Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

MRLS는 호주 대학원 상 (APA)과 분자 생물 과학 연구 발전 상을위한 연구소에 의해 지원됩니다. 와니다 페상은 UQ 국제 장학금 (UQI)과 IMB 대학원 상 (IMBPA)에 의해 지원되었다. MAC는 NHMRC 원리 연구원 (APP1059354)이며 퀸즐랜드 대학에서 분수 교수 연구원 임명을 보유하고 있으며 염증 성 질환의 임상 충족되지 않은 요구를 해결하기 위해 약물을 개발하는 회사인 Inflazome Ltd.의 CEO로 남은 시간을 보유하고 있습니다. MATB는 웰컴 트러스트 전략 그랜트 WT1104797/Z/14/Z 및 NHMRC 개발 보조금 APP1113719에 의해 부분적으로 지원됩니다. 현미경 검사는 ACRF의 지원으로 설립된 분자 생물 과학 암 생물학 화상 진찰 시설에 대한 호주 암 연구 재단 (ACRF) /연구소에서 수행되었습니다.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

저자는 선언할 것이 없습니다.

성공적인 형광 항생제 프로브의 생성은 부모 약물의 SAR을 신중하게 계획하고 고려하는 것으로 시작해야합니다. SAR이 알려지지 않았거나 완전히 탐구되지 않은 경우 생물학적 활성을 폐지하지 않고 선택적으로 수정될 수 있는 부위를 찾기 위해 몇 가지 옵션을 테스트해야 할 수도 있습니다. 일단 사이트/s가 확인되면, 링커 moiety의 설치는 종종 행동의 생물학적 사이트와 비활성 형광단 사이의 입체 간격을 제공하기 위해 필수적이다. 항생제에 링커를 부착하는 데 사용되는 반응이 생체 내 에스테르에 의해 절단에 취약한 예를 들어, 예를 들어, 에스테르를 피하는 생체 안정 기능 그룹을 떠난다는 것을 주의해야 한다. 항생제의 약동적 및 약동학적 프로파일에 따라, 간단한 알킬 링커가 사용될 수 있고, 그렇지 않으면 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커와 같은 덜 친유성 옵션을 고려해야 한다. 링커를 부착하면 관련 박테리아에 대한 NIC가 모 화합물과 유사하도록 항균 활성을 평가해야합니다.
이 작품에서는 여러 가지 이유로, 우리는 Huigsen azide-alkyne [3+2] 다극성 사이클로더 (클릭 화학, 그림 1참조)를 항생제에 불소 불소를 리게이트하는 것을 권장합니다. 클릭 반응은 매우 선택적이며, 이는 항생제에 대한 반응성 기의 보호가 필요하지 않다는 것을 의미하며, 또한 반응은 안정적이고 생체 적합성 트리아졸 을 떠난다. 아지드 성분은 일반적으로 알키네의 도입보다 다양한 구조적 유형으로 더 쉽게 달성되기 때문에 우리의 절차에서 항생제 부분에 도입된다. 2개의 알키네 파생된 형광단의 합성은, 그 외가 원하는 경우에 탐구될 수 있더라도, 여기에서 기술됩니다. NBD와 DMACA는 작은 크기로 인해 선택되어 세포 침투 및 표적 상호 작용을 방해할 가능성을 최소화했습니다. 클릭 반응 자체는 구리 촉매를 사용하여 수행되며, 여기서 Cu2+(CuSO 4,아스코르브산 환원제) 또는 Cu+(CuI)가 시약으로 사용될 수 있다. 다음 정제(그림 2),MICs는 다음 azide와 같이 테스트되어야한다. 형광포핍증 선택과 부착 부위를 신중하게 고려하더라도 열악한 항생제 활동이 관찰 될 수 있습니다. 그러나 비활성 프로브를 사용하지 않는다는 의미는 아닙니다. TMP 프로브와 같이, 항균 활성이 좋지 않은 화합물은 여전히 모약물과 동일한 표적에 결합할 수 있다. 이것은 운동 의 모드에 대한 연구를 가능하게하고 유출과 같은 저항으로 이어지는 현상의 검사.
