Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

MRLS stöds av australian GraduateGraduate Award (APA) och ett Institut för molekylär biovetenskap Research Advancement Award. Wanida Phetsang stöddes av UQ International Scholarship (UQI) och IMB GraduateGraduate Award (IMBPA). MAC är en NHMRC princip forskarassistent (APP1059354) och har också en fraktionerad professorsforskar stipendiat utnämning vid University of Queensland, med sin återstående tid som VD för Inflazome Ltd, ett företag som utvecklar läkemedel för att ta itu med kliniska otillfredsställda behov i inflammatorisk sjukdom. MATB stöds delvis av Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z och NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi utfördes vid Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som inrättades med stöd av ACRF.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

Författarna har inget att deklarera.

Skapandet av en framgångsrik fluorescerande antibiotikasond måste börja med noggrann planering och behandling av SAR av moderbolaget drogen. Om sar inte är känt eller helt utforskat kan flera alternativ behöva testas för att hitta en plats som kan ändras selektivt utan att den biologiska aktiviteten avskaffas. När en plats/s har identifierats är installationen av en linker moiety ofta nödvändig för att ge trappavstånd mellan det biologiska verkningsstället och den inaktiva fluorofforten. Man måste vara noga med att den reaktion som används för att fästa länkern på antibiotikan lämnar en biostabil funktionell grupp, och undviker till exempel estester som är mottagliga för klyvning av esteras in vivo. Beroende på antibiotikans farmakodynamiska och farmakokinetiska profil kan en enkel alkyllänkare användas, annars bör ett mindre lipofiliskt alternativ som en polyetenglykol (PEG) övervägas. Med länkaren bifogad, den antibakteriella aktiviteten bör bedömas för att säkerställa att MIC mot relevanta bakterier liknar modersubstansen.
I detta arbete rekommenderar vi användning av Huigsen azide-alkyne [3 +2] dipolär cycloaddition (klicka kemi, se figur 1)för att bli sänd fluoroffor till antibiotika, av flera skäl. Klickreaktioner är mycket selektiva, vilket innebär att skydd av reaktiva grupper på antibiotika inte är nödvändigt, och vidare lämnar reaktionen en stabil, biokompatibel triazolmoiety. Azidkomponenten introduceras till antibiotikumdelen i våra ingrepp, eftersom detta i allmänhet är lättare att åstadkomma med en mängd olika strukturella typer än införandet av en alkyne. Syntheses av två alkyne-härledda fluorofforer beskrivs här, även om andra kan utforskas om så önskas. NBD och DMACA valdes på grund av sin ringa storlek, vilket minimerar möjligheten att störa cellpenetration och målinteraktion. Klickreaktionen i sig utförs med kopparkatalys, där antingen Cu2+ (CuSO4, med ett askorbinsyrareducerande medel) eller Cu+ (CuI) kan användas som startreagens. Efter rening(figur 2)bör de minst utvecklade länderna testas som med aziden. Även med noggrann hänsyn till fluorofforval och fastsättningsställe är det möjligt att dålig antibiotikaaktivitet kommer att observeras. Detta innebär dock inte att en inaktiv sond är utan användning. Som visas med TMP sonder, föreningar med dålig antibakteriell aktivitet kan fortfarande binda till samma mål som förälder narkotikamissbruk. Detta kan möjliggöra studier om verkningssätt och undersökning av fenomen som leder till resistens, såsom efflux.
Som beskrivs i protokollavsnittet är det möjligt att analysera bakteriell märkning av fluorescerande antibiotika med antingen en enkel spektrofotometrianalys (figur 3) eller flödescytometri (figur 4). Båda metoderna kan kvantifiera cellulär ackumulering, och genom lysning celler och undersöka fluorescens lokalisering i lysate, är det möjligt att bedöma intracellulär ackumulering. I detta protokoll beskrivs användningen av lysozyme för celllys, eftersom detta är en snabb, universell teknik. Andra lysis villkor, såsom övernattning behandling med glycine-HCl7, har också framgångsrikt använts. Med hjälp av denna teknik är det möjligt att studera effekten av efflux på antibiotikacellulär ackumulering, vilket är en viktig resistensmekanism. Om efflux verkligen finns i bakterierna, en brist på intracellulära ackumulering kommer att observeras, även om detta kan räddas med hjälp av en efflux hämmare som CCCP.
