Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

MRLS נתמך על ידי פרס לתואר שני באוסטרליה (APA) ומכון לקידום מחקר ביולוגי מולקולרי המחקר. Wanida פטסאנג נתמך על ידי מלגה בינלאומית UQ (UQ) ו-IMB מתואר שני בפרס (אימפי). MAC הוא בחור מחקר העיקרון nhmrc (APP1059354) וגם מחזיקה בפגישה מנהל המחקר החלקי באוניברסיטת קווינסלנד, עם הזמן הנותר שלו כמנכ ל inflazome בע מ, חברה לפתח תרופות כדי לטפל בצרכים קליניים קליניות במחלות דלקתיות. MATB נתמך בחלקו על ידי ברוך הבא אמון מענק אסטרטגי WT1104797/Z/14/Z ו-NHMRC מענק פיתוח APP1113719. מיקרוסקופיה בוצעה בבית החולים האוסטרלי לחקר הסרטן (ACRF)/המכון למדעי הביולוגיה של סרטן Bioscience ביולוגיה מולקולרית, אשר הוקמה בתמיכת ACRF.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

. למחברים אין מה להצהיר

יצירת בדיקה אנטיביוטית מוצלחת פלורסנט חייב להתחיל בתכנון קפדני והתחשבות של SAR של הסם ההורה. אם ה-SAR אינו ידוע או נבדק במלואו, ייתכן שיהיה צורך לבדוק מספר אפשרויות כדי למצוא אתר שניתן לשנותם באופן סלקטיבי מבלי לבטל פעילות ביולוגית. לאחר זיהוי אתר/s, ההתקנה של מקשר moiety היא חיונית לעתים קרובות כדי לספק מרווח אפקט סטרי בין האתר הביולוגי של פעולה ואת fluorophore הבלתי פעיל. הטיפול חייב להילקח כי התגובה המשמשת כדי לצרף את המקשר אל האנטיביוטיקה משאיר הקבוצה הביו יציבה תפקודית, הימנעות, למשל, אסטרים כי הם פגיעים המחשוף על ידי מוחק ב vivo. בהתאם לפרופיל פרמקודינמיקה ו פרמקוקינטיים של אנטיביוטיקה, מקשר פשוט האלאני עשוי לשמש, או אחרת אפשרות ליפוזיס פחות כגון פוליאתילן גליקול (יתד) הקשר צריך להיחשב. עם המקשר מחובר, הפעילות אנטיבקטריאלי צריך להיות מוערך כדי להבטיח את מיקרופונים נגד חיידקים רלוונטיים דומים מתחם האב.
בעבודה זו, אנו ממליצים על השימוש בהואיסן עזידה-אלאלקין [3 + 2] בתוספת הציקלופטית (לחץ על הכימיה, ראה איור 1) כדי להאריך פלואורופסיפור לאנטיביוטיקה, ממספר סיבות. תגובות לחץ הם סלקטיבי מאוד, כלומר הגנה על קבוצות תגובתי על אנטיביוטיקה אינה נחוצה, ועוד, התגובה משאירה יציבה, סתיימים moiety. מרכיב אזיד הוא הציג את החלק האנטיביוטי בהליכים שלנו, כמו זה בדרך כלל יותר מושגת בקלות עם מגוון רחב של סוגים מבניים מאשר הקדמה של האלקין. התחביר של שני fluorophores ללעג מתוארים כאן, למרות שאחרים יכלו לחקור במידת הצורך. NBD ו-DMACA נבחרו בשל גודלם הקטן, למזער את האפשרות של הפרעה חדירה לתא ואינטראקציה היעד. התגובה לחיצה עצמה מבוצעת באמצעות מזרז נחושת, שם או Cu2 + (cuso4, עם חומצה אסקורבית הפחתת הסוכן) או Cu+ (cuso) ניתן להשתמש כמו מגיב ההתחלתי. לאחר הטיהור (איור 2), יש לבדוק את סנדלי החבלנים בדומה לעזידה. אפילו עם התחשבות זהירה של בחירה fluorophore ואתר של הקובץ המצורף, ייתכן כי פעילות אנטיביוטית עניים נצפתה. זה לא, עם זאת, אומר כי בדיקה לא פעילה היא ללא שימוש. כפי שמוצג עם הבדיקות TMP, תרכובות עם פעילות אנטיבקטריאליות נמוכה עשויים עדיין לאגד את אותו יעד כמו סם האב. הדבר יכול לאפשר מחקרים על מצב הפעולה ובחינת התופעות המובילות להתנגדות, כגון אפלוקס.