프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 간단한 분광광도 분석법(도3)또는 유세포분석법(도4)을사용하여 형광 항생제에 의한 세균 라벨링을 분석할 수 있다. 두 방법 모두 세포 축적을 정량화할 수 있으며, 세포를 포량화하고 포세이트에서 형광 국소화를 검사함으로써 세포내 축적을 평가할 수 있다. 이 프로토콜에서, 세포 용해를 위한 리소자임의 사용은, 이것은 급속한, 보편적인 기술이기 때문에 기술됩니다. 글리신-HCl7을사용한 하룻밤 치료와 같은 다른 용해 조건도 성공적으로 사용되었습니다. 이 기술을 사용하여, 저항의 중요한 기계장치인 항생제 세포 축적에 유출의 충격을 공부하는 것이 가능합니다. 유출이 실제로 박테리아에 존재하는 경우, 세포 내 축적의 부족이 관찰 될 것이다, 이 CCCP 같은 유출 억제제등을 사용하여 구출 될 수 있지만.
현미경 검사는 또한 다른 박테리아에 있는 프로브 현지화를 시각적으로 검사하기 위하여 실행될 수 있고, 행동의 모드에 대한 정보를 얻고, 잠재적으로 또한 저항 (대표적인 예에 대한 그림 5 참조). 박테리아 내국화를 보기 위해서는 SIM(구조화 조명 현미경), SR-SIM(초해상도-SIM), Airyscan 또는 STED(자극방출 고갈)와 같은 기능을 갖춘 고해상도 공초점 현미경이 필요합니다. 또한 고성능 커버 슬립을 사용해야 하며 적절한 소프트웨어(예: FIJI, Zen 또는 Imaris)에서 이미징 후 분석을 수행해야 합니다. 프로브의 국소화는 Hoechst-33342 (청색, 핵산), Syto-9 (녹색, 핵산) 및 FM4-64FX (적색, 막)와 같은 특정 아키텍처를 얼룩지게하는 염료와 비교됩니다. 염료의 선택은 형광 항생제와 일치하도록 해야하며, 사용되는 각 색상은 최소한의 스펙트럼 중복을 가져야합니다. 최상의 이미지를 얻으려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 박테리아가 슬라이드에 너무 붐비는 경우 부유 펠릿의 일부만 가져 온 다음 더 많은 장착 매체로 희석하십시오. 대조적으로, 박테리아가 슬라이드에 너무 희소한 경우, 단순히 더 많은 박테리아로 시작합니다. 이 프로토콜에서는 살아있는 세포(예: Cygel)와 호환되는 열 가역 겔의 사용이 박테리아(운동성 박테리아 포함)를 고정하기 때문에 살아있는 세포 이미징에 권장되지만 다른 마운팅 매체 또는 아가로즈도 성공적으로 사용되었습니다.
전반적으로, 생물학적활성 형광 항생제 유도체의 제조에 직면할 수 있는 도전에도 불구하고, 그들의 사용의 단순성과 그들의 다양성은 AMR에 있는 연구를 위한 이 탐사기 매력적인 공구를 만듭니다. 형광 성 항생제를 사용하여 미래의 작업은 항생 저항의 기계장치에 대한 통찰력을 제공하고, 현재 항생제가 어떻게 작동하는지에 대한 우리의 이해를 향상시키고, 더 나은 약물의 개발을 도울 가능성이 있습니다.

항균 저항 (AMR)는 전 세계 인간의 건강에 큰 위협을 제기 상승 위기입니다. 대부분의 항생제에 대한 내성이 보고되고 있으며, 임상적으로 이용 가능한 모든 약물에 내성이 있는 박테리아에 의한 감염이 나타나고 있다. AMR의 상승에 대처하기 위하여는, 우리는 이 다각적인 현상및 항생제와 박테리아 사이 근본적인 기계장치 그리고 상호 작용의 우리의 이해를 증가할 필요가 있습니다. 역사적으로 제대로 이해 된 한 가지 측면은 축적과 유출현상과 함께 박테리아로항생제의 투과입니다. 이 지식은 새로운 약을 설계하고 저항의 기계장치를 이해하는 에서 결정적이다. 따라서, 이것은 AMR 연구에 있는 중요한 역할을 합니다.
