Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

MRLS støttes av en Australsk Postgraduate Award (APA) og et Institutt for molekylær biovitenskap Research Advancement Award. Wanida Phetsang ble støttet av UQ International Scholarship (UQI) og IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC er en NHMRC prinsippstipendiat (APP1059354) og har også en brøkdel professoriell stipendiat avtale ved University of Queensland, med sin gjenværende tid som administrerende direktør i Inflazome Ltd, et selskap som utvikler legemidler for å løse kliniske udekkede behov i inflammatorisk sykdom. MATB støttes delvis av Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z og NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi ble utført ved Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som ble etablert med støtte fra ACRF.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å erklære.

Opprettelsen av en vellykket fluorescerende antibiotikasonde må begynne med nøye planlegging og vurdering av SAR av moderstoffet. Hvis SAR ikke er kjent eller fullstendig utforsket, kan det hende at flere alternativer må testes for å finne et nettsted som kan endres selektivt uten å avskaffe biologisk aktivitet. Når et nettsted/s er identifisert, er installasjon av en linker moiety ofte viktig for å gi steric avstand mellom det biologiske handlingsstedet og inaktiv fluoropfor. Forsiktighet må tas at reaksjonen som brukes til å feste linker til antibiotika forlater en bio-stabil funksjonell gruppe, unngå for eksempel estere som er utsatt for spalting av esterases in vivo. Avhengig av den farmakodynamiske og farmakokinetiske profilen til antibiotika, kan en enkel alkyllinker brukes, ellers bør et mindre lipofilt alternativ som en polyetylenglykol (PEG) linker vurderes. Med linker festet, bør den antibakterielle aktiviteten vurderes for å sikre at MICs mot relevante bakterier ligner på den overordnede forbindelsen.
I dette arbeidet anbefaler vi bruk av Huigsen azide-alkyne [3+2] dipolar cycloaddition (klikk kjemi, se figur 1)for å ligate fluorophore til antibiotika, av flere grunner. Klikkreaksjoner er svært selektive, noe som betyr at beskyttelse av reaktive grupper på antibiotika ikke er nødvendig, og videre etterlater reaksjonen en stabil, biokompatibel triazolmoiety. Azidekomponenten introduseres til antibiotikadelen i våre prosedyrer, da dette generelt lettere oppnås med en rekke strukturelle typer enn innføring av en alkyne. Syntesene til to alkyne-avledede fluoropforer er beskrevet her, selv om andre kan utforskes hvis ønskelig. NBD og DMACA ble valgt på grunn av sin lille størrelse, noe som minimerer muligheten for å forstyrre cellepenetrasjon og målinteraksjon. Klikkreaksjonen i seg selv utføres ved hjelp av kobberkatalys, der enten Cu2+ (CuSO4, med et askorbinsyrereduksjonsmiddel) eller Cu+ (CuI) kan brukes som startreagens. Etter rensing (figur 2)skal MICene testes som med aziden. Selv med nøye vurdering av fluoropforvalg og vedleggssted, er det mulig at dårlig antibiotikaaktivitet vil bli observert. Dette betyr imidlertid ikke at en inaktiv sonde er uten bruk. Som vist med TMP-sondene, kan forbindelser med dårlig antibakteriell aktivitet fortsatt binde seg til samme mål som det overordnede stoffet. Dette kan muliggjøre studier på handlingsmåte og undersøkelse av fenomener som fører til motstand, for eksempel efflux.
Som beskrevet i protokolldelen, er det mulig å analysere bakteriell merking ved fluorescerende antibiotika ved hjelp av enten en enkel spektrofotometrianalyse (figur 3) eller flytcytometri (figur 4). Begge metodene er i stand til å kvantifisere cellulær akkumulering, og ved å lysing celler og undersøke fluorescens lokalisering i lysate, er det mulig å vurdere intracellulær akkumulering. I denne protokollen beskrives bruk av lysozym for cellelysis, da dette er en rask, universell teknikk. Andre lysisforhold, som behandling over natten med glycine-HCl7,har også blitt brukt. Ved hjelp av denne teknikken er det mulig å studere virkningen av efflux på antibiotikacellulær akkumulering, som er en viktig mekanisme for resistens. Hvis efflux faktisk er tilstede i bakteriene, vil mangel på intracellulær akkumulering observeres, selv om dette kan reddes ved hjelp av en efflux-hemmer som CCCP.
