Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
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MRLS est soutenu par un Australian Postgraduate Award (APA) et un Institute for Molecular Biosciences Research Advancement Award. Wanida Phetsang a reçu l’appui de la Bourse internationale de l’UQI et du Prix d’études supérieures de l’IMB (IMBPA). MAC est un chercheur de principe NHMRC (APP1059354) et détient également une nomination de chercheur scientifique fractionnelle à l’Université du Queensland, avec son temps restant en tant que PDG d’Inflazome Ltd, une société développant des médicaments pour répondre aux besoins cliniques non satisfaits dans les maladies inflammatoires. MATB est soutenu en partie par Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z et NHMRC Development grant APP1113719. La microscopie a été réalisée à l’Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, qui a été créé avec le soutien de l’ACRF.

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Les auteurs n’ont rien à déclarer.

La création d’une sonde antibiotique fluorescente réussie doit commencer par une planification et un examen minutieux de la R-S du médicament parent. Si le R Sa n’est pas connu ou complètement exploré, plusieurs options pourraient devoir être testées pour trouver un site qui peut être modifié sélectivement sans abolir l’activité biologique. Une fois qu’un site/s a été identifié, l’installation d’un moiety de lien est souvent essentielle afin de fournir l’espacement stéril issu entre le site biologique d’action et le fluorophore inactif. Il faut prendre soin que la réaction utilisée pour attacher le lien à l’antibiotique laisse un groupe fonctionnel bio-stable, en évitant, par exemple, les esters qui sont sensibles au clivage par les esterases in vivo. Selon le profil pharmacodynamique et pharmacocinétique de l’antibiotique, un simple lien alkyl peut être utilisé, ou bien une option moins lipophile comme un lien de polyéthylène glycol (PEG) devrait être considéré. Avec le lien attaché, l’activité antibactérienne devrait être évaluée pour s’assurer que les MIC contre les bactéries pertinentes sont semblables au composé parent.
Dans ce travail, nous recommandons l’utilisation de Huigsen azide-alkyne [3-2] cycloaddition dipolar (cliquez sur la chimie, voir Figure 1) pour liguer le fluorophore à l’antibiotique, pour un certain nombre de raisons. Les réactions de clic sont très sélectives, ce qui signifie que la protection des groupes réactifs sur l’antibiotique n’est pas nécessaire, et en outre, la réaction laisse une téazole stable et biocompatible moiety. Le composant d’azide est introduit à la partie antibiotique dans nos procédures, car ceci est généralement plus facilement accompli avec une série de types structurels que l’introduction d’un alkyne. Les synthèses de deux fluorophores dérivés de l’alkyne sont décrites ici, bien que d’autres pourraient être explorées si désiré. NBD et DMACA ont été choisis en raison de leur petite taille, minimisant la possibilité d’interférer avec la pénétration cellulaire et l’interaction cible. La réaction de clic elle-même est effectuée à l’aide d’une catalyse en cuivre, où soit Cu2 (CuSO 4, avec un agent de réduction de l’acide ascorbique) ou Cu(CuI) peut être utilisé comme réactif de départ. Après la purification (Figure 2), les MIC doivent ensuite être testés comme avec l’azide. Même avec un examen attentif du choix du fluorophore et du site d’attachement, il est possible que l’activité antibiotique pauvre sera observée. Cela ne signifie toutefois pas qu’une sonde inactive est sans utilisation. Comme le montrent les sondes TMP, les composés ayant une faible activité antibactérienne peuvent encore se lier à la même cible que le médicament parent. Cela peut permettre des études sur le mode d’action et l’examen de phénomènes conduisant à la résistance, tels que l’efflux.