항생제 농도를 측정하기 위해 취할 수있는 두 가지 주요 접근법이 있습니다 : 약물을 직접 측정하거나 정량화를 용이하게하기 위해 고안된 변조로 태깅. 항생제를 태그하면 검출이 향상되지만 항균 활성 및 투과성과 같은 약물의 생물학적 활성을 교란시킬 수 있습니다. 태그가 지정되지 않은 메서드에는 문제가 되지 않습니다. 그러나 탐지는 어려울 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 기술 발전은 박테리아1,2,3,4,5,6,7의항생제 농도를 직접 측정하기 위해 질량 분석법 (MS)을 활용한 연구의 붐을 주도했습니다. 이러한 연구는 다양 한 박테리아에 세포 내 축적을 공부 하는 것이 가능 하다는 것을 보여주었다, 그람 음성 박테리아와 함께 가장 널리 공부. 분자 투과성의 정량화는 그 때 활성에 연결되고 약물 개발2,3,4를알리기 위하여 이용되고, 비록 직접 축적 및 표적 활성을 수렴할 때 주의해야 한다5. MS 발달 이전에는 테트라사이클린과 퀴놀론8,9,10,11과같은 본질적인 형광을 가진 항생제만이 농도를 직접 측정할 수 있었습니다. 범위가 분명히 제한되어 있지만 축적 및 유출을 검사하고 정량화하여 형광 기반 정량화의 유용성을 설명했습니다.
태그가 달린 항생제는 방사성 및 형광 태그가 일반적인 분포, 작용의 모드 및 저항을 공부하기 위하여 수십 년 동안 이용되었습니다. 무선 태그가 있는 프로브는 모 화합물과 거의 동일하다는 장점이 있으므로 생물학적 활성이 현저히 다를 수 없습니다. 3H, 14C및 15N과같은 동위원소는 항생제에서 이들 원소의 돌출로 인해 빈번하게 사용되어 왔으며, 다양한 항생제 스캐폴드가1,10,12,13으로조사되었다. 무선 프로브의 검출은 간단하지만, 이러한 접근법의 사용을 제한하는 많은 물류 문제(예: 안전, 동위원소 반감기)가 있습니다. 또 다른 전략은 형광 태그 항생제입니다. 이러한 프로브는 MS보다 간단한 기술을 사용하고 방사선8의물류 문제없이 부모 약물의 분포 및 작용 및 저항모드를 검사하는데 사용될 수 있다. 이 접근에 주요 한 점은 항생제는 일반적으로 상대적으로 작은 분자, 따라서 형광 moiety의 도입은 중요 한 화학 적 변화를 포즈. 이 변경 은 생리 화학 적 특성 및 항균 활동에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 부모 항생제의 대표적인 결과를 생성하기 위하여 이 요인을 평가하기 위하여 주의를 기울여야 합니다.
이 작품에서, 방법은 우리의 이전 간행물14,15,16에서와같이 형광 항생제를 종합, 평가 및 사용하는 방법에 대해 설명한다. 이전 작업을 통해 다양한 목적으로 많은 형광 항생제가 준비되고 사용되었습니다 (Stone et al.8참조). 생물학적 활동에 영향을 미칠 가능성을 최소화하기 위해 이 작업에 는 니트로벤조사디아졸(NBD, 녹색) 및 7-(디메틸아미노)-2-옥소-2 H-크롬-4-yl(DMACA, 블루)이 매우 작은 형광증이 사용됩니다. 또한, 마이크로브로스 희석 최소 억제 농도(MIC) 분석법을 이용한 항균 활성의 평가는, 활성에 대한 변형의 효과를 측정할 수 있도록 설명된다. 이러한 형광 태그프로브는 분광광도 측정, 유세포분석및현미경검사법에 사용될 수 있습니다. 가능한 응용 프로그램의 범위는 형광 항생제의 장점이있는 곳입니다. 세포 축적은 MS 만으로는 불가능한 정량화, 분류 및 시각화될 수 있습니다. 형광 항생제의 사용을 통해 얻은 지식이 저항에 대한 우리의 이해와 AMR과의 싸움에 도움이 되기를 바랍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

형광 성 항생제는 다른 방법에 비해 중요한 이점 때문에 항균 내성의 연구에 쉽게 사용되는 다목적 연구 도구입니다. 이러한 프로브를 준비하기 위해, 항생제의 아지드 유도체는 합성되고, 클릭 화학에 의해 아지드 알키네 디폴라 사이클로추가를 사용하여 알키네-플루오로포어와 결합된다. 정제 후, 형광 항생제의 항생제 활성은 최소 억제 농도 평가에 의해 시험된다. 박테리아 축적을 연구하기 위해 분광광도법 또는 유세포 분석법을 사용할 수 있으므로 방사성 항생제 유도체에 의존하는 방법보다 훨씬 간단한 분석을 할 수 있습니다. 또한, 공초점 현미경 검사법은 저항하는 종에서 일어나는 작용의 모드 및 변경에 관하여 귀중한 정보를 제공하는 박테리아 내의 현지화를 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다. 항균 저항의 연구 결과에 있는 형광 항생제 탐사기의 사용은 미래 확장을 위한 많은 잠재력을 가진 강력한 방법입니다.