Mikroskopi kan också utföras för att visuellt inspektera sondlokalisering i olika bakterier, samla information om verkningssätt, och eventuellt också motstånd (se figur 5 för representativa exempel). För att se lokalisering inom bakterier krävs ett högupplöstkonfokalmikroskop, utrustat med funktioner som SIM (strukturerad belysningsmikroskop), SR-SIM (superresolution-SIM), Luftyscan eller STED (stimulerad utarmning av utsläpp). Dessutom bör högpresterande följeskydd användas, och analys efter avbildning som utförs på en lämplig programvara (t.ex. FIJI, Zen eller Imaris). Lokalisering av sonder jämförs med färgämnen som färgar specifika arkitekturer, såsom Hoechst-33342 (blå, nukleinsyra), Syto-9 (grön, nukleinsyra) och FM4-64FX (röd, membran). Valet av färgämnen bör göras för att matcha fluorescerande antibiotika, så att varje färg som används har minimal spektral överlappning. För att få bästa möjliga bilder kan optimering krävas. Till exempel, om bakterier är för trångt på bilden, ta bara del av den suspenderade pelleten, späd sedan med mer montering medium. Däremot, om bakterier är för glesa på bilden, helt enkelt börja med fler bakterier. I detta protokoll rekommenderas användning av en termoreversibel gel som är kompatibel med levande celler (t.ex. Cygel) för levande cellavbildning, eftersom den immobiliserar bakterier (inklusive rörliga bakterier), men andra monteringsmedier eller agarose har också använts framgångsrikt.
Sammantaget, trots utmaningar som kan ställas inför vid utarbetandet av en biologiskt aktiv fluorescerande antibiotikaderivat, enkelheten i deras användning och deras mångsidighet gör dessa sonder attraktiva verktyg för forskning inom AMR. Framtida arbete med fluorescerande antibiotika har potential att ge insikt i mekanismer för antibiotikaresistens, förbättra vår förståelse för hur nuvarande antibiotika fungerar och bidra till utvecklingen av bättre läkemedel.

Antimikrobiell resistens (AMR) är en stigande kris som utgör ett stort hot mot människors hälsa runt om i världen. Resistens mot de flesta antibiotika har rapporterats, och infektioner orsakade av bakterier som är resistenta mot alla kliniskt tillgängliga läkemedel växer fram. För att bekämpa uppkomsten av amr måste vi öka vår förståelse av detta mångfacetterade fenomen och de underliggande mekanismerna och interaktionerna mellan antibiotika och bakterier. En aspekt som historiskt dåligt har förstått är permeationen av antibiotika till bakterier, tillsammans med fenomenen av ackumulering och efflux. Denna kunskap är avgörande för att utforma nya läkemedel och förståelse mekanismer för resistens. Detta spelar därför en avgörande roll i AMR-forskningen.
Det finns två huvudsakliga metoder som kan vidtas för att mäta antibiotikakoncentration: mätning av läkemedlet direkt eller märkning med en moiety som syftar till att underlätta kvantifiering. Även om märkning av antibiotika förbättrar upptäckt, kan detta störa den biologiska aktiviteten hos läkemedlet, såsom antimikrobiell aktivitet och permeabilitet. Detta är inte ett problem för otaggade metoder; detektion kan dock vara utmanande. Under de senaste åren har tekniska framsteg lett till en boom i forskning som använder massa pektrometri (MS) för att direkt mäta antibiotikakoncentrationen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Dessa studier har visat att det är möjligt att studera intracellulär ackumulering i en mängd olika bakterier, med gramnegativa bakterier som de mest studerade. Kvantifiering av molekylpermeabilitet har sedan kopplats till aktivitet och används för att informera läkemedelsutveckling2,3,4, men försiktighet måste iakttas när direkt sammanfallande ackumulering och målaktivitet5. Före ms utveckling, den enda antibiotika vars koncentration kunde mätas direkt var de som har inneboende fluorescens, såsom tetracyklin och kinoloner8,9,10,11. Även om det uppenbarligen begränsades i omfattning undersöktes och kvantifierades ackumulering och kvantifierades, vilket illustrerar nyttan av fluorescensbaserad kvantifiering.
