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March 2nd, 2020
DOI :
March 2nd, 2020
•0:05
Introduction
0:33
Fluorescent Antibiotic Synthesis
2:16
Antimicrobial Activity Evaluation
4:19
Probe Accumulation Analysis
7:00
Results: Representative Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes
7:48
Conclusion
Transcript
फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं की तैयारी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी जैसी सुविधाजनक विश्लेषणात्मक तकनीकों के माध्यम से बैक्टीरिया के भीतर इन चिकित्सीय अभिकर्मकों के स्थानीयकरण के आकलन के लिए अनुमति देती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ वह आसानी है जिसके साथ एंटीबायोटिक स्थानीयकरण का निर्धारण किया जा सकता है। यह स्थानीयकरण कई घटनाओं के लिए प्रासंगिक है जिसमें efflux शामिल है।
क्लिक करें एक प्रतिक्रिया प्रक्रिया करने के लिए, एक गोल नीचे फ्लास्क में ब्याज की अज़ाइड एंटीबायोटिक रखें और फ्लास्क में एजाइड के प्रति मिलीमोल के 25 मिलीलीटर tert-butanol और 25 मिलीलीटर पानी जोड़ें। समाधान के लिए तैयार फ्लोरोफोर एल्किने जोड़ें और प्रतिक्रिया को 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। इसके बाद, फ्लास्क में कॉपर सल्फेट के 0.6 समकक्ष और एस्कॉर्बिक एसिड के 2.4 समकक्ष जोड़ें।
एक घंटे के लिए या एलसीएमएस द्वारा विश्लेषण प्रतिक्रिया पूरा होने को इंगित करता है जब तक प्रतिक्रिया हिलाओ। फिर एंटीबायोटिक पाड़ के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया को ठंडा और शुद्ध करें। यहां, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं की तैयारी के लिए प्रमुख प्रमुख क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया को सिप्रोफ्लोक्सेसिन, लाइनज़ोलिड और ट्राइमेटहोप्रिम के आधार पर एक एजाइड इंटरमीडिएट के माध्यम से संबंधित एंटीबायोटिक्स से संश्लेषित संरचना के उदाहरणों के साथ दिखाया गया है।
इन तरल क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री में सिप्रोफ्लोक्सेसिन अज़ाइड और एनबीडी एल्किने क्लिक रिएक्शन से निशान, एजाइड को 3.2 मिनट पर एल्यूट किया गया था और उत्पाद को 3.8 मिनट पर एल्यूट किया गया था। क्लिक करें प्रतिक्रिया की प्रगति अज़ाइड चोटी के गायब होने के बाद की जा सकती है। इन स्पेक्ट्रा में, शुद्धि के प्रभाव को गलत चोटियों के गायब होने के साथ कल्पना की जा सकती है।
संश्लेषित एंटीबायोटिक की रोगाणुरोधी गतिविधि का आकलन करने के लिए, एलबी एगर प्लेटों पर एंटीबायोटिक पाड़ के लिए उपयुक्त बैक्टीरियल उपभेदों के लकीर ग्लिसरोल स्टॉक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृतियों को विकसित करें । अगली सुबह, प्रत्येक प्लेट से एक ही कॉलोनी चुनें और संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्रति CAMHB के पांच मिलीलीटर में रात भर कालोनियों । अगले दिन, ताजा CAMHB में संस्कृतियों को लगभग 40 गुना पतला करें और बैक्टीरिया को 0.4 और 0.8 के बीच 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व के साथ मध्य लॉग चरण में विकसित करें।
इसके बाद, बाँझ पानी में 20% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में 1.28 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर प्रत्येक फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक के स्टॉक समाधान तैयार करें और 96-वेल प्लेट के पहले कॉलम के प्रत्येक कुएं में एंटीबायोटिक के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। पहले कॉलम के प्रत्येक कुएं में CAMHB के 90 माइक्रोलीटर और अन्य सभी कुओं में 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर थाली के पार एक धारावाहिक दो गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करते हैं ।
अच्छी तरह से मिश्रण करने के बाद, मिड लॉग चरण संस्कृतियों को लगभग एक बार 10 से छठी कॉलोनी में इकाइयों को बनाने के लिए कमजोर पड़ने वाले कुओं में कमजोर पड़ने वाले कुओं में 50 माइक्रोलीटर जोड़ें ताकि पांचवें कॉलोनी में प्रति मिलीलीटर इकाइयों का निर्माण करने के लिए लगभग पांच गुना 10 की अंतिम एकाग्रता प्राप्त की जा सके। जब बैक्टीरिया के सभी चढ़ाया गया है, प्लेटों पर lids जगह है और मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर 18 से 24 घंटे के लिए संस्कृतियों इनक्यूबेट । अगले दिन, नेत्रहीन प्लेटों का निरीक्षण करें।