그림 1 형광항생제의 제조를 위한 핵심 클릭 화학반응(A)을예시하고,(B)시프로플록사신(cipro), 트리메쇼프림(TMP) 및 라인졸리드에 기초한 당사의 출판된 형광 항생제의 구조의 예를 예시한다. 이들 프로브는 모두 아지드 중간을 통해 상응하는 항생제로부터 합성되었다. 그 후 NBD 및 DMACA 형광단에 결합하여 각각 알케인으로 기능화시켰다.
도 2는 시프로플록사신-N 3 및 NBD-알키네 클릭 반응에서 LCMS 트레이스를 예로 들수 있는데, 여기서 아지드는 3.2분에서 용출되고 생성물은 3.8분에서 용출되었다. 스펙트럼 3은 MS 및 UV 트레이스에서 잘못된 피크가 사라지면서 정화의 영향을 보여줍니다. 제품 피크와 불순물 피크의 통합을 통해 순도와 반응 진행률을 정량화할 수 있습니다.
도 3은 유출의 존재 와 부재에서 형광 분광법에 의한 세포내 축적의 평가에서 전형적인 결과를 보여줍니다. 본 실험에서, 대장균은 양성자 동기력(PMF)을 붕괴시키는 CCCP의 첨가 유무에 관계없이 TMP-NBD로 처리하였다. 박테리아의 세포내 형광은 CCCP로 전처리될 때 상당히 높았으며, 이는 유출이 이 박테리아의 축적을 감소시임을 나타낸다. 이 실험은 tolC에결핍된 박테리아를 사용하여 반복되었고, 개별 적인 유출 펌프 성분의 영향을 조사하기 위해 이 분석법의 용량을 표시하였다. 이 경우, 야생형 세균에 비해 세포내 형광이 증가했지만 CCCP 축적은 여전히 증가하였다. 이러한 연구 결과는 tolC가 TMP 유출에 참여하지만 유일한 PMF 구동 펌프가 아니라는 것을 나타냅니다.
도 4는 도 2와동일한 실험의 결과를 나타내지만 분광법 대신 유세포분석으로 측정된 축적을 나타낸다. 동일한 데이터 동향이 관찰되었다, 어느 기술이 유출 매개 세포 내 축적의 현상을 연구하는 데 사용될 수 있음을 입증.
도 5는 TMP-NBD(1) 및 cipro-NBD(2+3) 형광 프로브로 표지된 그람양성(S.orureus)및그람 음성박테리아(E. coli)의대표적인 공초점 현미경 이미지를 각각 나타낸다. 두 경우 모두, 적색 막 염료 FM4-64FX를 공동 국소화를 비교하기 위해 첨가하였다. TMP-NBD의 경우, 청색 핵산 염료 Hoechst-33342도 사용되었다. 이러한 이미지를 오버레이함으로써 박테리아에서 항생제의 국소화를 시각화하였다. 패널 2와 3을 비교하면 유출의 영향이 어떻게 조사되었는지, 2에사용된 유출 억제제 CCCP를 통해 세포내 축적을 초래하는 방법을 보여줍니다. 패널 3에서는CCCP가 추가되지 않았습니다. 따라서, 유출은 활성 및 프로브 축적을 볼 수 없었다.