כפי שמתואר בסעיף פרוטוקולים, ניתן לנתח את התיוג החיידקי על ידי אנטיביוטיקה פלורסנט באמצעות שיטת ספקטרופוטומטר פשוטה (איור 3) או לזרום cy Try (איור 4). שתי השיטות מסוגלות לכמת את הצטברות הסלולר, ועל ידי לשסינג תאים ובדיקת לוקליזציה פלואורסצנטית בליפוסט, ניתן להעריך הצטברות תאיים. בפרוטוקול זה, השימוש ב-ליזוזים לפירוק תאים מתואר, מכיוון שזו טכניקה אוניברסלית מהירה. תנאי פירוק אחרים, כגון טיפול לילה עם גליצין-HCl7, השתמשו גם הם בהצלחה. באמצעות טכניקה זו, ניתן ללמוד את ההשפעה של אפלוקס על הצטברות הסלולר אנטיביוטי, שהוא מנגנון מרכזי של התנגדות. אם אפלוקס אכן נוכח בחיידק, חוסר הצטברות תאיים יהיה נצפתה, אם כי זה יכול להינצל באמצעות מעכבי מדכא כמו CCCP.
מיקרוסקופיה עשויה להתבצע גם כדי לבדוק באופן חזותי לוקליזציה של בדיקה בחיידקים שונים, מידע המבצע על מצב של פעולה, וגם התנגדות (ראה איור 5 לדוגמאות מייצגות). כדי לראות לוקליזציה בתוך חיידקים, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה נדרש, מצויד ביכולות כגון SIM (מיקרוסקופ תאורה מובנים), SR-sim (superresolution-sim), airyscan, או ההיסטד (מחסור פליטה מגורה). יתרה מזאת, יש להשתמש בתגיות כיסוי בעלי ביצועים גבוהים, וניתוח לאחר הדמיה שבוצע על-גבי תוכנה מתאימה (למשל, פיג'י, זן או מאריס). לוקליזציה של הגששים מושווה צבעים הכתמים ארכיטקטורות ספציפיות, כגון Hoechst-33342 (כחול, חומצת גרעין), Syto-9 (ירוק, חומצת גרעין), ו-FM4-64FX (אדום, קרום). הבחירה של צבעים צריך להיות מתאים לאנטיביוטיקה פלורסנט, כך שכל צבע בשימוש יש חפיפה ספקטרלית מינימלית. על מנת להשיג את התמונות הטובות ביותר, ייתכן שיהיה צורך במיטוב. לדוגמה, אם החיידק צפוף מדי בשקופית, קח רק חלק מהגלולה המושהה, ולאחר מכן דלל במדיום גובר. לעומת זאת, אם החיידקים הם דלילים מדי בשקופית, פשוט להתחיל עם חיידקים יותר. בפרוטוקול זה, השימוש בג הפיך התואם לתאים חיים (למשל, Cygel) מומלץ לדימות תאים חיים, כפי שהוא משתק חיידקים (כולל בקטריה מורצפת), אך גם מדיה הרכבה או agarose אחרים השתמשו בהצלחה.
בסך הכל, למרות האתגרים שעשויים להיות בפני הכנת נגזרות אנטיביוטי פעיל ביולוגית של פלורסנט, הפשטות של השימוש שלהם צדדיות לעשות אלה בדיקה אטרקטיבי כלים למחקר עמרו. עבודה עתידית באמצעות אנטיביוטיקה פלורסנט יש את הפוטנציאל לספק תובנה לתוך מנגנונים של עמידות לאנטיביוטיקה, לשפר את ההבנה שלנו איך אנטיביוטיקה הנוכחית לפעול, ולסייע לפיתוח של סמים טובים יותר.