Taggade antibiotika har använts i många decennier för att studera distributioner, handlingssätt och resistens, med radioaktiva och fluorescerande taggar är vanligt. Radiotaggade sonder har fördelen av att vara nästan identiska med den överordnade föreningen, därav den biologiska aktiviteten är osannolikt att vara betydligt annorlunda. Isotoper som 3H, 14C och 15N har ofta använts på grund av framträdandet av dessa element i antibiotika, och en mängd olika antibiotika byggnadsställningar har undersökts1,10,12,13. Även om detektion av radiosonder är enkel, finns det ett antal logistiska problem (t.ex. säkerhet, isotop halveringstid) som har begränsat användningen av detta tillvägagångssätt. En annan strategi är fluorescerande taggade antibiotika. Dessa sonder kan användas för att undersöka spridning och handlingssätt och resistens hos det överordnade läkemedlet, med hjälp av enklare teknik än MS och utan logistiska problem med strålning8. Den största nackdelen med detta tillvägagångssätt är att antibiotika är i allmänhet relativt små molekyler, därav införandet av en fluorescerande moiety utgör en betydande kemisk förändring. Denna förändring kan påverka fysiokemiska egenskaper och antibakteriell aktivitet. Därför måste man se till att bedöma dessa faktorer för att generera resultat som är representativa för moderantibiotikan.
I detta arbete beskrivs en metod för att syntetisera, bedöma och använda fluorescerande antibiotika, som i våra tidigare publikationer14,15,16. Genom tidigare arbete har ett antal fluorescerande antibiotika förberetts och använts för en mängd olika ändamål (se Sten m.fl.8). För att minimera sannolikheten för att påverka biologisk aktivitet används mycket små fluorofforer i detta arbete: nitrobenzoxadiazole (NBD, grön)och 7-(dimetylamino)-2-oxo-2 H-krom-4-yl (DMACA, blå). Vidare beskrivs bedömningen av antibakteriell aktivitet med hjälp av den lägsta mikrobrotsutspädningskoncentrationen (MIC), så att effekten av ändringar på aktiviteten kan mätas. Dessa fluorescerande taggade sonder kan användas i spektrofotometriska analyser, flödecytometri och mikroskopi. Utbudet av möjliga tillämpningar är där fördelen med fluorescerande antibiotika ligger. Cellulär ackumulering kan kvantifieras, kategoriseras och visualiseras, något som inte är möjligt med hjälp av MS ensam. Förhoppningen är att den kunskap som erhållits genom användning av fluorescerande antibiotika kommer att bidra till vår förståelse av resistens, och kampen mot AMR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

Fluorescerande antibiotika är mångsidiga forskningsverktyg som lätt används för studier av antimikrobiell resistens, på grund av deras betydande fördel jämfört med andra metoder. För att förbereda dessa sonder syntetiseras azidderivat av antibiotika, sedan tillsammans med alkyne-fluorofforer med azidalkyne dipolär cykloaddition genom klickkemi. Efter rening testas fluorescerande antibiotikas antibiotikas antibiotikas antibiotiska aktivitet genom minsta analys av hämmande koncentration. För att studera bakteriell ackumulering kan antingen spektrofotometri eller flödescytometri användas, vilket möjliggör mycket enklare analys än metoder som förlitar sig på radioaktiva antibiotikaderivat. Dessutom kan konfokal mikroskopi användas för att undersöka lokalisering inom bakterierna, vilket ger värdefull information om verkningssätt och förändringar som sker i resistenta arter. Användningen av fluorescerande antibiotikasonder i studien av antimikrobiell resistens är en kraftfull metod med stor potential för framtida expansion.

Bild 1 Illustrerar nyckeln klicka kemi reaktion (A) för beredning av fluorescerande antibiotika, och med (B) exempel på strukturer av våra publicerade fluorescerande antibiotika baserade på ciprofloxacin (cipro), trimethoprim (TMP), och linezolid. Dessa sonder var alla syntetiserade från motsvarande antibiotika via en azid mellanliggande. De kopplades sedan till NBD och DMACA fluorofforer, varje functionalized med en alkyne.