도 6은 DMACA 표지된 옥사졸리디논의 프로브 Lz-NBD로 표지된 그람양성(S. aureus)박테리아의 대표적인 공초점 현미경 영상을 나타낸다. 적색 막 염료 FM4-64FX를 공동 국소화를 비교하기 위해 첨가하였고, 녹색 핵산 염료 Hoechst-33342도 사용되었다. 이러한 이미지를 오버레이함으로써, 박테리아에 있는 항생제의 국소화는 막과 핵산에서 구별되는 내부 국소화를 보여주는 가시화되었습니다.
표 1은 3개의 형광 항생제, 시프로플록사신, 트리메토프림(TMP) 및 리졸리드(Lz)에 대한 MIC 값을 나타내며, 각각의 모 항생제, NBD 및 DMACA 유도체에 대해 제시된 데이터를 나타낸다. 각 항생제에 대한 대표적인 종은 그람 양성 및 그람 음성 을 모두 포함하여 선택되었다. 시프로플록사신 시리즈의 경우, 두 형광 프로브는 모약물에 비해 항생제 활성을 잃었지만 모든 종에 대한 일부 활성을 유지했다. 유사하게, linezolid 프로브는 몇몇 활동을 분실했습니다, 그러나 약한 항생제에 온건한 남아 있었습니다. TMP 프로브는 야생형 박테리아에 대한 거의 모든 활성을 잃었지만, 유출성 결핍 대장균에대해 활성이 있었으며, 이는 항균 활성의 손실이 축적의 부족 때문임을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> 그림 1: 항생제 유래 프로브의 합성 및 구조. (a)아지드 항생제 및 알키네 형광단으로부터형광항생제 프로브의 합성을 위한 일반적인 반응 방식. (B)시프로플렉스사신, 트리메토프림 및 라인졸리드를 기반으로 한 당사의 간행된 프로브의 구조. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> 그림 2: LCMS에 의한 항생제 유래 프로브 순도 측정. 분석 LCMS는 (1) 불완전, (2) 완료 및 (3) HPLC 정제 시프로펠록사신-N3 + NBD-알키네 클릭 반응으로부터의 추적으로 반응 완료 시 시작 물질의 실종을 입증하고, 정제에 대한 기타 피크를 시음한다. A = UV-Vis 트레이스(250nm의 흡광도), B = MS 트레이스(양수 및 음수 모드). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> 도 3: 항생제 유래 프로브 축적의 플레이트 리더 측정. 야생 형 (1, ATCC 25922) 및 Δ톨C (2, ATCC 25922) 대장균 배양(A)및(B)에서TMP-NBD (50 μM)의 세포 축적의 형광 분광 측정CCCP (100 μM)를 첨가하지 않고. 통계적 유의성(**p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001)은 CCCP의 부재 또는 존재 와 야생형과 Δ톨C대장균사이에 도시된다. 보고된 데이터는 3개의 실험에 대한 평균 ±SD이다. 이 수치는 이전 간행물15에서적응하고, 세포 내 축적에 유출의 역할을 설명하기 위해 분광학의 사용을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> 그림 4: 항생제 유래 프로브 축적의 유세포 분석 측정. 야생 유형 (1, ATCC 25922) 및 ΔtolC (2, ATCC 25922) 대장균에서 TMP-NBD를 사용하여 세포 축적의 유세포 분석 측정은 CCCP (100 μM)의 첨가및 첨가없이 배양. 중앙값 형광 활성은 10,000개의 세균 사건으로부터 도시되며, 통계적 유의성(***, p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001) CCCP의 부재 와 존재 사이 및 야생 형및 ΔtolC대장균사이에 도시된다. 보고된 데이터는 3개의 실험에 대한 평균 ±SD이다. 이 수치는 우리의 이전 간행물15에서적응하고, 세포 내 축적에 유출의 역할을 설명하기 위해 유세포 분석의 사용을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> 그림 5: NBD 프로브 현지화의 공초점 현미경 시각화. 1) Hoechst-33342 (청색, 핵산), TMP-NBD (녹색), FM4-64FX (적색, 막) 및 중첩으로 표지된 S. 아우레우스를 살아있는 S. 아우레우스; 2) cipro-NBD (녹색), FM4-64FX (적색, 막) 및 중첩된 CCCP(유출 억제제)로 처리된 살아있는 대장균; 3) 살아있는 대장균을 cipro-NBD (녹색), FM4-64FX (적색, 멤브레인)로 표시하고 중첩한다. 