activiteit en doorlaatbaarheid. Dit is geen probleem voor niet-gelabelde methoden; detectie kan echter een uitdaging zijn. In de afgelopen jaren hebben technologische vooruitgang geleid tot een hausse in het onderzoek met behulp van massaspectrometrie (MS) om de antibioticaconcentratie in bacteriën1,2,3,4,5,6,7direct te meten. Deze studies hebben aangetoond dat het mogelijk is om intracellulaire accumulatie in een verscheidenheid van bacteriën te bestuderen, met gram-negatieve bacteriën het meest bestudeerd. Kwantificering van de doorlaatbaarheid van moleculen is dan gekoppeld aan activiteit en gebruikt om de ontwikkeling van geneesmiddelen te informeren2,3,4, hoewel voorzichtigheid geboden moet worden wanneer de accumulatie en doelactiviteit direct worden conflating5. Vóór de ontwikkeling van de lidstaten waren de enige antibiotica waarvan de concentratie rechtstreeks kon worden gemeten , antibiotica die intrinsieke fluorescentie bezitten, zoals tetracycline en de quinolonen8,9,10,11. Hoewel duidelijk beperkt in omvang, accumulatie en efflux werden onderzocht en gekwantificeerd, ter illustratie van het nut van fluorescentie gebaseerde kwantificering.
Gelabelde antibiotica zijn gebruikt voor vele decennia om distributies, manieren van handelen, en resistentie te bestuderen, met radioactieve en fluorescerende tags gemeenschappelijk. Radio-tagged sondes hebben het voordeel dat ze bijna identiek zijn aan de bovenliggende verbinding, vandaar dat de biologische activiteit waarschijnlijk niet significant anders zal zijn. Isotopen zoals 3H, 14C en 15N zijn vaak gebruikt vanwege de bekendheid van deze elementen in antibiotica, en een verscheidenheid aan antibiotica steigers zijn onderzocht1,10,12,13. Hoewel de detectie van radiosondes eenvoudig is, zijn er een aantal logistieke problemen (bijvoorbeeld veiligheid, isotoop half-life) die het gebruik van deze aanpak hebben beperkt. Een andere strategie is fluorescerende antibiotica. Deze sondes kunnen worden gebruikt om de distributie en de werkingswijzen en weerstand van het moedermedicijn te onderzoeken, met behulp van eenvoudigere technologie dan MS en zonder de logistieke problemen van straling8. Het belangrijkste nadeel van deze aanpak is dat antibiotica over het algemeen relatief kleine moleculen zijn, vandaar de introductie van een fluorescerende moiety een aanzienlijke chemische verandering. Deze wijziging kan invloed hebben op fysiochemische eigenschappen en antibacteriële activiteit. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat deze factoren worden beoordeeld om resultaten te genereren die representatief zijn voor het moederantibioticum.
In dit werk wordt een methode beschreven om fluorescerende antibiotica te synthetiseren, te beoordelen en te gebruiken, zoals in onze vorige publicaties14,15,16. Door middel van eerder werk zijn een aantal fluorescerende antibiotica bereid en gebruikt voor verschillende doeleinden (zie Stone et al.8). Om de kans op gevolgen voor de biologische activiteit tot een minimum te beperken, worden in dit werk zeer kleine fluorophoren gebruikt: nitrobenzoxadiazole (NBD, groen) en 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl (DMACA, blauw). Verder wordt de beoordeling van antibacteriële activiteit met behulp van de microbouillonverdunningsminimumremmingsconcentratie (MIC)-test beschreven, zodat het effect van wijzigingen op de activiteit kan worden gemeten. Deze fluorescerende sondes kunnen worden gebruikt in spectrofotometrische testen, flow cytometrie en microscopie. Het scala van mogelijke toepassingen is waar het voordeel van fluorescerende antibiotica ligt. Cellulaire accumulatie kan worden gekwantificeerd, gecategoriseerd en gevisualiseerd, iets wat niet mogelijk is met behulp van MS alleen. Het is te hopen dat de kennis opgedaan door het gebruik van fluorescerende antibiotica zal helpen bij ons begrip van resistentie, en de strijd tegen AMR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

Fluorescerende antibiotica zijn multifunctionele onderzoeksinstrumenten die gemakkelijk worden gebruikt voor de studie van antimicrobiële resistentie, vanwege hun aanzienlijke voordeel ten opzichte van andere methoden. Om deze sondes voor te bereiden, worden azidederivaten van antibiotica gesynthetiseerd, in combinatie met alkyne-fluorophores met azide-alkyne dipolaire cycloaddition door klikchemie. Na zuivering wordt de antibioticaactiviteit van het tl-antibioticum getest door een minimale remmende concentratiebeoordeling. Om bacteriële accumulatie te bestuderen, kan spectrofotometrie of stroomcytometrie worden gebruikt, waardoor veel eenvoudigere analyse mogelijk is dan methoden die afhankelijk zijn van radioactieve antibioticaderivaten. Bovendien kan confocale microscopie worden gebruikt om lokalisatie binnen de bacteriën te onderzoeken, waardoor waardevolle informatie wordt verstrekt over de werkingswijze en veranderingen die zich voordoen bij resistente soorten. Het gebruik van fluorescerende antibiotica sondes in de studie van antimicrobiële resistentie is een krachtige methode met veel potentieel voor toekomstige expansie.