עמידות מיקרוביאלית (עמרו) הוא משבר עולה אשר מהווה איום משמעותי על בריאות האדם ברחבי העולם. עמידות ביותר לאנטיביוטיקה דווחה, זיהומים הנגרמים על ידי חיידקים עמידים לכל התרופות הזמינות קלינית מתגלים. על מנת להילחם בעלייתו של עמרו, עלינו להגביר את הבנתנו את התופעה הרבת-הפנים הזאת ואת המנגנונים הבסיסיים והאינטראקציות בין אנטיביוטיקה לבין חיידקים. היבט אחד שהיה מבחינה היסטורית היטב הבינו הוא החדירות של אנטיביוטיקה לתוך חיידקים, יחד עם התופעות של הצטברות ו למחוק. ידע זה הוא חיוני בעיצוב תרופות חדשות והבנה מנגנונים של התנגדות. מכאן, זה משחק תפקיד קריטי במחקר עמרו.
ישנן שתי גישות עיקריות שניתן לנקוט כדי למדוד ריכוז אנטיביוטי: מדידת התרופה ישירות או תיוג עם moiety שנועד להקל על הקוונפיקציה. למרות תיוג משפר אנטיביוטיקה לגילוי, זה יכול לperturb את הפעילות הביולוגית של התרופה, כגון פעילות מיקרוביאלית וחדירות. זו אינה בעיה עבור שיטות לא מתויגות; עם זאת, זיהוי יכול להיות מאתגר. בשנים האחרונות, התפתחויות טכנולוגיות הובילו בום במחקר ניצול ספקטרומטר המוני (MS) כדי למדוד ישירות את הריכוז לאנטיביוטיקה בקטריה1,2,3,4,5,6,7. מחקרים אלה הראו כי ניתן לחקור הצטברות תאיים במגוון של חיידקים, עם חיידקים גראם שליליים הנרחב ביותר לחקור. הקוונפיקציה של חדירות מולקולה היה אז קשור לפעילות ומשמש כדי ליידעאת פיתוחהתרופה 2,3,4, אם כי יש לנקוט זהירות כאשר הצטברות ישירה של פעילות היעד5. לפני MS פיתוח, האנטיביוטיקה היחידה אשר הריכוז ניתן למדוד ישירות היו אלה השתלט על הקרינה הפנימית, כגון טטרציקלין ו quinolones8,9,10,11. למרות שברור שהטווח מוגבל בהיקף, הצטברות ואפלוקס נבדקו וכמותית, הממחישות את התועלת של כימות מבוססות-פלואורסצנטית.
שתייגת אנטיביוטיקה שימשו עשורים רבים כדי ללמוד הפצות, מצבי פעולה, והתנגדות, עם תגיות רדיואקטיביות ו פלורסנט להיות נפוץ. רדיו מתויג בבדיקות יש את היתרון של להיות זהה כמעט למתחם האב, ומכאן הפעילות הביולוגית סביר להיות שונה באופן משמעותי. איזוטופים כגון 3H, 14ג, ו 15N כבר בשימוש לעתים קרובות בשל הגדולה של רכיבים אלה באנטיביוטיקה, ומגוון של הפיגומים של אנטיביוטיקה נבדקו1,10,12,13. בעוד הזיהוי של גלי רדיו הוא פשוט, יש מספר דאגות לוגיסטיות (למשל, בטיחות, מחצית חיים של איזוטופ) אשר הגבילה את השימוש בגישה זו. אסטרטגיה נוספת היא באמצעות פלואורוסקופים-אנטיביוטיקה מתויג. ניתן להשתמש בבדיקות אלה כדי לבחון את התפלגות ומצבי הפעולה וההתנגדות של התרופה הראשית, באמצעות טכנולוגיה פשוטה יותר מאשר MS וללא הבעיות הלוגיסטיות של קרינה8. החיסרון העיקרי של גישה זו היא כי אנטיביוטיקה הם בדרך כלל מולקולות קטנות יחסית, ומכאן המבוא של פלורסנט moiety מהווה שינוי כימי משמעותי. שינוי זה יכול להשפיע על תכונות פיזיוכימיות ופעילות אנטיבקטריאלי. לכן, הטיפול יש לנקוט כדי להעריך את הגורמים הללו כדי ליצור את נציג התוצאות של אנטיביוטיקה ההורה.