Comme indiqué dans la section des protocoles, il est possible d’analyser l’étiquetage bactérien par les antibiotiques fluorescents à l’aide d’un simple essai de spectrophotométrie (figure 3) ou de cytométrie du débit (figure 4). Les deux méthodes sont capables de quantifier l’accumulation cellulaire, et en lysant les cellules et en examinant la localisation de fluorescence dans le lysate, il est possible d’évaluer l’accumulation intracellulaire. Dans ce protocole, l’utilisation du lysozyme pour la lyse cellulaire est décrite, car il s’agit d’une technique rapide et universelle. D’autres conditions de lyse, telles que le traitement de nuit avec la glycine-HCl7,ont également été utilisées avec succès. En utilisant cette technique, il est possible d’étudier l’impact de l’efflux sur l’accumulation cellulaire d’antibiotiques, qui est un mécanisme majeur de résistance. Si l’efflux est effectivement présent dans les bactéries, un manque d’accumulation intracellulaire sera observé, bien que cela puisse être sauvé à l’aide d’un inhibiteur de l’efflux comme CCCP.
La microscopie peut également être effectuée pour inspecter visuellement la localisation des sondes dans différentes bactéries, recueillir des informations sur le mode d’action, et potentiellement aussi la résistance (voir la figure 5 pour des exemples représentatifs). Afin de voir la localisation dans les bactéries, un microscope confocal à haute résolution est nécessaire, équipé de capacités telles que SIM (microscopie d’éclairage structurée), SR-SIM (superrésolution-SIM), Airyscan, ou STED (épuisement des émissions stimulées). En outre, des bordereaux de couverture haute performance devraient être utilisés et des analyses post-imagerie effectuées sur un logiciel approprié (p. ex. FIJI, Zen ou Imaris). La localisation des sondes est comparée aux colorants qui tachent des architectures spécifiques, telles que Hoechst-33342 (bleu, acide nucléique), Syto-9 (vert, acide nucléique), et FM4-64FX (rouge, membrane). Le choix des colorants doit être fait pour correspondre à l’antibiotique fluorescent, de sorte que chaque couleur utilisée a un chevauchement spectral minimal. Afin d’obtenir les meilleures images possibles, une optimisation peut être nécessaire. Par exemple, si les bactéries sont trop encombrées sur la glissière, ne prenez qu’une partie de la pastille en suspension, puis diluez-vous avec un milieu de montage plus important. En revanche, si les bactéries sont trop clairsemées sur la diapositive, il suffit de commencer avec plus de bactéries. Dans ce protocole, l’utilisation d’un gel thermoréversible compatible avec les cellules vivantes (p. ex. Cygel) est recommandée pour l’imagerie cellulaire vivante, car elle immobilise les bactéries (y compris les bactéries motiles), mais d’autres supports de montage ou agarose ont également été utilisés avec succès.
Dans l’ensemble, malgré les défis qui peuvent être rencontrés dans la préparation d’un dérivé bioactif antibiotique fluorescent, la simplicité de leur utilisation et leur polyvalence font de ces sondes des outils attrayants pour la recherche en RMA. Les travaux futurs utilisant des antibiotiques fluorescents ont le potentiel de fournir un aperçu des mécanismes de résistance aux antibiotiques, d’améliorer notre compréhension du fonctionnement actuel des antibiotiques et d’aider au développement de meilleurs médicaments.

La résistance aux antimicrobiens (RMA) est une crise croissante qui constitue une menace majeure pour la santé humaine dans le monde entier. La résistance à la plupart des antibiotiques a été rapportée, et des infections causées par des bactéries résistantes à tous les médicaments cliniquement disponibles sont en train d’émerger. Afin de lutter contre la montée de l’AMR, nous devons mieux comprendre ce phénomène aux multiples facettes et les mécanismes sous-jacents et les interactions entre les antibiotiques et les bactéries. Un aspect qui a été historiquement mal compris est la perméation des antibiotiques dans les bactéries, avec les phénomènes d’accumulation et d’efflux. Ces connaissances sont cruciales dans la conception de nouveaux médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Par conséquent, cela joue un rôle essentiel dans la recherche sur la RMA.