Figuur 1 Illustreert de toetsklik chemie reactie (A) voor de voorbereiding van de fluorescerende antibiotica, en met (B) voorbeelden van structuren van onze gepubliceerde fluorescerende antibiotica op basis van ciprofloxacine (cipro), trimethoprim (TMP), en linezolid. Deze sondes werden allemaal gesynthetiseerd uit de overeenkomstige antibiotica via een azide intermediair. Ze werden vervolgens gekoppeld aan de NBD en DMACA fluorophores, elk gefunctionaliseerd met een alkyne.
Figuur 2 toont voorbeeld LCMS-sporen van een ciprofloxacine-N3 en NBD-alkyne klikreactie, waarbij de azide eluted op 3,2 min en het product op 3,8 min. Vergelijking 1 en 2 laat zien hoe de voortgang van de klikreactie kan worden gevolgd door het verdwijnen van de azidepiek (door UV- of MS-detector). Spectra 3 tonen de impact van zuivering, waarbij foutieve pieken uit de MS- en UV-sporen verdwijnen. Zowel de zuiverheid als de reactievooruitgang kunnen worden gekwantificeerd door de integratie van de productpiek en eventuele onzuiverheidspieken.
Figuur 3 toont typische resultaten van de beoordeling van intracellulaire accumulatie door fluorescentiespectroscopie in aanwezigheid en afwezigheid van efflux. In dit experiment werd E. coli behandeld met TMP-NBD met of zonder toevoeging van CCCP, waardoor de protonenbewegingkracht (PMF) instort. De intracellulaire fluorescentie van de bacteriën was aanzienlijk hoger bij voorbehandeling met CCCP, wat aangeeft dat de efflux de accumulatie in deze bacteriën verminderde. Dit experiment werd herhaald met behulp van bacteriën tekort aan tolC, het weergeven van de capaciteit van deze test om de impact van individuele efflux pomp componenten te onderzoeken. In dit geval, hoewel er een toename van intracellulaire fluorescentie in vergelijking met de wilde type bacteriën, CCCP accumulatie nog steeds toegenomen. Deze bevindingen geven aan dat tolC deelneemt aanTMP efflux, maar niet de enige PMF-drive pomp is.
Figuur 4 toont het resultaat van hetzelfde experiment als figuur 2,maar met de accumulatie gemeten door flow cytometrie in plaats van spectroscopie. Dezelfde gegevenstrends werden waargenomen, waaruit blijkt dat beide technieken kunnen worden gebruikt om het fenomeen van de geëmineerde intracellulaire accumulatie te bestuderen.
Figuur 5 toont representatieve confocale microscopiebeelden van respectievelijk gram-positieve(S. aureus) en gramnegatieve bacteriën(E. coli)met tmp-NBD(1) en cipro-NBD (2 + 3) fluorescerende sondes. In beide gevallen werd de rode membraankleurstof FM4-64FX toegevoegd om co-lokalisatie te vergelijken. Voor TMP-NBD werd ook de blauwe nucleïnezuurkleurstof Hoechst-33342 gebruikt. Door deze beelden te overdoden, werd de lokalisatie van het antibioticum in de bacteriën gevisualiseerd. Het vergelijken van de panelen 2 en 3 laat zien hoe de impact van de efflux werd onderzocht, met de efflux-remmer CCCP die in 2 wordtgebruikt, wat resulteert in intracellulaire accumulatie. In paneel 3is geen CCCP toegevoegd. Vandaar dat de Efflux actief is en er geen sondeaccumulatie werd gezien.