בעבודה זו, שיטה מתוארת כדי לסנתז, להעריך ולהשתמש באנטיביוטיקה פלורסנט, כמו בפרסומים הקודמים שלנו14,15,16. במהלך העבודה הקודמת, מספר אנטיביוטיקה פלורסנט הוכנו ושימשו למגוון מטרות (ראה אבן ואח '8). כדי למזער את הסבירות להשפיע על פעילות ביולוגית, fluorophores קטנים מאוד משמשים בעבודה זו: nitrobenzoxadiazole (NBD, ירוק) ו-7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-כרומאן-4-YL (DMACA, כחול). יתר על כן, הערכה של פעילות אנטיבקטריאלי באמצעות מיקרומרק דילול הריכוז המינימלי העיכוב (MIC) היכולת מתוארת, כך ההשפעה של שינויים על פעילות ניתן למדוד. אלה בדיקה-מתויג fluorescently ניתן להשתמש ב spectrophotometric assays זרימה cy try, מיקרוסקופ. טווח של יישומים אפשריים הוא היתרון של אנטיביוטיקה פלורסנט שקרים. הצטברות תאית ניתן לכמת, מסווג, ו דמיינו, משהו לא אפשרי באמצעות MS לבד. הוא קיווה כי הידע הנרכש באמצעות אנטיביוטיקה פלורסנט יסייע ההבנה שלנו של התנגדות, ואת המאבק נגד עמרו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

אנטיביוטיקה פלורסנט הם כלי מחקר רב תכליתי המשמשים בקלות למחקר של התנגדות מיקרוביאלית, בשל היתרון המשמעותי שלהם על שיטות אחרות. כדי להכין את הבדיקות הללו, אזידה נגזרות של אנטיביוטיקה הם מסונתז, ולאחר מכן בשילוב עם האלקידים-fluorophores באמצעות אזיד-אלאלקין dippepa בתוספת לחיצה על כימיה. בעקבות טיהור, פעילות אנטיביוטית של אנטיביוטיקה פלורסנט נבדק על ידי הערכה מינימלית מעכבות ריכוז. על מנת ללמוד הצטברות חיידקי, או ספקטרופוטומטר או זרימה cy try עשוי לשמש, המאפשר ניתוח פשוט הרבה יותר מאשר שיטות הסתמכות על נגזרות אנטיביוטיקה רדיואקטיבית. יתרה מזאת, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה הקונפוקלית כדי לבחון את הלוקליזציה בתוך החיידק, מידע חשוב אודות מצב הפעולה והשינויים המתרחשים במינים עמידים. השימוש בבדיקות אנטיביוטי פלורסנט במחקר של התנגדות מיקרוביאלית היא שיטה רבת עוצמה עם פוטנציאל רב להרחבת העתיד.

איור 1 מדגים את המפתח ללחץ כימיהמפתח (א) להכנת אנטיביוטיקה פלורסנט, עם (ב) דוגמאות של מבנים של אנטיביוטיקה שפורסמה שלנו הניאון מבוסס על ציפרופלוקסאצין (קפריסין), מתיונין (TMP), ו-linezolid. אלה בדיקה היו כולם מסונתז אנטיביוטיקה המקביל באמצעות ביניים אזיד. הם היו מצמידים לאחר מכן ל-NBD ו-DMACA fluorophores, כל אחד מהם תפקד עם האלקין.
איור 2 מראה כעקבות lcms של ציפרופלוקסאצין-N3 ו-הפקודה לחיצה על התגובה, שם אזיד להתחמק ב 3.2 דקות ואת המוצר ב 3.8 דקות. השוואת 1 ו- 2 מראה כיצד ההתקדמות של תגובת לחיצה יכול להיות אחריו היעלמות השיא אזיד (על ידי UV או MS גלאי). ספקטרה 3 להפגין את ההשפעה של טיהור, עם פסגות שגויות נעלמים העקבות MS ו UV. התקדמות הטוהר והתגובה יכולה להיות כמותית על-ידי שילוב פסגת המוצר וכל פסגות הטומאה.