Il y a deux approches principales qui peuvent être prises afin de mesurer la concentration d’antibiotiques : mesurer le médicament directement ou marquer avec un moiety conçu pour faciliter la quantification. Bien que le marquage de l’antibiotique améliore la détection, cela peut perturber l’activité biologique du médicament, comme l’activité antimicrobienne et la perméabilité. Ce n’est pas un problème pour les méthodes non étiquetées; cependant, la détection peut être difficile. Au cours des dernières années, les progrès technologiques ont conduit à un boom de la recherche utilisant la spectrométrie de masse (MS) pour mesurer directement la concentration d’antibiotiques dans les bactéries1,2,3,4,5,6,7. Ces études ont montré qu’il est possible d’étudier l’accumulation intracellulaire dans une variété de bactéries, avec des bactéries gram-négatives les plus largement étudiées. Quantification de la perméabilité des molécules a ensuite été liée à l’activité et utilisée pour informer le développement de médicaments2,3,4, bien que la prudence doit être prise lors de la confondement direct de l’accumulation et l’activité cible5. Avant le développement de la SP, les seuls antibiotiques dont la concentration pouvait être directement mesurée étaient ceux qui possédaient une fluorescence intrinsèque, comme la tétracycline et les quinolones8,9,10,11. Bien qu’évidemment de portée limitée, l’accumulation et l’efflux ont été examinés et quantifiés, illustrant l’utilité de la quantification basée sur la fluorescence.
Les antibiotiques marqués ont été utilisés pendant de nombreuses décennies pour étudier les distributions, les modes d’action et la résistance, avec des étiquettes radioactives et fluorescentes étant communs. Les sondes radiomarquées ont l’avantage d’être presque identiques au composé parent, d’où l’activité biologique est peu susceptible d’être significativement différente. Des isotopes tels que 3H, 14C et 15N ont été fréquemment utilisés en raison de l’importance de ces éléments dans les antibiotiques, et une variété d’échafaudages antibiotiques ont été examinés1,10,12,13. Bien que la détection des radiosons soit simple, il existe un certain nombre de problèmes logistiques (p. ex., sécurité, demi-vie des isotopes) qui ont limité l’utilisation de cette approche. Une autre stratégie est les antibiotiques fluorescents. Ces sondes peuvent être utilisées pour examiner la distribution et les modes d’action et la résistance du médicament parent, en utilisant une technologie plus simple que la SP et sans les problèmes logistiques de rayonnement8. Le principal inconvénient de cette approche est que les antibiotiques sont généralement des molécules relativement petites, d’où l’introduction d’une moiety fluorescente pose un changement chimique important. Cette altération peut avoir un impact sur les propriétés physiochimiques et l’activité antibactérienne. Par conséquent, il faut prendre soin d’évaluer ces facteurs afin de générer des résultats représentatifs de l’antibiotique parent.
Dans ce travail, une méthode est décrite pour synthétiser, évaluer et utiliser des antibiotiques fluorescents, comme dans nos publications précédentes14,15,16. Grâce à des travaux antérieurs, un certain nombre d’antibiotiques fluorescents ont été préparés et utilisés à diverses fins (voir Stone et al.,8). Afin de minimiser la probabilité d’impact sur l’activité biologique, de très petits fluorophores sont utilisés dans ce travail: nitrobenzoxadiazole (NBD, vert) et 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl (DMACA, bleu). En outre, l’évaluation de l’activité antibactérienne à l’aide de la concentration minimale d’inhibition de dilution de microbroth (MIC) est décrite, de sorte que l’effet des modifications sur l’activité peut être mesuré. Ces sondes étiquetées fluorescentes peuvent être utilisées dans les essais spectrophotométriques, la cytométrie du débit et la microscopie. La gamme d’applications possibles est l’endroit où se trouve l’avantage des antibiotiques fluorescents. L’accumulation cellulaire peut être quantifiée, catégorisée et visualisée, ce qui n’est pas possible en utilisant la SP seule. On espère que les connaissances acquises grâce à l’utilisation d’antibiotiques fluorescents nous aideront à mieux comprendre la résistance et la lutte contre la RMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

Les antibiotiques fluorescents sont des outils de recherche polyvalents qui sont facilement utilisés pour l’étude de la résistance aux antimicrobiens, en raison de leur avantage significatif par rapport à d’autres méthodes. Pour préparer ces sondes, les dérivés de l’azide des antibiotiques sont synthétisés, puis couplés avec des alkyne-fluorophores utilisant le cycloaddition dipolar azide-alkyne par la chimie de clic. Après la purification, l’activité antibiotique de l’antibiotique fluorescent est testée par l’évaluation de la concentration inhibitrice minimale. Afin d’étudier l’accumulation bactérienne, la spectrophotométrie ou la cytométrie du débit peuvent être utilisées, permettant une analyse beaucoup plus simple que les méthodes reposant sur des dérivés antibiotiques radioactifs. En outre, la microscopie confocale peut être utilisée pour examiner la localisation au sein des bactéries, offrant des informations précieuses sur le mode d’action et les changements qui se produisent chez les espèces résistantes. L’utilisation de sondes antibiotiques fluorescentes dans l’étude de la résistance aux antimicrobiens est une méthode puissante avec beaucoup de potentiel d’expansion future.