Figuur 6 toont representatieve confocale microscopiebeelden van Gram-positieve(S. aureus)bacteriën met DMACA-gelabelde oxazolidinone sonde Lz-NBD. De rode membraan kleurstof FM4-64FX werd toegevoegd om co-lokalisatie te vergelijken, en de groene nuclec zuur kleurstof Hoechst-33342 werd ook gebruikt. Door deze beelden te overdoden, werd de lokalisatie van het antibioticum in de bacteriën gevisualiseerd, die interne lokalisatie duidelijk van het membraan en het nucleïnezuur toont.
Tabel 1 toont MIC-waarden voor drie reeksen fluorescerende antibiotica, ciprofloxacine, trimethoprim (TMP) en linezolid (Lz), met gegevens die worden gepresenteerd voor het moederantibioticum, NBD en DMACA-derivaten van elk. Representatieve soorten voor elk antibioticum werden gekozen, waaronder zowel gram-positief als gram-negatief. Voor de ciprofloxacine-serie verloren beide fluorescerende sondes antibioticaactiviteit in vergelijking met het moedermedicijn, maar behielden enige activiteit tegen alle soorten. Op dezelfde manier verloren de linezolidss enige activiteit, maar bleven een matig tot zwak antibioticum. De TMP-sondes verloren bijna alle activiteit tegen wilde bacteriën, maar waren actief tegen efflux-tekort E. coli, wat aangeeft dat het verlies van antibacteriële activiteit te wijten was aan gebrek aan accumulatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> Figuur 1: Synthese en structuren van antibiotica-afgeleide sondes. (A) Het algemene reactieschema voor de synthese van tl-antibioticasondes van azide-antibiotica en alkyne-fluorophores. (B) De structuren van onze gepubliceerde sondes op basis van ciprofloxacine, trimethoprim en linezolid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> Figuur 2: Meting van de zuiverheid van de door antibiotica afgeleide sonde door LCMS. Analytische LCMS-sporen van (1) onvolledig, (2) compleet en (3) HPLC gezuiverdciprofloxacine-N3 + NBD-alkyne klikreacties die het verdwijnen van uitgangsmateriaal aantonen na het voltooien van de reactie, en diverse pieken op zuivering. A = UV-Vis spoor (absorptie bij 250 nm), B = MS trace (positieve en negatieve modus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> Figuur 3: Plaatlezer meting van op antibiotica afgeleide sondeaccumulatie. Fluorescentiespectroscopische meting van cellulaire accumulatie van TMP-NBD (50 μM) in wilde type (1, ATCC 25922) en ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli geïncubeerd(A) met en(B)zonder toevoeging van CCCP (100 μM). Statistische significantie (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) wordt weergegeven tussen de afwezigheid of aanwezigheid van CCCP en tussen het wilde type en ΔtolCE. coli. Gerapporteerde gegevens zijn het gemiddelde ± SD voor drie experimenten. Dit cijfer is aangepast aan onze vorige publicatie15, en illustreert het gebruik van spectroscopie om de rol van efflux op intracellulaire accumulatie op te helderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> Figuur 4: Flow cytometrie meting van opantibiotica afgeleide sondeaccumulatie. Flow cytometrie meting van cellulaire accumulatie met Behulp van TMP-NBD in het wild type (1, ATCC 25922) en ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli geïncubeerd met en zonder toevoeging van CCCP (100 μM). Mediane fluorescentieactiviteit wordt aangetoond van 10.000 bacteriële voorvallen, Statistische significantie (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) wordt weergegeven tussen de afwezigheid en aanwezigheid van CCCP en tussen het wilde type en ΔtolCE. coli. Gerapporteerde gegevens zijn het gemiddelde ± SD voor drie experimenten. Dit cijfer is aangepast aan onze vorige publicatie15, en illustreert het gebruik van flow cytometrie om de rol van efflux op intracellulaire accumulatie op te helderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> Figuur 5: Confocale microscopievisualisatie van nbd-sondelokalisatie. Confocale microscopie beelden van 1) live S. aureus gelabeld met Hoechst-33342 (blauw, nucleïnezuur), TMP-NBD (groen), FM4-64FX (rood, membraan), en bedekt; 2) live E. coli behandeld met CCCP (efflux-remmer) met cipro-NBD (groen), FM4-64FX (rood, membraan) en bedekt; 3) live E. coli gelabeld met cipro-NBD (groen), FM4-64FX (rood, membraan), en bedekt. Dit cijfer is aangepast aan onze eerdere publicaties15,16, en illustreert het gebruik van microscopie om de lokalisatie van sondes te onderzoeken, inclusief de impact van de efflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> Figuur 6: Confocale microscopievisualisatie van DMACA-sondelokalisatie. Confocale microscopie beelden van live S. aureus gelabeld met oxazolidinone sonde Lz-DMACA (blauw), Sytox groen (groen, nucleïnezuur), en FM4-64FX (rood, membraan). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">MIC (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Soort(en)</td>