Mikroskopi kan også utføres for å visuelt inspisere probelokalisering i forskjellige bakterier, få informasjon om handlingsmåte, og potensielt også motstand (se figur 5 for representative eksempler). For å se lokalisering i bakterier, er det nødvendig med et høyoppløselig konfokalmikroskop, utstyrt med evner som SIM (strukturert belysningmikroskopi), SR-SIM (superresolution-SIM), Airyscan eller STED (stimulert utslippsuttømming). Videre bør høyytelses coverslips brukes, og etter bildebehandling analyse utført på en passende programvare (f.eks FIJI, Zen eller Imaris). Lokalisering av sonder sammenlignes med fargestoffer som flekker spesifikke arkitekturer, som Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), Syto-9 (grønn, nukleinsyre) og FM4-64FX (rød, membran). Valget av fargestoffer bør gjøres for å matche fluorescerende antibiotika, slik at hver farge som brukes har minimal spektral overlapping. For å få best mulig bilder, kan optimalisering være nødvendig. For eksempel, hvis bakterier er for overfylt på lysbildet, ta bare en del av suspendert pellet, deretter fortynne med mer monteringsmedium. I motsetning, hvis bakterier er for sparsomme på lysbildet, starter du bare med flere bakterier. I denne protokollen anbefales bruk av en termoreversibel gel som er kompatibel med levende celler (f.eks. Cygel) for levende celleavbildning, da den immobiliserer bakterier (inkludert motilbakterier), men andre monteringsmedier eller agarose har også blitt brukt.
Samlet sett, til tross for utfordringer som kan møtes i utarbeidelsen av en biologisk aktiv fluorescerende antibiotikaderivater, gjør enkelheten i bruken og deres allsidighet disse sondene attraktive verktøy for forskning i AMR. Fremtidig arbeid ved hjelp av fluorescerende antibiotika har potensial til å gi innsikt i mekanismer for antibiotikaresistens, forbedre vår forståelse av hvordan dagens antibiotika opererer, og hjelpe utviklingen av bedre legemidler.

Antimikrobiell resistens (AMR) er en stigende krise som utgjør en stor trussel mot menneskers helse rundt om i verden. Resistens mot de fleste antibiotika er rapportert, og infeksjoner forårsaket av bakterier som er resistente mot alle klinisk tilgjengelige legemidler, oppstår. For å bekjempe fremveksten av AMR, må vi øke vår forståelse av dette mangefasetterte fenomenet og de underliggende mekanismene og interaksjonene mellom antibiotika og bakterier. Et aspekt som historisk er dårlig forstått, er permeasjonen av antibiotika til bakterier, sammen med fenomenene akkumulering og efflux. Denne kunnskapen er avgjørende for å designe nye stoffer og forstå motstandsmekanismer. Derfor spiller dette en kritisk rolle i AMR-forskning.
Det er to hovedtilnærminger som kan tas for å måle antibiotikakonsentrasjon: måle stoffet direkte eller tagge med et moiety designet for å lette kvantifisering. Selv om merking av antibiotika forbedrer deteksjon, dette kan perturb den biologiske aktiviteten til stoffet, som antimikrobiell aktivitet og permeabilitet. Dette er ikke et problem for ikke-kodede metoder; Deteksjon kan imidlertid være utfordrende. I de siste årene har teknologiske fremskritt ført til en boom i forskning utnytte massespektrometri (MS) å direkte måle antibiotikakonsentrasjonen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Disse studiene har vist at det er mulig å studere intracellulær akkumulering hos en rekke bakterier, med gramnegative bakterier som er mest studert. Kvantifisering av molekylpermeabilitet har da vært knyttet til aktivitet og brukes til å informere legemiddelutvikling2,3,4, men forsiktighet må tas når direkte konflatering og målaktivitet5. Før MS utvikling, de eneste antibiotika hvis konsentrasjon kunne måles direkte var de som har iboende fluorescens, som tetracyklin og quinolones8,9,10,11. Selv om det åpenbart var begrenset i omfang, ble akkumulering og efflux undersøkt og kvantifisert, noe som illustrerer nytten av fluorescensbasert kvantifisering.