Figure 1 Illustre la réaction de chimie de clic de clé (A) pour la préparation des antibiotiques fluorescents, et avec (B) des exemples de structures de nos antibiotiques fluorescents édités basés sur la ciprofloxacine (cipro), le trimethoprim (TMP), et le linezolid. Ces sondes ont toutes été synthétisées à partir des antibiotiques correspondants via un intermédiaire azide. Ils ont ensuite été couplés aux fluorophores NBD et DMACA, chacun fonctionnalisé avec un alkyne.
La figure 2 montre par exemple des traces de LCMS d’une réaction de clic ciprofloxacine-N3 et NBD-alkyne, où l’azide a eluté à 3,2 min et le produit à 3,8 min. La comparaison 1 et 2 montre comment la progression de la réaction au clic pourrait être suivie par la disparition du pic d’azide (par détecteur UV ou MS). Spectra 3 démontre l’impact de la purification, avec des pics erronés disparaissant des traces de SP et uv. La pureté et le progrès de réaction pourraient être quantifiés par l’intégration du pic du produit et de tout pic d’impureté.
La figure 3 démontre les résultats typiques de l’évaluation de l’accumulation intracellulaire par spectroscopie de fluorescence en présence et absence d’efflux. Dans cette expérience, E. coli a été traité avec TMP-NBD avec ou sans l’ajout de CCCP, qui s’effondre la force motrice de proton (PMF). La fluorescence intracellulaire des bactéries était significativement plus élevée lorsqu’elle était prétraitée avec CCCP, ce qui indique que l’efflux a réduit l’accumulation de ces bactéries. Cette expérience a été répétée à l’aide de bactéries déficientes en tolC, affichant la capacité de cet essais pour examiner l’impact des composants individuels de pompe d’efflux. Dans ce cas,bien qu’il y ait eu une augmentation de la fluorescence intracellulaire comparée aux bactéries sauvages de type, l’accumulation de CCCP a toujours augmenté. Ces résultats indiquent que tolC prend part à l’efflux TMP, mais n’est pas la seule pompe PMF-drive impliqués.
La figure 4 montre le résultat de la même expérience que la figure 2, mais avec l’accumulation mesurée par cytométrie de débit au lieu de la spectroscopie. Les mêmes tendances de données ont été observées, démontrant que l’une ou l’autre technique peut être employée pour étudier le phénomène de l’accumulation intracellulaire négociée d’efflux.
La figure 5 montre des images de microscopie confocale représentatives de sondes fluorescentes gram-positives (S. aureus) et gram-négatives (E. coli) étiquetées avec TMP-NBD (1) et cipro-NBD ( 2à 3) sondes fluorescentes, respectivement. Dans les deux cas, le colorant à membrane rouge FM4-64FX a été ajouté afin de comparer la co-localisation. Pour TMP-NBD, le colorant bleu acide nucléique Hoechst-33342 a également été utilisé. En superposant ces images, la localisation de l’antibiotique dans les bactéries a été visualisée. La comparaison des panneaux 2 et 3 montre comment l’impact de l’efflux a été examiné, avec l’inhibiteur de l’efflux CCCP utilisé dans 2, résultant en accumulation intracellulaire. Dans le panneau 3, aucun CCCP n’a été ajouté. Par conséquent, l’efflux est actif et aucune accumulation de sonde n’a été vue.