			<td>Stam</td>
			<td>Cipro</td>
			<td>Cipro-NBD</td>
			<td>Cipro-DMACA</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>Linezolid (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Streptococcus pneumoniae</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Enterococcus faecium</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Escherichia coli</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤0,004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>>64</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>Mutant ΔtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Antibiotica-activiteiten van fluorescerende antibioticasondes op basis van ciprofloxacine, trimethoprim en linezogleed tegen passende klinisch relevante bacteriële stammen, zoals gemeten door bouillonmicrodilning MIC-tests. In de meeste gevallen verloren de sondes enige activiteit in vergelijking met het bovenliggende medicijn, maar behielden ze een meetbare antibioticapotentie (voldoende om nuttig te zijn in verdere studies).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

De bereiding van fluorescerende antibiotica maakt het mogelijk om de lokalisatie van deze therapeutische reagentia binnen bacteriën te beoordelen door middel van handige analytische technieken zoals spectrofotometrie en microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gemak waarmee de antibioticalokalisatie kan worden bepaald. Deze lokalisatie is relevant voor een aantal verschijnselen, waaronder efflux.Om de klik uit te voeren Een reactieprocedure, plaats het azide antibioticum van belang in een ronde bodemkolf en voeg 25 milliliter tert-butanol en 25 milliliter water per millimole azide toe aan de kolf. Voeg de bereide fluorofofokoe kyne toe aan de oplossing en verwarm de reactie op 50 graden Celsius. Voeg vervolgens 0,6 equivalenten van kopersulfaat en 2,4 equivalenten ascorbinezuur toe aan de kolf.Roer de reactie gedurende een uur of totdat de analyse door LCMS geeft reactie voltooiing. Dan afkoelen en zuiveren van de reactie indien van toepassing voor het antibioticum steiger. Hier wordt de belangrijkste kliktrichemiereactie voor de bereiding van fluorescerende antibiotica met voorbeelden van de structuur gesynthetiseerd van de overeenkomstige antibiotica via een azide intermediate op basis van ciprofloxatine, linezolid en trimethoprim getoond.In deze vloeibare chromatografie massaspectrometrie sporen van een ciprofloxatine azide en een NBD alkyne klikreactie, werd de azide op 3,2 minuten geëlueerd en het product werd op 3,8 minuten geëutteerd. De voortgang van de klikreactie kan worden gevolgd door het verdwijnen van de azidepiek. In deze spectra kan de impact van de zuivering worden gevisualiseerd met foutieve pieken die verdwijnen.Om de antimicrobiële activiteit van het gesynthetiseerde antibioticum te beoordelen, streep glycerol voorraden van bacteriële stammen geschikt voor het antibioticum steiger op LB agar platen en groeien de culturen 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende ochtend, kies een enkele kolonie uit elke plaat en cultuur de kolonies 's nachts in vijf milliliter CAMHB per cultuur op 37 graden Celsius. De volgende dag, verdun de culturen ongeveer 40-voudig in verse CAMHB en groeien de bacteriën tot halverwege log fase met een optische dichtheid op 600 nanometer tussen 0,4 en 0,8.Bereid vervolgens voorraadoplossingen voor van elk fluorescerend antibioticum met 1,28 milligram per milliliter in 20%dimethylsulfoxide in steriel water en voeg 10 microliter antibiotica toe aan elke put van de eerste kolom van een 96-putplaat. Voeg 90 microliter CAMHB toe aan elke put