Tagged antibiotika har blitt brukt i mange tiår for å studere distribusjoner, virkningsformer og resistens, med radioaktive og fluorescerende koder er vanlig. Radiomerkede sonder har fordelen av å være nesten identisk med den overordnede forbindelsen, derfor er den biologiske aktiviteten usannsynlig å være betydelig annerledes. Isotoper som 3H, 14C og 15N har blitt ofte brukt på grunn av fremtredende av disse elementene i antibiotika, og en rekke antibiotika stillas har blitt undersøkt1,10,12,13. Selv om påvisning av radiosonder er enkel, er det en rekke logistiske bekymringer (f.eks. sikkerhet, isotop halveringstid) som har begrenset bruken av denne tilnærmingen. En annen strategi er fluorescerende-merket antibiotika. Disse sondene kan brukes til å undersøke distribusjon og virkningsformer og motstand av moderstoffet, ved hjelp av enklere teknologi enn MS og uten logistiske problemer med stråling8. Den største ulempen med denne tilnærmingen er at antibiotika er generelt relativt små molekyler, derav innføringen av en fluorescerende moiety utgjør en betydelig kjemisk endring. Denne endringen kan påvirke fysiokjemiske egenskaper og antibakteriell aktivitet. Det må derfor utvises forsiktighet for å vurdere disse faktorene for å generere resultatrepresentant for foreldreantibiotika.
I dette arbeidet er en metode beskrevet for å syntetisere, vurdere og bruke fluorescerende antibiotika, som i våre tidligere publikasjoner14,15,16. Gjennom tidligere arbeid har en rekke fluorescerende antibiotika blitt utarbeidet og brukt til en rekke formål (se Stone et al.8). For å minimere sannsynligheten for å påvirke biologisk aktivitet, brukes svært små fluoropforer i dette arbeidet: nitrobenzoksadiazol (NBD, grønn) og 7-(dimetylamino)-2-oksokso-2H-chromen-4-yl (DMACA, blå). Videre er vurderingen av antibakteriell aktivitet ved hjelp av mikrobroth fortynning minimum hemming konsentrasjon (MIC) analyse beskrevet, slik at effekten av modifikasjoner på aktivitet kan måles. Disse fluorescerende merkede sondene kan brukes i spektrofotometriske analyser, flytcytometri og mikroskopi. Utvalget av mulige anvendelser er hvor fordelen med fluorescerende antibiotika ligger. Cellulær akkumulering kan kvantifiseres, kategoriseres og visualiseres, noe som ikke er mulig å bruke MS alene. Det er håpet at kunnskapen som oppnås gjennom bruk av fluorescerende antibiotika vil hjelpe til med vår forståelse av resistens, og kampen mot AMR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

Fluorescerende antibiotika er flerbruksforskningsverktøy som lett brukes til studiet av antimikrobiell resistens, på grunn av deres betydelige fordel over andre metoder. For å forberede disse sondene syntetiseres azidederivater av antibiotika, deretter kombinert med alkyne-fluoropforer ved hjelp av azide-alkyne dipolar cycloaddition ved klikkkjemi. Etter rensing testes antibiotikaaktiviteten til fluorescerende antibiotika ved minimum hemmende konsentrasjonsvurdering. For å studere bakteriell akkumulering kan enten spektrofototri eller flytcytometri brukes, noe som gjør det mulig for mye enklere analyse enn metoder som er avhengige av radioaktive antibiotikaderivater. Videre kan konfokal mikroskopi brukes til å undersøke lokalisering i bakteriene, og gir verdifull informasjon om handlingsmåte og endringer som oppstår hos resistente arter. Bruk av fluorescerende antibiotikasonder i studien av antimikrobiell resistens er en kraftig metode med mye potensial for fremtidig ekspansjon.