La figure 6 montre des images de microscopie confocale représentatives de bactéries Gram-positives (S. aureus) étiquetées avec la sonde l’oxazolidinone Lz-NBD étiquetée DMACA. Le colorant à membrane rouge FM4-64FX a été ajouté afin de comparer la co-localisation, et le colorant d’acide nucléique vert Hoechst-33342 a également été utilisé. En superposant ces images, la localisation de l’antibiotique dans les bactéries a été visualisée, montrant la localisation interne distincte de la membrane et de l’acide nucléique.
Le tableau 1 montre les valeurs du MIC pour trois séries d’antibiotiques fluorescents, la ciprofloxacine, le trimethoprim (TMP) et le linézolid (Lz), avec des données présentées pour les dérivés parent antibiotiques, NBD et DMACA de chacun. Des espèces représentatives pour chaque antibiotique ont été choisies, y compris gram-positive et gram-négative. Pour la série de ciprofloxacine, les deux sondes fluorescentes ont perdu l’activité antibiotique par rapport au médicament parent, mais ont conservé une certaine activité contre toutes les espèces. De même, les sondes linezolid ont perdu une certaine activité, mais sont restées un antibiotique modéré à faible. Les sondes TMP ont perdu presque toute activité contre les bactéries de type sauvage, mais étaient actives contre e. coli déficient e. coli, ce qui indique que la perte d’activité antibactérienne était due à un manque d’accumulation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> Figure 1 : Synthèse et structures de sondes dérivées d’antibiotiques. (A) Le schéma général de réaction pour la synthèse des sondes antibiotiques fluorescentes des azide-antibiotiques et des alkyne-fluorophores. (B) Les structures de nos sondes publiées basées sur la ciprofloxacine, le trimethoprim et le linezolid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> Figure 2 : Mesure de la pureté des sondes dérivées d’antibiotiques par LCMS. Les traces analytiques de LCMS de (1) incomplète, (2) complète, et (3) HPLC purifiéci ciprofloxacin-N3 - NBD-alkyne clic réactions démontrant la disparition du matériel de départ à l’achèvement de la réaction, et divers pics sur la purification. Une trace UV-Vis (absorption à 250 nm), trace B et MS (mode positif et négatif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> Figure 3 : Mesure de lecteur de plaque de l’accumulation de sonde dérivée d’antibiotiques. Mesure spectroscopique de fluorescence de l’accumulation cellulaire de TMP-NBD (50 M) en nature sauvage (1, ATCC 25922) ettolC (2, ATCC 25922) E. coli incubé (A) avec et (B) sans ajout de CCCP (100 M). L’importance statistique (p '0,01; 'p '0,001) est indiquée entre l’absence ou la présence de CCCP et entre le type sauvage et letype de tolCE. coli. Les données rapportées sont la moyenne de SD pour trois expériences. Ce chiffre est adapté de notre publication précédente15, et illustre l’utilisation de la spectroscopie pour élucider le rôle de l’efflux sur l’accumulation intracellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> Figure 4 : Mesure de cytométrie de flux de l’accumulation de sonde dérivée d’antibiotiques. Mesure de cytométrie de flux de l’accumulation cellulaire utilisant TMP-NBD dans le type sauvage (1, ATCC 25922) et letolC (2, ATCC 25922) E. coli incubé avec et sans ajout de CCCP (100 M). L’activité médiane de fluorescence est montrée à partir de 10 000 événements bactériens, l’importance statistique (md, p 0,001; - p , p - 0,0001) est indiquée entre l’absence et la présence de CCCP et entre le type sauvage et le type detolCE. coli. Les données rapportées sont la moyenne de SD pour trois expériences. Ce chiffre est adapté de notre publication précédente15, et illustre l’utilisation de la cytométrie de flux pour élucider le rôle de l’efflux sur l’accumulation intracellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> Figure 5 : visualisation par microscopie confocale de la localisation de la sonde NBD. Images de microscopie confocales de 1) S. aureus en direct étiqueté avec Hoechst-33342 (bleu, acide nucléique), TMP-NBD (vert), FM4-64FX (rouge, membrane), et superposé; 2) E. coli vivant traité avec CCCP (inhibiteur d’efflux) étiqueté avec cipro-NBD (vert), FM4-64FX (rouge, membrane), et superposé; 3) E. coli vivant étiqueté avec cipro-NBD (vert), FM4-64FX (rouge, membrane), et superposé. Ce chiffre est adapté de nos publications précédentes15,16, et illustre l’utilisation de la microscopie pour examiner la localisation des sondes, y compris l’impact de l’efflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> Figure 6 : visualisation par microscopie confocale de la localisation de la sonde DMACA. Images de microscopie confocales de S. aureus en direct étiquetéavec la sonde d’oxazolidinone Lz-DMACA (bleu), Sytox vert (vert, acide nucléique), et FM4-64FX (rouge, membrane). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">MIC (g/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Espèces</td>