न्यूनतम अवरोध एकाग्रता कोई दिखाई वृद्धि के साथ अच्छी तरह से सबसे कम एकाग्रता होगी। जांच संचय विश्लेषण के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक रात के इनक्यूबेशन के लिए पौंड आगर प्लेटों पर जीवाणु उपभेदों के लकीर ग्लिसरोल स्टॉक । अगली सुबह, ३७ डिग्री सेल्सियस पर lysogeny शोरबा में रात भर संस्कृति के लिए थाली से एक ही कॉलोनी उठाओ ।
अगली सुबह, ताजा माध्यम में लगभग 50 गुना रातोंरात संस्कृति को पतला करें। जब संस्कृति मध्य लॉग चरण तक पहुंचती है, तो बैक्टीरिया को अपकेंद्रित्र द्वारा गोली दें और माध्यम को डिकेंट करें। पीबीएस के एक मिलीलीटर में बैक्टीरिया को फिर से खर्च करें और बैक्टीरिया को फिर से अपकेंद्री करें।
सुपरनैंट को डिकेंट करें और पीबीएस में धोए गए गोली को दो के 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व में फिर से खर्च करें। पीबीएस में 10 मिलीमोलर सीसीसीपी के 10.1 माइक्रोलीटर को बैक्टीरिया के एक मिलीलीटर में जोड़ें और बैक्टीरिया को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया को इकट्ठा करें और पीबीएस में 10 से 100 माइक्रोमोलर फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक समाधान के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।
37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 30 मिनट के बाद, प्रति वॉश ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर में चार बार अपकेंद्रण द्वारा कोशिकाओं को धोएं। धोने के बाद, लाइसिस बफर के 180 माइक्रोलीटर और लाइसोजाइम के 70 माइक्रोलीटर के साथ बैक्टीरिया को लाइसे करें। 30 मिनट के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर, फ्रीज-गल बैक्टीरिया शून्य से तीन बार ७८ डिग्री सेल्सियस पांच मिनट के लिए और ३४ डिग्री सेल्सियस क्रमशः 15 मिनट के लिए ।
फ्रीज-विगलन के अंतिम दौर के बाद, 20 मिनट के लिए नमूना सोनीकेट और उसके बाद 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेशन। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा lysed नमूना एकत्र करें और 10 किलोडडलटन फिल्टर झिल्ली के माध्यम से ट्यूब सामग्री को तनाव दें। फिल्टर चार बार धोने के प्रति पानी के १०० माइक्रोलीटर के साथ धोने और aliquot प्रत्येक एक काले फ्लैट नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में धोने ।
फिर फ्लोरोफोर के लिए उपयुक्त उत्तेजन और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक प्लेट रीडर पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें। एफ्लक्स की उपस्थिति और अनुपस्थिति में फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इंट्रासेलर संचय के मूल्यांकन से ये विशिष्ट परिणाम बताते हैं कि सीसीसीपी के साथ पूर्व-उपचार के बाद बैक्टीरिया का इंट्रासेलुलर फ्लोरेसेंस काफी अधिक है जो यह दर्शाता है कि एफ्लक्स बैक्टीरिया के भीतर संचय को कम करता है। ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के इन प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों में, बैक्टीरिया के भीतर एंटीबायोटिक के स्थानीयकरण को सीसीसीपी उपचार के बाद कल्पना की जा सकती है।
यह घटना तब नहीं देखी जाती है जब कोई सीसीसीपी नहीं जोड़ा जाता है। फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करते समय, इस बात का ध्यान रखें कि आप किस जानकारी को इकट्ठा करने का लक्ष्य रख रहे हैं और इस डेटा को प्राप्त करते समय कौन सा प्रोटोकॉल सबसे उपयोगी होगा, इस पर विचार करना सुनिश्चित करें। उनके संश्लेषण के बाद, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं लक्ष्य बातचीत और प्रतिरोध संशोधनों सहित जीवाणु प्रक्रियाओं के एक नंबर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
फ्लोरोसेंटी टैग किए गए एंटीबायोटिक्स शक्तिशाली उपकरण हैं जिनका उपयोग रोगाणुरोधी प्रतिरोध के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख फ्लोरोसेंटी टैग एंटीबायोटिक दवाओं की तैयारी और बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए उनके आवेदन का वर्णन करता है। जांच का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी द्वारा बैक्टीरियल प्रतिरोध (उदाहरण के लिए, एफलक्स) के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
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