Figur 1 Illustrerer den viktigste klikkkjemireaksjonen (A) for fremstilling av fluorescerende antibiotika, og med (B) eksempler på strukturer av våre publiserte fluorescerende antibiotika basert på ciprofloxacin (cipro), trimethoprim (TMP) og linezolid. Disse sondene ble alle syntetisert fra tilsvarende antibiotika via en azide mellomliggende. De ble deretter koblet til NBD og DMACA fluorophores, hver funksjonalisert med en alkyne.
Figur 2 viser eksempel LCMS spor fra en ciprofloxacin-N3 og NBD-alkyne klikk reaksjon, hvor aziden eluted på 3,2 min og produktet på 3,8 min. Sammenligne 1 og 2 viser hvordan fremdriften av klikkreaksjonen kan følges av forsvinningen av azide peak (av UV eller MS detektor). Spectra 3 viser virkningen av rensing, med feilaktige topper forsvinner fra MS og UV spor. Både renhet og reaksjonsfremgang kan kvantifiseres ved integrering av produkttoppen og eventuelle urenheter.
Figur 3 viser typiske resultater fra vurderingen av intracellulær akkumulering ved fluorescensspektroskopi i nærvær og fravær av efflux. I dette eksperimentet ble E. coli behandlet med TMP-NBD med eller uten tilsetning av CCCP, som kollapser protonmotivstyrken (PMF). Den intracellulære fluorescensen til bakteriene var signifikant høyere når den ble behandlet med CCCP, noe som indikerer at efflux reduserte akkumuleringen i disse bakteriene. Dette eksperimentet ble gjentatt ved hjelp av bakterier mangelfull i tolC, viser kapasiteten til denne analysen for å undersøke virkningen av individuelle efflux pumpekomponenter. I dette tilfellet, selv om det var en økning i intracellulær fluorescens sammenlignet med villtypebakterier, økte CCCP-akkumuleringen fortsatt. Disse funnene indikerer at tolC deltar iTMP efflux, men er ikke den eneste PMF-drivpumpen involvert.
Figur 4 viser resultatet av det samme eksperimentet som figur 2, men med akkumuleringen målt ved flytcytometri i stedet for spektroskopi. De samme datatrendene ble observert, noe som viste at begge teknikkene kan brukes til å studere fenomenet efflux mediert intracellulær akkumulering.
Figur 5 viser representative konfokale mikroskopibilder av gram-positive (S. aureus) og gram-negative bakterier (E. coli) merket med TMP-NBD (1) og cipro-NBD ( 2+ 3) fluorescerende sonder, henholdsvis. I begge tilfeller ble den røde membranen fm4-64FX lagt til for å sammenligne kolokalisering. For TMP-NBD ble også det brukt blå nukleinsyrefarge Hoechst-33342. Ved å legge over disse bildene ble lokaliseringen av antibiotika i bakteriene visualisert. Sammenligning av paneler 2 og 3 viser hvordan virkningen av efflux ble undersøkt, med efflux-hemmeren CCCP brukt i 2, noe som resulterer i intracellulær akkumulering. I panel 3ble ingen CCCP lagt til. Derfor er efflux aktiv og ingen sondeakkumulering ble sett.
Figur 6 viser representative konfokale mikroskopibilder av Gram-positive (S. aureus) bakterier merket med DMACA-merket oksazolidinon sonde Lz-NBD. Den røde membranen dye FM4-64FX ble lagt til for å sammenligne kolokalisering, og den grønne nukleinsyre dye Hoechst-33342 ble også brukt. Ved å legge over disse bildene ble lokaliseringen av antibiotika i bakteriene visualisert, og viste intern lokalisering forskjellig fra membranen og nukleinsyren.