			<td>Souche</td>
			<td>Cipro</td>
			<td>Cipro-NBD (en)</td>
			<td>Cipro-DMACA</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD (en)</td>
			<td>TMP-DMACA (en)</td>
			<td>Linezolid (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 à 64 ans</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>À l’autoricien</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>À l’autoricien</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Streptococcus pneumoniae</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Enterococcus faecium</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 à 64 ans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 à 64 ans</td>
			<td>32 à 64 ans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Escherichia coli</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>0,004 euros</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>À l’autoricien</td>
			<td>À l’autoricien</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>Mutant 'tolC'</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Activités antibiotiques des sondes antibiotiques fluorescentes basées sur la ciprofloxacine, le trimethoprim, et le linezolid contre les souches bactériennes médicalement pertinentes appropriées, telles que mesurées par des essais mic de microdilution de bouillon. Dans la plupart des cas, les sondes ont perdu une certaine activité par rapport au médicament parent, mais ont conservé une certaine puissance antibiotique mesurable (suffisante pour être utile dans d’autres études).

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Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

La préparation d’antibiotiques fluorescents permet d’évaluer la localisation de ces reagents thérapeutiques chez les bactéries au moyen de techniques d’analyse pratiques telles que la spectrophotométrie et la microscopie. Le principal avantage de cette technique est la facilité avec laquelle la localisation antibiotique peut être déterminée. Cette localisation est pertinente pour un certain nombre de phénomènes dont l’efflux.Pour effectuer la procédure de réaction de clic A, placez l’antibiotique d’azide d’intérêt dans un flacon inférieur rond et ajoutez 25 millilitres de tert-butanol et 25 millilitres d’eau par millimole d’azide au flacon. Ajouter le fluorophore alkyne préparé à la solution et chauffer la réaction à 50 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 0,6 équivalent de sulfate de cuivre et 2,4 équivalents d’acide ascorbique au flacon.Remuer la réaction pendant une heure ou jusqu’à ce que l’analyse par LCMS indique l’achèvement de la réaction. Puis refroidir et purifier la réaction au besoin pour l’échafaudage antibiotique. Ici, la réaction clé de chimie de clic pour la préparation des antibiotiques fluorescents avec des exemples de la structure synthétisée des antibiotiques correspondants par l’intermédiaire d’un intermédiaire d’azide basé sur la ciprofloxacine, le linezolid, et le trimethoprim sont montrés.Dans ces traces de spectrométrie de masse de chromatographie liquide d’un azide de ciprofloxacine et d’une réaction de clic d’alkyne de NBD, l’azide a été éludé à 3.2 minutes et le produit a été éludé à 3.8 minutes. La progression de la réaction de clic peut être suivie par la disparition du pic d’azide. Dans ces spectres, l’impact de la purification peut être visualisé avec des pics erronés disparaissant.Pour évaluer l’activité antimicrobienne de l’antibiotique synthétisé, stries stocks de glycérol de souches bactériennes appropriées pour l’échafaudage antibiotique sur les plaques d’agar LB et de cultiver les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, choisissez une seule colonie de chaque assiette et de la culture des colonies pendant la nuit en cinq millilitres de CAMHB par culture à 37 degrés Celsius. Le lendemain, diluer les cultures environ 40 fois en CAMHB frais et