איור 3 מדגים תוצאות אופייניות מן ההערכה של הצטברות תאיים על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית בנוכחות והעדר של אפלוקס. בניסוי זה טופלו E. coli עם TMP-nbd עם או בלי התוספת של cccp, אשר מצמצמת את כוח המניע של פרוטון (pmf). הזריחה התאיים של החיידק היה גבוה יותר באופן משמעותי כאשר מטופלים עם CCCP ס, והצביע על כך שאפלוקס הפחיתה את ההצטברות בחיידקים אלה. ניסוי זה חזר על ידי שימוש בחיידקים לקויה Tolc, הצגת היכולת של הספק הזה כדי לבחון את ההשפעה של רכיבים בודדים משאבת משאבה. במקרה זה, למרות שהיתה עלייה בזריחה תאיים בהשוואה לחיידקים סוג פראי, הצטברות CCCP עדיין גדל. ממצאים אלה מצביעים על כך Tolc לוקח חלק intmp אבל הוא לא משאבת pmf כונן הבלעדית מעורב.
איור 4 מראה את התוצאה של אותו ניסוי כמו איור 2, אבל עם ההצטברות שנמדד על ידי הזרימה cy, במקום ספקטרוסקופיה. אותם מגמות הנתונים נצפו, הוכחת כי גם הטכניקה ניתן להשתמש כדי ללמוד את התופעה של הצטברות מתווכת תאיים.
איור 5 מראה מיקרוסקופיה הנציגה בתמונות של גראם חיוביות (S.האורמיות) וחיידקים גראם שליליים (E. COLI) עם התווית TMP-nbd (1) ו קפריסין-nbd (2 +3) פלורסנט בהתאמה. בשני המקרים, צבע הקרום האדום FM4-64FX התווסף כדי להשוות שיתוף לוקליזציה. עבור ה-TMP-NBD, הצבע הכחול של חומצות גרעין Hoechst-33342 שימשו גם. על ידי הנחת התמונות הללו, הלוקליזציה של אנטיביוטיקה בחיידק היה דמיינו. השוואת לוחות 2 ו- 3 מראה כיצד ההשפעה של אפלוקס נבדק, עם המעכב מעכב cccp ס השתמשו ב 2, וכתוצאה מכך הצטברות תאיים. בלוח 3, לא נוספה שום cccp. מכאן, אפלוקס פעיל ולא נראה הצטברות בדיקה.
איור 6 מציג תמונות מיקרוסקופיה של הנציגה האנטי-מיקרוסקופית של גראם פוזיטיב (S. האורדיאוס) בקטריה עם תווית dmaca בעלת תווית של הגשושית לבדיקה. לצבוע את הקרום האדום FM4-64FX נוספה כדי להשוות לוקליזציה שיתוף, ואת הצבע הירוק חומצה גרעין הואכסט-33342 גם נעשה שימוש. על-ידי הנחת התמונות הללו, הלוקליזציה של אנטיביוטיקה בחיידק היה דמיינו, מראה לוקליזציה פנימית נבדל של קרום גרעין חומצה.