Tabell 1 viser MIC-verdier for tre serier av fluorescerende antibiotika, ciprofloxacin, trimethoprim (TMP) og linezolid (Lz), med data presentert for de overordnede antibiotika-, NBD- og DMACA-derivatene av hver. Representative arter for hvert antibiotika ble valgt, inkludert både gram-positive og gram-negative. For ciprofloxacin-serien mistet begge fluorescerende sonder antibiotikaaktivitet sammenlignet med moderstoffet, men beholdt noe aktivitet mot alle arter. På samme måte mistet linezolid-sondene noe aktivitet, men forble et moderat til svakt antibiotika. TMP-sondene mistet nesten all aktivitet mot ville bakterier, men var aktive mot efflux mangelfull E. coli, noe som indikerer at tapet av antibakteriell aktivitet skyldtes mangel på akkumulering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> Figur 1: Syntese og strukturer av antibiotika-avledede sonder. (A) Den generelle reaksjonsordningen for syntese av fluorescerende antibiotikasonder fra azideantibiotika og alkyne-fluoropforer. (B) Strukturene til våre publiserte sonder basert på ciprofloxacin, trimethoprim og linezolid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> Figur 2: Måling av antibiotikaavledet sonderenhet ved LCMS. Analytiske LCMS-spor fra (1) ufullstendige, (2) fullstendige, og (3) HPLC renset ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne klikkreaksjoner som viser forsvinningen av startmateriell ved ferdigstillelse av reaksjon, og diverse topper på rensing. A = UV-Vis spor (absorbans på 250 nm), B = MS spor (positiv og negativ modus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> Figur 3: Platelesermåling av antibiotikaavledet sondeakkumulering. Fluorescensspektroskopisk måling av cellulær akkumulering av TMP-NBD (50 μM) i vill type (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkubert (A) med og (B) uten tilsetning av CCCP (100 μM). Statistisk signifikans (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) vises mellom fravær eller tilstedeværelse av CCCP og mellom vill type og ΔtolCE. coli. Rapporterte data er gjennomsnittlig ± SD for tre eksperimenter. Dette tallet er tilpasset fra vår forrige publikasjon15, og illustrerer bruken av spektroskopi for å belyse effluksrollen på intracellulær akkumulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> Figur 4: Flow cytometrimåling av antibiotikaavledet sondeakkumulering. Flow cytometri måling av cellulær akkumulering ved hjelp av TMP-NBD i vill type (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkubert med og uten tilsetning av CCCP (100 μM). Median fluorescensaktivitet er vist fra 10 000 bakterielle hendelser, statistisk signifikans (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) vises mellom fravær og tilstedeværelse av CCCP og mellom vill type og ΔtolCE. coli. Rapporterte data er gjennomsnittlig ± SD for tre eksperimenter. Dette tallet er tilpasset fra vår forrige publikasjon15, og illustrerer bruken av flyt cytometri for å belyse rollen efflux på intracellulær akkumulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> Figur 5: Confocal mikroskopi visualisering av NBD-sonde lokalisering. Konfokal mikroskopi bilder av 1) leve S. aureus merket med Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), TMP-NBD (grønn), FM4-64FX (rød, membran), og overlaid; 2) leve E. coli behandlet med CCCP (efflux hemmer) merket med cipro-NBD (grønn), FM4-64FX (rød, membran), og overlaid; 3) leve E. coli merket med cipro-NBD (grønn), FM4-64FX (rød, membran), og overlaid. Dette tallet er tilpasset fra våre tidligere publikasjoner15,16, og illustrerer bruken av mikroskopi for å undersøke probe lokalisering, inkludert virkningen av efflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> Figur 6: Konfokal mikroskopivisualisering av DMACA-probe lokalisering. Konfokal mikroskopi bilder av levende S. aureus merket med oksazolidinon sonde Lz-DMACA (blå), Sytox grønn (grønn, nukleinsyre) og FM4-64FX (rød, membran). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">MIC (μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Arter</td>
			<td>Belastning</td>
			<td>Cipro</td>
			<td>Cipro-NBD (andre verdenskrig)</td>
			<td>Cipro-DMACA</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD (andre)</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>Linezolid (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Stafylokokker aureus</td>
			<td>ATCC 25923 (Andre)</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Streptococcus pneumoniae</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Enterococcus faecium</td>
			<td>ATCC 35667 (Andre)</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559 ATCC (ANDRE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>ATCC 13883 (Andre)</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>ATCC 27853 (Andre)</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Escherichia coli</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤0,004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>>64</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>Mutant ΔtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Antibiotikaaktiviteter av fluorescerende antibiotikasonder basert på ciprofloxacin, trimetoprim og linezolid mot passende klinisk relevante bakterielle stammer, målt ved kjøttkraft mikrodilution MIC analyser. I de fleste tilfeller mistet sondene noe aktivitet i forhold til det overordnede stoffet, men beholdt noen målbar antibiotikastyrke (tilstrekkelig til å være nyttig i videre studier).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescerende merkede antibiotika er kraftige verktøy som kan brukes til å studere flere aspekter av antimikrobiell resistens. Denne artikkelen beskriver utarbeidelsen av fluorescerende merket antibiotika og deres anvendelse for å studere antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan brukes til å studere mekanismer for bakteriell resistens (f.eks. efflux) ved spektrofotometri, flytcytometri og mikroskopi.