van de eerste kolom en 50 microliter aan alle andere putten. Voer vervolgens een seriële tweevoudige verdunning over de plaat uit.Verdun na het grondig mengen de mid log fase culturen tot ongeveer één keer 10 tot de zesde kolonie vormende eenheden per milliliter en voeg 50 microliter van elke cultuur toe aan de verdunningsputten om een definitieve concentratie van ongeveer vijf keer 10 aan de vijfde kolonievormende eenheden per milliliter te verkrijgen. Wanneer alle bacteriën zijn verguld, plaats deksels op de platen en broeden de culturen voor 18 tot 24 uur op 37 graden Celsius zonder te schudden. De volgende dag, visueel inspecteren van de platen.De minimale remmingsconcentratie is de laagste concentratie goed zonder zichtbare groei. Voor sonde accumulatie analyse, streep glycerol voorraden van de bacteriële stammen op LB agar platen voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, kies een enkele kolonie van de plaat voor 's nachts cultuur in lysogeny bouillon op 37 graden Celsius.De volgende ochtend, verdun de nachtelijke cultuur ongeveer 50-voudig in vers medium. Wanneer de cultuur halverwege de logfase bereikt, pellet de bacteriën door centrifugatie en decanteren het medium. Resuspend de bacteriën in een milliliter PBS en centrifugeren de bacteriën weer.Decanteer de supernatant en resuspend de gewassen pellet in PBS tot een optische dichtheid op 600 nanometer van twee. Voeg 10,1 microliter van 10 millimolar CCCP in PBS toe aan een milliliter bacteriën en incubeer de bacteriën gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel aan het einde van de incubatie de bacteriën door centrifugatie en verdaag de pellet in één milliliter van 10 tot 100 micromolar fluorescerende antibioticaoplossing in PBS.Na een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius, was de cellen door centrifugatie vier keer in een milliliter koude PBS per wasbeurt. Na de was, lyse de bacteriën met 180 microliters van lyse buffer en 70 microliter van lysozyme. Na 30 minuten bij 37 graden Celsius, vries-dooi de bacteriën drie keer bij min 78 graden Celsius gedurende vijf minuten en 34 graden Celsius gedurende 15 minuten respectievelijk.Na de laatste ronde van vriesdooien, sonicate het monster gedurende 20 minuten, gevolgd door een 30 minuten incubatie op 65 graden Celsius. Verzamel aan het einde van de incubatie het gelyseerde monster door centrifugatie en zeef de buisinhoud door een filtermembraan van 10 kilodalton. Was het filter vier keer met 100 microliters water per wasbeurt en aliquot elk wassen in individuele putten van een zwarte platte bodem 96-put plaat.Meet vervolgens de fluorescentieintensiteit op een plaatlezer met excitatie en emissiegolflengten die geschikt zijn voor de fluorofofoër. Deze typische resultaten van de beoordeling van intracellulaire accumulatie door fluorescentiespectroscopie in aanwezigheid en afwezigheid van efflux tonen aan dat de intracellulaire fluorescentie van de bacteriën aanzienlijk hoger is na de voorbehandeling met CCCP, wat aangeeft dat efflux de accumulatie in de bacteriën vermindert. In deze representatieve confocale microscopie beelden van Gram positieve en Gram negatieve bacteriën, de lokalisatie van het antibioticum in de bacteriën kan worden gevisualiseerd na CCCP behandeling.Dit fenomeen wordt niet waargenomen wanneer er geen CCCP wordt toegevoegd. Bij het gebruik van fluorescerende antibiotica, rekening houden met welke informatie u gericht bent te verzamelen en zorg ervoor dat te overwegen welk protocol het meest nuttig zal zijn bij het verkrijgen van deze gegevens. Na hun synthese kunnen fluorescerende antibiotica worden gebruikt om een aantal bacteriële processen te bestuderen, waaronder interacties met geneesmiddelen en resistentiewijzigingen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Tests voor de bestudering van de rol van Vitronectin in bacteriële hechting en een Serum

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotica-Dereplicatie met behulp van het antibioticumresistentie platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Het opzetten van een Porcine Ex Vivo Cornea Model voor het bestuderen van medicamenteuze behandelingen tegen bacteriële keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...