טבלה 1 מציגה ערכי MIC עבור שלוש סדרות של אנטיביוטיקה פלורסנט, ציפרופלוקסאצין, ילדים (TMP), ו-לינזוכסה (נקודת נחיתה), עם נתונים המוצגים עבור אנטיביוטיקה אב, nbd ו dmaca נגזרים של כל אחד. מינים מייצגים עבור כל אנטיביוטיקה נבחרו, כולל גראם חיובי ו גראם שליליים. עבור סדרת ציפרופלוקסאצין, שני בדיקה פלורסנט איבד פעילות אנטיביוטי לעומת התרופה ההורה, אבל שמרו על פעילות כנגד כל המינים. באופן דומה, הבדיקות הללו המשיכו לאיבוד בפעילות, אך נשארה בינונית עד לאנטיביוטיקה חלשה. ה-TMP בדיקה איבד כמעט את כל הפעילות נגד חיידקים סוג פראי, אבל היו פעילים נגד לקויה E. coli, המציין כי אובדן של פעילות אנטיבקטריאלי היה עקב חוסר הצטברות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> איור 1: סינתזה ומבנים של בדיקה הנגזרות מאנטיביוטיקה. (א) מערכת התגובה הכללית לסינתזה של בדיקה אנטיביוטית של הפלורסנט מ-azide-אנטיביוטיקה ו-אלקין-fluorophores. (ב) מבנים של הגששים שפורסמו שלנו מבוסס על ציפרופלוקסאצין, מתיונין, ו לינזוכסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> איור 2: מדידה של טוהר בדיקה לאנטיביוטיקה נגזר על ידי LCMS. שאריות LCMS אנליטיים (1) לא מושלמים, (2) השלם, ו (3) מטוהרים מטוהר ציפרופלוקסאצין-N3 + nbd-אלאלקין לחץ תגובות להפגין את היעלמות החומר ההתחלתי על השלמת התגובה, ופסגות שונות על טיהור. A = UV-Vis מעקב (ספיגת ב 250 ננומטר), B = MS מעקב (מצב חיובי ושלילי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> איור 3: קורא לוחית מדידה של הצטברות בדיקה לאנטיביוטיקה נגזרת. מדידה ספקטרוסקופית פלואורסצנטית של הצטברות תאית של TMP-NBD (50 μM) בסוג פראי (1, ATCC 25922) ו Δ Tolc (2, ATCC 25922) E. coli מודולוציה (A) עם ו (ב) ללא תוספת של cccp (100 μm). משמעות סטטיסטית (* * p ≤ 0.01; * * * p ≤ 0.001) מוצג בין העדר או נוכחות של המק ובין סוג פראי ו-ΔTolcE. coli. נתונים שדווחו הם ממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים. איור זה מותאם מהפרסום הקודם שלנו15, וממחיש את השימוש בספקטרוסקופיה כדי להבהיר את התפקיד של הצטברות בהצטברות תאיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> איור 4: מדידת זרימה cy, לנסות של הצטברות בדיקה לאנטיביוטיקה נגזרת. מדידת זרימה cy, מדידה של הצטברות תאית באמצעות TMP-NBD בסוג פראי (1, ATCC 25922) ו ΔTolc (2, atcc 25922) E. coli מודבטים עם ובלי תוספת של Cccp (100 μm). פעילות פלואורסצנטית חציון מוצג מ 10,000 אירועים חיידקיים, משמעות סטטיסטית (* * *, p ≤ 0.001; * * * *, p ≤ 0.0001) מוצג בין העדר נוכחות של המק ובין סוג פראי ו-ΔTolcE. coli. נתונים שדווחו הם ממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים. איור זה מותאם מהפרסום הקודם שלנו15, וממחיש את השימוש של cy, לנסות להבהיר את התפקיד של אפלוקס על הצטברות תאיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> איור 5: הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית של הלוקליזציה של בדיקה באמצעות NBD. תמונות מיקרוסקופית הקונסקופיה של 1) חיים S האורלנו עם תווית עם Hoechst-33342 (כחול, חומצת גרעין), TMP-nbd (ירוק), FM4-64fx (אדום, קרום), ו מצופה; 2) חיים E. coli מטופלים עם cccp (מעכבי אפלוקס) עם קפריסין-nbd (ירוק), FM4-64fx (אדום, קרום), ומצופה; 3) חיים E. coli מתויג עם קפריסין-nbd (ירוק), FM4-64fx (אדום, קרום), ו מצופה. איור זה מותאם מפרסומיו הקודמים15,16, וממחיש את השימוש במיקרוסקופיה לבדיקת לוקליזציה של בדיקה, כולל ההשפעה של אפלוקס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> איור 6: הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית של DMACA-בדיקה לוקליזציה. תמונות מיקרוסקופית הקונקמיות של האורמות החיים בעלי תווית של כחול (בכחול), בדיקת רעלים ירוקה (ירוק, חומצת גרעין), ו-FM4-64fx (אדום, ממברנה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">מיקרופון (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ינים</td>