Visualisering av bakteriell resistens ved hjelp av fluorescerende antibiotikasonder

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Fremstillingen av fluorescerende antibiotika muliggjør vurdering av lokalisering av disse terapeutiske reagensene i bakterier gjennom praktiske analytiske teknikker som spektrometri og mikroskopi. Den største fordelen med denne teknikken er hvor enkelt antibiotika lokalisering kan bestemmes. Denne lokaliseringen er relevant for en rekke fenomener, inkludert effluks.For å utføre klikket En reaksjonsprosedyre, plasser azideantibiotikumet av interesse i en rund bunnkolbe og tilsett 25 milliliter tert-butanol og 25 milliliter vann per millimol azid til kolben. Tilsett den tilberedte fluorophore alkyne til løsningen og varme reaksjonen til 50 grader Celsius. Deretter legger du til 0,6 ekvivalenter kobbersulfat og 2,4 ekvivalenter askorbinsyre til kolben.Rør reaksjonen i en time eller til analyse av LCMS indikerer reaksjonsfullføring. Deretter avkjøles og renser reaksjonen som passer for antibiotikastillaset. Her vises nøkkelnøkkelklikkmireaksjonen for fremstilling av fluorescerende antibiotika med eksempler på strukturen syntetisert fra tilsvarende antibiotika via et arid-mellomliggende basert på ciprofloxacin, linezolid og trimetoprim.I disse flytende kromatografi massespektrometri spor fra en korprofloxacin azide og en NBD alkyne klikk reaksjon, azide ble eluted på 3,2 minutter og produktet ble eluted på 3,8 minutter. Fremdriften av klikkreaksjonen kan etterfølges av forsvinningen av azidetoppen. I disse spektraene kan virkningen av rensingen visualiseres med feilaktige topper som forsvinner.For å vurdere den antimikrobielle aktiviteten til det syntetiserte antibiotika, strek glyserol bestander av bakterielle stammer som passer for antibiotika stillas på LB agar plater og vokse kulturer over natten på 37 grader Celsius. Neste morgen, plukke en enkelt koloni fra hver tallerken og kultur koloniene over natten i fem milliliter CAMHB per kultur på 37 grader Celsius. Neste dag fortynner kulturene ca. 40 ganger i fersk CAMHB og vokser bakteriene til midt i loggfasen med en optisk tetthet på 600 nanometer mellom 0,4 og 0,8.Deretter forberede lagerløsninger av hver fluorescerende antibiotika på 1,28 milligram per milliliter i 20% dimetylsulfoksid i sterilt vann og tilsett 10 mikroliter antibiotika til hver brønn av den første kolonnen av en 96-brønns plate. Legg til 90 mikroliter CAMHB i hver brønn av den første kolonnen og 50 mikroliter til alle de andre brønnene. Utfør deretter en seriell todobling over platen.Etter grundig blanding, fortynne mid log fase kulturer til omtrent en ganger 10 til den sjette kolonien forming enheter per milliliter og legge til 50 mikroliter av hver kultur til fortynning brønner for å oppnå en endelig konsentrasjon på ca fem ganger 10 til den femte kolonien forming enheter per milliliter. Når alle bakteriene er belagt, legg lokk på platene og inkuber kulturene i 18 til 24 timer ved 37 grader Celsius uten å riste. Neste dag, visuelt inspisere platene.Minimumshemmingskonsentrasjonen vil være den laveste konsentrasjonen godt uten synlig vekst. For sondeakkumuleringsanalyse, strek glyserol bestander av bakterielle stammer på LB agar plater for en overnatting inkubasjon ved 37 grader Celsius. Neste morgen, plukke en enkelt koloni fra platen for overnatting kultur i lysogeny kjøttkraft på 37 grader Celsius.Neste morgen, fortynne natten kultur ca 50 ganger i friskt medium. Når