이 수치는 이전 간행물15,16에서적응하고, 유출의 충격을 포함하여 프로브 국소화를 검사하기 위하여 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> 그림 6: DMACA 프로브 현지화의 공초점 현미경 시각화. 옥사졸리디논의 프로브 Lz-DMACA (파란색), 수축녹색 (녹색, 핵산) 및 FM4-64FX (적색, 막)로 표지된 살아있는 S. 아우레우스의 공초점 현미경 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">MIC(μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">종</td>
			<td>스트레인</td>
			<td>시프로 (주)</td>
			<td>시프로-NBD</td>
			<td>시프로 드마카</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>라인졸리드 (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">황색포도상구균</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">연쇄상 구균 폐렴</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">엔테로코커스 파에시움</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">클렙시엘라 폐렴</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">슈도모나스 녹농균사</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">대장균</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤0.004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>>64</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>돌연변이 Δ톨C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 국물 미세 희석 MIC 분석에 의해 측정된 바와 같이, 적절한 임상적으로 관련된 세균성 균주에 대하여 시프로플록사신, trimethoprim 및 linezolid에 근거를 둔 형광 항생제 프로브의 항생제 활동. 대부분의 경우, 프로브는 부모 약물에 비해 일부 활성을 잃었지만, 일부 측정 가능한 항생제 효능을 유지 (추가 연구에서 유용하기에 충분).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

형광 항생제의 제조는 분광광질및 현미경 검사법과 같은 편리한 분석 기술을 통해 박테리아 내의 이러한 치료 시약의 국소화의 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 항생제 국소화를 결정할 수 있는 용이성입니다. 이 지역화는 efflux를 포함한 여러 현상과 관련이 있습니다.클릭 A 반응 절차를 수행하려면, 둥근 바닥 플라스크에 관심의 아지드 항생제를 배치하고 플라스크에 아지드의 밀리몰 당 25 밀리리터와 25 밀리리터의 물을 추가합니다. 준비된 불소 알키네를 용액에 넣고 반응을 섭씨 50도로 가열합니다. 다음으로, 구리 황산염의 0.6 등가물과 플라스크에 아스코르브 산 2.4 등가물을 추가한다.LCMS의 분석이 반응 완료를 나타내기 전까지는 1시간 동안 또는 반응을 저어줍니다. 그런 다음 항생제 비계에 적합한 반응을 냉각하고 정화합니다. 여기서, 치프로플록사신, 라인졸리드 및 트리메토림에 기초한 아지드 중간체를 통해 해당 항생제로부터 합성된 구조의 예와 함께 형광 항생제의 제조를 위한 주요 클릭 화학 반응이 나타난다.이러한 액체 크로마토그래피 질량 분광법은 ciprofloxacin 아지드 및 NBD 알키인 클릭 반응에서 추적, 아지드는 3.2 분에 출례하고 제품은 3.8 분에 용출되었다. 클릭 반응의 진행은 아지드 피크의 실종에 선행될 수 있다. 이러한 스펙트럼에서, 정화의 영향은 잘못된 피크가 사라짐으로 시각화 될 수있다.합성 된 항생제의 항균 활성을 평가하기 위해, LB 천 판에 항생제 비계에 적합한 세균균의 줄무늬 글리세롤 주식과 37 섭씨에서 하룻밤 문화를 성장. 다음 날 아침, 각 접시에서 하나의 식민지를 선택하고 37섭씨에서 문화당 CAMHB의 5 밀리리터에서 하룻밤 사이에 식민지를 배양합니다. 