			<td>זן</td>
			<td>קפריסין</td>
			<td>קפריסין-NBSP</td>
			<td>קפריסין-מאקה</td>
			<td>TMP</td>
			<td>טמפ ה, NBSP</td>
			<td>טמפ הדמקא</td>
			<td>לינזוכסה (אזור נחיתה)</td>
			<td>נקודת נחיתה-NBD</td>
			<td>נקודת נחיתה-מאקה</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">אורהילוקוקוס</td>
			<td>25923 למעלה</td>
			<td>0.125-0.5</td>
			<td>32-≥ 64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>> 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>43300 למעלה</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>> 64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">סטרפטוקוקוס</td>
			<td>700677 למעלה</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">בידור פמחית</td>
			<td>35667 למעלה</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32-≥ 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>51559 למעלה</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">קלבסילה</td>
			<td>13883 למעלה</td>
			<td>0.015-0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פסאודומונס</td>
			<td>27853 למעלה</td>
			<td>0.25-1</td>
			<td>32-≥ 64</td>
			<td>32-≥ 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">האנתיכיה קולי</td>
			<td>25922 למעלה</td>
			<td>≤ 0.004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>> 64</td>
			<td>> 64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>מוטציה ΔtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>. שולחן 1 פעילות אנטיביוטית של בדיקה אנטיביוטית בהתבסס על ציפרופלוקסאצין, trimethoprim, ושינזוכסה נגד זנים בקטריאליים המתאימים קלינית, כפי שנמדד על ידי מיקרודילול מיקרו מיקרופון assays. ברוב המקרים, הבדיקות איבדו פעילות בהשוואה לסמים ההורה, אבל שמרו על מספר מדידה של אנטיביוטיקה (מספיק כדי להיות שימושי במחקרים נוספים).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

הכנת אנטיביוטיקה פלואורסצנטית מאפשרת הערכה של לוקליזציה של בריאגנטים טיפוליים אלה בתוך חיידקים באמצעות טכניקות אנליטיות נוחות כגון ספקטרופוטומיה ומיקרוסקופיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הקלות שבה ניתן לקבוע לוקליזציה אנטיביוטית. לוקליזציה זו רלוונטית למספר תופעות כולל efflux.כדי לבצע את הליך התגובה לחץ על, מניחים את האנטיביוטיקה azide של עניין בבקבוקון תחתון עגול ולהוסיף 25 מיליליטר של tert-butanol ו 25 מיליליטר של מים למילימול של אזיד לבקבוק. מוסיפים את הפלואורופור אלקין המוכן לפתרון ומחממים את התגובה ל -50 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 0.6 שווה ערך של נחושת סולפט ו 2.4 שווה ערך של חומצה אסקורבית לבקבוק.מערבבים את התגובה במשך שעה אחת או עד ניתוח על ידי LCMS מציין השלמת תגובה. לאחר מכן מצננים ומטהרים את התגובה בהתאם לפיגום האנטיביוטי. כאן, התגובה מפתח מפתח לחץ כימיה להכנת אנטיביוטיקה פלואורסצנטית עם דוגמאות של המבנה מסונתז מן האנטיביוטיקה המתאימה באמצעות ביניים אזיד מבוסס על ציפרופלוקסאצין, linezolid, ו trimethoprim מוצגים.אלה ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית עקבות של אזיד ציפרופלוקסאצין ותגובת קליק NBD אלקין, azide היה eluted ב 3.2 דקות המוצר היה eluted ב 3.8 דקות. התקדמות תגובת הקליק יכולה להיות מלווה בהיעלמותה של פסגת האזיד. בספקטרום זה, ניתן לדמיין את השפעת הטיהור כשפסגות שגויות נעלמות.כדי להעריך את הפעילות האנטי מיקרוביאלית של אנטיביוטיקה מסונתז, רצף גליצרול מניות של זנים חיידקיים המתאימים פיגום אנטיביוטי על צלחות אגר LB ולגדל את התרבויות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לבחור מושבה אחת מכל צלחת ותרבות המושבות לילה בחמישה מיליליטר של CAMHB לכל תרבות ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, לדלל את התרבויות כ 40-פי CAMHB טרי לגדל את החיידקים לשלב יומן באמצע עם צפיפות אופטית ב 600 ננומטר בין 0.4 ו 0.8.