Figur 2 visar exempel LCMS spår från en ciprofloxacin-N3 och NBD-alkyne klick reaktion, där aziden eluted på 3,2 min och produkten på 3,8 min. Jämföra 1 och 2 visar hur utvecklingen av klickreaktionen kan följas av försvinnandet av azid topp (av UV eller MS detektor). Spectra 3 visar effekten av rening, med felaktiga toppar försvinner från MS och UV spår. Både renhet och reaktionsframsteg skulle kunna kvantifieras genom integreringen av produkttoppen och eventuella föroreningartoppar.
Figur 3 visar typiska resultat från bedömningen av intracellulär ackumulering genom fluorescensspektroskopi i närvaro och avsaknad av efflux. I detta experiment behandlades E. coli med TMP-NBD med eller utan tillsats av CCCP, som kollapsar protonmotivet kraft (PMF). Bakteriens intracellulära fluorescens var betydligt högre när den förbehandlades med CCCP, vilket indikerar att efflux minskade ackumulering en hos dessa bakterier. Detta experiment upprepades med hjälp av bakterier som inte hade brist på tolC, vilket visar kapaciteten hos denna analys för att undersöka effekterna av enskilda efflux pumpkomponenter. I detta fall, även om det fanns en ökning av intracellulär fluorescens jämfört med vilda typer bakterier, CCCP ackumulering ökade fortfarande. Dessa resultat tyder på att tolC deltar iTMP efflux men är inte den enda PMF-enhet pump inblandade.
Bild 4 visar resultatet av samma experiment som figur 2, men med ackumulering mätt med flödecytometri istället för spektroskopi. Samma datatrender observerades, vilket visar att antingen teknik kan användas för att studera fenomenet efflux medierad intracellulär ackumulering.
Figur 5 visar representativa konfokalmikroskopi bilder av grampositiva(S. aureus)och gramnegativa bakterier (E. coli) märkta med TMP-NBD (1) och cipro-NBD (2 + 3) lysrör sonder, respektive. I båda fallen lades det röda membranet färgning FM4-64FX till för att jämföra samlokalisering. För TMP-NBD användes även det blå nukleinsyrafärgen Hoechst-33342. Genom att överlagra dessa bilder visualiserades lokaliseringen av antibiotikan i bakterierna. Jämföra paneler 2 och 3 visar hur effekten av efflux undersöktes, med efflux hämmare CCCP används i 2, vilket resulterar i intracellulär ackumulering. I panel 3lades ingen CCCP till. Efflux är därför aktiv och ingen sondackumulering sågs.
Figur 6 visar representativa konfokala mikroskopibilder av Grampositiva(S. aureus)bakterier märkta med DMACA-märkta oxazolidinon sond Lz-NBD. Det röda membranet färgämne FM4-64FX lades till för att jämföra samlokalisering, och den gröna nukleinsyrafärgämnet Hoechst-33342 användes också. Genom att överlagra dessa bilder visualiserades lokaliseringen av antibiotika nantibiotiker, vilket visar inre lokalisering skiljer sig från membranet och nukleinsyra.
Tabell 1 visar MIC-värden för tre serier av fluorescerande antibiotika, ciprofloxacin, trimetoprim (TMP) och linezolid (Lz), med data som presenteras för moderantibiotika, NBD och DMACA derivat av varje. Representativa arter för varje antibiotikum valdes ut, inklusive både grampositiva och gramnegativa. För ciprofloxacin-serien förlorade båda fluorescerande sonder antibiotikaaktivitet jämfört med moderläkemedlet, men behöll viss aktivitet mot alla arter. På samma sätt förlorade linezolid sonder en del aktivitet, men förblev en måttlig till svag antibiotika. TMP sonder förlorade nästan all aktivitet mot vilda bakterier typ, men var aktiva mot efflux bristfällig E. coli, vilket tyder på att förlusten av antibakteriell aktivitet berodde på brist på ackumulering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> Figur 1: Syntes och strukturer av antibiotika-härledda sonder. A)Det allmänna reaktionsschemat för syntes av fluorescerande antibiotikasonder från azid-antibiotika och alkyne-fluorofforer. (B)Strukturerna i våra publicerade sonder baserade på ciprofloxacin, trimetoprim och linezolid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> Figur 2: Mätning av biotikuresistens av LCMS. Analytiska LCMS spår från (1) ofullständig, (2) komplett, och (3) HPLC renas ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne klicka reaktioner som visar försvinnandet av startmaterial vid reaktion slutförande, och diverse toppar på rening. A = UV-Vis-spår (absorbans vid 250 nm), B = MS-spårning (positivt och negativt läge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> Figur 3: Mätning av mätning av antibiotikahärdade sondackumulering. Fluorescensspektroscopic