다음 날, 신선한 CAMHB에서 배양액을 약 40배 희석하고 0.4~0.8 사이의 600나노미터에서 광학 밀도로 박테리아를 중간 로그 단계로 성장시다.다음으로, 멸균수에 20%디메틸 설프리산화물에서 밀리리터당 1.28 밀리그램의 각 형광 항생제의 스톡 솔루션을 준비하고 96웰 플레이트의 첫 번째 컬럼의 각 웰에 10마이크로리터의 항생제를 첨가한다. 첫 번째 컬럼의 각 웰에 90 마이크로리터를 추가하고 다른 모든 우물에 50 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 플레이트 를 가로 질러 직렬 두 배 희석을 수행합니다.철저하게 혼합한 후, 중간 로그 상 배양을 밀리리터당 제6식민지 형성 단위로 약 10배로 희석하고 각 배양물의 50마이크로리터를 희석유에 첨가하여 밀리리터당 5배 10분의 1의 최종 농도를 얻었다. 모든 박테리아가 도금되었을 때 뚜껑을 접시에 놓고 흔들림없이 섭씨 37도에서 18 ~24 시간 동안 배양하십시오. 다음 날, 시각적으로 판을 검사합니다.최소 억제 농도는 눈에 띄는 성장없이 잘 가장 낮은 농도가 될 것입니다. 프로브 축적 분석을 위해 세균균균의 글리세롤 재고를 LB 한천 플레이트에 37°C의 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 아침, 섭씨 37도에서 리소제니 국물에 하룻밤 문화를 위해 접시에서 하나의 식민지를 선택합니다.다음 주 아침, 신선한 매체에서 하룻밤 문화를 약 50배 희석시 희석시. 문화권이 중간 로그 단계에 도달하면, 원심분리에 의해 박테리아를 펠릿하고 배지를 데수. PBS의 1 밀리 리터에서 박테리아를 다시 일시 중단 하 고 다시 박테리아원심 분리.슈퍼나탄을 데수제와 PBS에서 세척된 펠릿을 600 나노미터의 광학 밀도로 재보설한다. PBS에 10 밀리머 CCCP의 10.1 마이크로리터를 박테리아 1밀리리터에 넣고 10분 동안 섭씨 37도에서 박테리아를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 PBS에서 10 에서 100 마이크로 몰러 형광 항생제 용액의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.섭씨 37도에서 30분 간 배양한 후, 세척당 차가운 PBS 1밀리리터에서 세포를 4회 원심분리하여 세척합니다. 세척 후, 리시스 버퍼의 180 마이크로 리터와 리소지메의 70 마이크로 리터와 박테리아를 lyse. 섭씨 37도에서 30분 후, 세균을 영하 78도에서 각각 섭씨 5분, 섭씨 34도에서 3회 동결해 보겠습니다.동결 해빙의 마지막 라운드 후, 65섭씨에서 30분 배양후 20분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 lysed 샘플을 수집하고 10 킬로달톤 필터 멤브레인을 통해 튜브 내용물을 변형. 세척당 100 마이크로리터의 물로 필터를 네 번 씻고, 각 세척을 블랙 플랫 하부 96웰 플레이트의 개별 우물로 씻어 넣습니다.그런 다음 형광에 적합한 흥분 및 방출 파장을 플레이트 판독기의 형광 강도를 측정합니다. 이러한 전형적인 결과는 불광 분광법의 존재와 불룩스의 부재에 의한 세포내 축적의 평가에서 유래한 것으로, 박테리아의 세포내 형광이 CCCP를 통해 사전 처리 한 후 박테리아의 세포 내 형광이 박테리아 내축적을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 대표적인 공초점 현미경 이미지에서 그람 양성 및 그람 음성 박테리아의, 박테리아 내항생제의 국소화는 CCCP 치료 후 시각화될 수 있다.이 현상은 CCCP가 추가되지 않을 때 관찰되지 않습니다. 형광 성 항생제를 사용할 때, 수집하는 것을 목표로하는 정보를 염두에 두고이 데이터를 얻을 때 어떤 프로토콜이 가장 유용할지 고려해야합니다. 그들의 합성 에 따라, 형광 항생제 약물 대상 상호 작용 및 저항 수정을 포함 하 여 세균 과정의 수를 연구 하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

항생제 내성 플랫폼을 이용한 항생제 복제

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

세균성 각막염에 대하여 약 처리를 공부하기 위한 돼지 Ex Vivo Cornea 모형 을 설치합니다

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...