faire croître les bactéries à mi-phase de notation avec une densité optique à 600 nanomètres entre 0,4 et 0,8.Ensuite, préparez des solutions de stock de chaque antibiotique fluorescent à 1,28 milligramme par millilitre dans du sulfoxyde de diméthyle à 20 % dans l’eau stérile et ajoutez 10 microlitres d’antibiotiques à chaque puits de la première colonne d’une plaque de 96 puits. Ajouter 90 microlitres de CAMHB à chaque puits de la première colonne et 50 microlitres à tous les autres puits. Ensuite, effectuez une dilution en série double à travers la plaque.Après avoir bien mélangé, diluer les cultures de phase de rondins intermédiaires à environ une fois 10 à la sixième colonie formant des unités par millilitre et ajouter 50 microlitres de chaque culture aux puits de dilution pour obtenir une concentration finale d’environ cinq fois 10 à la cinquième colonie formant des unités par millilitre. Lorsque toutes les bactéries ont été plaquées, placez les couvercles sur les plaques et incubez les cultures pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius sans trembler. Le lendemain, inspectez visuellement les plaques.La concentration minimale d’inhibition sera le puits de concentration le plus bas sans croissance visible. Pour l’analyse de l’accumulation de sondes, stries de stocks de glycérol des souches bactériennes sur les plaques d’agar LB pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, choisissez une seule colonie de la plaque pour la culture de nuit dans le bouillon de lysogeny à 37 degrés Celsius.Le lendemain matin, diluer la culture de nuit environ 50 fois dans le milieu frais. Lorsque la culture atteint la phase médiane du rondin, pelleter les bactéries par centrifugation et décanter le milieu. Resuspendez les bactéries dans un millilitre de PBS et centrifugez à nouveau les bactéries.Décanter le supernatant et resuspendre la pastille lavée dans PBS à une densité optique à 600 nanomètres de deux. Ajouter 10,1 microlitres de 10 milli molaires CCCP en PBS à un millilitre de bactéries et incuber les bactéries à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, recueillir les bactéries par centrifugation et resuspendre la pastille en un millilitre de 10 à 100 micromolaire solution antibiotique fluorescente dans PBS.Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, lavez les cellules par centrifugation quatre fois en un millilitre de PBS froid par lavage. Après le lavage, lyse les bactéries avec 180 microlitres de tampon de lyse et 70 microlitres de lysozyme. Après 30 minutes à 37 degrés Celsius, congelez-décongelez les bactéries trois fois à moins 78 degrés Celsius pendant cinq minutes et 34 degrés Celsius pendant 15 minutes respectivement.Après la dernière période de gel-dégel, sonifier l’échantillon pendant 20 minutes, suivi d’une incubation de 30 minutes à 65 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, recueillir l’échantillon lysé par centrifugation et filtrer le contenu du tube à travers une membrane filtrante de 10 kilodaltons. Lavez le filtre quatre fois avec 100 microlitres d’eau par lavage et aliquot chacun se laver dans les puits individuels d’une plaque noire à fond plat de 96 puits.Mesurez ensuite l’intensité de fluorescence sur un lecteur de plaque avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées au fluorophore. Ces résultats typiques de l’évaluation de l’accumulation intracellulaire par spectroscopie de fluorescence en présence et en l’absence d’efflux montrent que la fluorescence intracellulaire des bactéries est significativement plus élevée après le pré-traitement avec cccp indiquant que l’efflux réduit l’accumulation dans les bactéries. Dans ces images confocales représentatives de microscopie des bactéries gram positives et gram négatives, la localisation de l’antibiotique dans les bactéries peut être visualisée après traitement de CCCP.Ce phénomène n’est pas observé lorsqu’aucun CCCP n’est ajouté. Lorsque vous utilisez des antibiotiques fluorescents, soyez conscient des informations que vous visez à recueillir et assurez-vous de considérer quel protocole sera le plus utile lors de l’obtention de ces données. Après leur synthèse, les antibiotiques fluorescents peuvent être utilisés pour étudier un certain nombre de processus bactériens, y compris les interactions médicamenteuses cibles et les modifications de résistance.

Research

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