לאחר מכן, הכינו את פתרונות המלאי של כל אנטיביוטיקה פלואורסצנטית ב-1.28 מיליגרם למיליליטר ב-20% דימתיל סולפוקסיד במים סטריליים והוסיפו 10 מיקרוליטרים של אנטיביוטיקה לכל באר של העמודה הראשונה של צלחת של 96 בארות. הוסף 90 microliters של CAMHB לכל באר של העמודה הראשונה ו 50 microliters לכל בארות אחרות. לאחר מכן בצע דילול טורי כפול על פני הצלחת.לאחר ערבוב יסודי, מדללים את תרבות שלב הרישום ה הבינוני ל בערך פי 10 למושבה השישית ויוצרים יחידות למיליליטר ומוסיפים 50 מיקרוליטרים של כל תרבות ל בארות הדילול כדי להשיג ריכוז סופי של כחמש פעמים 10 למושבה החמישית להרכיב יחידות למיליליטר. כאשר כל החיידקים כבר מצופים, מניחים מכסים על הצלחות ו דגירה התרבויות במשך 18 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. למחרת, תבדקו את הצלחות.ריכוז העיכוב המינימלי יהיה הריכוז הנמוך ביותר היטב ללא צמיחה נראית לעין. לניתוח הצטברות בדיקה, מניות גליצרול פס של זנים חיידקיים על צלחות אגר LB עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, בחר מושבה אחת מהצלחת לתרבות הלילה במרק לייסוגניים ב-37 מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, לדלל את תרבות הלילה כ 50-פי במדיום טרי. כאשר התרבות מגיעה לשלב יומן אמצע, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ו decant המדיום. תן שוב את החיידקים במיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה של החיידקים שוב.Decant supernatant ו resuspend גלולה שטף PBS לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר של שניים. הוסף 10.1 microliters של 10 מילימולר CCCP ב PBS למיליליטר אחד של חיידקים דגירה החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה resuspend את גלולה במיליליטר אחד של 10 כדי 100 פתרון אנטיביוטיקה פלואורסצנטי מיקרומולרי PBS.לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ארבע פעמים במיליליטר אחד של PBS קר לכל לשטוף. לאחר הכביסה, lyse החיידקים עם 180 microliters של חיץ תיזה ו 70 microliters של lysozyme. לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להקפיא-להפשיר את החיידקים שלוש פעמים במינוס 78 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ו 34 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בהתאמה.לאחר הסיבוב האחרון של הפשרת הקפאה, sonicate המדגם במשך 20 דקות ואחריו דגירה 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לאסוף את המדגם lysed על ידי צנטריפוגה ומאמץ את תכולת הצינור דרך קרום מסנן 10 קילודלטון. לשטוף את המסנן ארבע פעמים עם 100 microliters של מים לכל לשטוף aliquot כל לשטוף לתוך בארות בודדות של צלחת שחורה שטוחה 96 היטב.לאחר מכן למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות על קורא צלחת עם אורך גל של העירור וההפלה המתאים הפלואורופור. תוצאות אופייניות אלה מהערכת הצטברות תאית על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית בנוכחות והיעדר אפלוקס מראות כי הפלואורסצנטיות תאית של החיידקים גבוהה משמעותית לאחר טרום טיפול עם CCCP המציין כי אפלוקס מפחית את ההצטברות בתוך החיידקים. בתמונות מיקרוסקופיות קונפוקאליות מייצגות אלה של חיידקים שליליים Gram חיובי ו Gram, לוקליזציה של אנטיביוטיקה בתוך החיידקים ניתן לדמיין לאחר טיפול CCCP.תופעה זו אינה נצפית כאשר לא CCCP מתווסף. בעת שימוש באנטיביוטיקה פלואורסצנטי, להיות מודעים איזה מידע אתה מכוון לאסוף הקפד לשקול איזה פרוטוקול יהיה שימושי ביותר בעת קבלת נתונים אלה. בעקבות הסינתזה שלהם, אנטיביוטיקה פלואורסצנטי יכול לשמש כדי ללמוד מספר תהליכים חיידקיים כולל אינטראקציות יעד התרופה ושינויים התנגדות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...