kulturen når midt i loggfasen, pellet bakteriene ved sentrifugering og dekanterer mediet. Resuspend bakteriene i en milliliter PBS og sentrifuge bakteriene igjen.Dekanter den overnaturlige og resuspend vasket pellet i PBS til en optisk tetthet på 600 nanometer av to. Tilsett 10,1 mikroliter på 10 millimolar CCCP i PBS til en milliliter bakterier og inkuber bakteriene ved 37 grader Celsius i 10 minutter. På slutten av inkubasjonen, samle bakteriene ved sentrifugering og resuspend pellet i en milliliter på 10 til 100 mikromolar fluorescerende antibiotika løsning i PBS.Etter en 30 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius, vask cellene ved sentrifugering fire ganger i en milliliter kald PBS per vask. Etter vasken lyser bakteriene med 180 mikroliter lysisbuffer og 70 mikroliter lysozym. Etter 30 minutter ved 37 grader Celsius, fryse-tine bakteriene tre ganger på minus 78 grader Celsius i fem minutter og 34 grader Celsius i 15 minutter henholdsvis.Etter den siste runden med fryse-tining, sonicate prøven i 20 minutter etterfulgt av en 30 minutters inkubasjon ved 65 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen samler du den lysede prøven ved sentrifugering og siler rørinnholdet gjennom en 10 kilodaltonfiltermembran. Vask filteret fire ganger med 100 mikroliter vann per vask og skyll hver vask i individuelle brønner av en svart flat bunn 96-brønnsplate.Mål deretter fluorescensintensiteten på en plateleser med eksitasjon og utslippsbølgelengder som passer til fluoroforen. Disse typiske resultatene fra vurderingen av intracellulær akkumulering ved fluorescensspektroskopi i nærvær og fravær av effluks viser at den intracellulære fluorescensen av bakteriene er betydelig høyere etter forbehandling med CCCP som indikerer at efflux reduserer akkumuleringen i bakteriene. I disse representative konfokale mikroskopibildene av Gram positive og Gram negative bakterier, kan lokaliseringen av antibiotika i bakteriene visualiseres etter CCCP-behandling.Dette fenomenet observeres ikke når ingen CCCP legges til. Når du bruker fluorescerende antibiotika, vær oppmerksom på hvilken informasjon du tar sikte på å samle inn, og sørg for å vurdere hvilken protokoll som vil være mest nyttig når du får disse dataene. Etter syntesen kan fluorescerende antibiotika brukes til å studere en rekke bakterielle prosesser, inkludert legemiddelmålsinteraksjoner og resistensmodifikasjoner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Scheme for bakteriell deteksjon av patogen og resistensutvikling Testing fra blodkulturer

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid Screening av HIV revers transkriptase og integrasehemmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Utarbeidelse av en blodkultur Pellet for Rapid Bakteriell Identifisering og antibiotika resistenstesting

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser for å studere rollen til Vitronectin i bakteriell vedheft og Serum motstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering av IL-22-uttrykke lymfocytter Bruke Reporter Mus

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering av Candida albicans i murine mage-tarmkanalen ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotika Dereplication bruke antibiotikaresistens plattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Etablere en svin Ex Vivo Cornea modell for å studere narkotika behandlinger mot bakteriell keratitt

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...