mätning av cellulär ackumulering av TMP-NBD (50 μM) i vild typ (1, ATCC 25922) och ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli ruvade(A) med och (B) utan tillsats av CCCP (100 μM). Statistisk signifikans (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) visas mellan frånvaro eller förekomst av CCCP och mellan vild typ och ΔtolCE. coli. Data som rapporteras är medelvärdet ± SD för tre experiment. Denna siffra är anpassad från vår tidigare publikation15, och illustrerar användningen av spektroskopi för att belysa efflux roll på intracellulära ackumulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> Figur 4: Flödecytometrimätning av antibiotikahärledd sondackumulering. Flödescytometrimätning av cellulär ackumulering med TMP-NBD i vild typ (1, ATCC 25922) och ΔtolC (2, ATCC 25922) E. samruvad med och utan tillsats av CCCP (100 μM). Medianfluorescensaktivitet visas från 10 000 bakteriella händelser, Statistisk signifikans (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) visas mellan frånvaro och förekomst av CCCP och mellan vild typ och ΔtolCE. coli. Data som rapporteras är medelvärdet ± SD för tre experiment. Denna siffra är anpassad från vår tidigare publikation15, och illustrerar användningen av flöde cytometri för att klargöra efflux roll på intracellulära ackumulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> Bild 5: Konfokal mikroskopivisualisering av lokalisering av NBD-sond. Konfokalmikroskopi bilder av 1) levande S. aureus märkta med Hoechst-33342 (blå, nukleinsyra), TMP-NBD (grön), FM4-64FX (röd, membran) och överlagrad; 2) levande E. coli behandlas med CCCP (efflux hämmare) märkt med cipro-NBD (grön), FM4-64FX (röd, membran) och överlagrad; 3) bo E. coli märkt med cipro-NBD (grön), FM4-64FX (röd, membran) och överlagrad. Denna siffra är anpassad från våra tidigare publikationer15,16,och illustrerar användningen av mikroskopi för att undersöka sondlokalisering, inklusive effekterna av efflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> Bild 6: Confocal mikroskopi visualisering av DMACA-sond lokalisering. Konfokalmikroskopi bilder av levande S. aureus märkta med oxazolidinone sond Lz-DMACA (blå), Sytox grön (grön, nukleinsyra), och FM4-64FX (röd, membran). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">MIC (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Arter</td>
			<td>Stam</td>
			<td>Cipro</td>
			<td>Cipro-NBD</td>
			<td>Cipro-DMACA</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>Linezolid (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Streptokocker pneumoniae</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Enterococcus faecium</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Escherichia coli</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤0,004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>>64</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>Mutant ΔtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Antibiotikaverksamhet av fluorescerande antibiotikasonder baserade på ciprofloxacin, trimetoprim och linezolid mot lämpliga kliniskt relevanta bakteriestammar, mätt med buljong mikroutspädning MIC analyser. I de flesta fall förlorade sonderna viss aktivitet jämfört med moderläkemedlet, men behöll en del mätbar antibiotikastyrka (tillräckligt för att vara användbara i ytterligare studier).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescerande märkta antibiotika är kraftfulla verktyg som kan användas för att studera flera aspekter av antimikrobiell resistens. Denna artikel beskriver beredningen av fluorescerande taggade antibiotika och deras tillämpning på att studera antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan användas för att studera mekanismer för bakteriell resistens (t.ex. efflux) genom spektrophotometri, flödescytometri och mikroskopi.

Visualisering av bakteriell resistens med fluorescerande antibiotikasonder

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Beredningen av fluorescerande antibiotika möjliggör bedömning av lokaliseringen av dessa terapeutiska reagenser inom bakterier genom bekväma analystekniker som spektrofotometri och mikroskopi. Den största fördelen med denna teknik är den lätthet med vilken den antibiotiska lokaliseringen kan bestämmas. Denna lokalisering är relevant för ett antal fenomen inklusive efflux.För att utföra klicket A-reaktionsproceduren, placera azidantibioten av intresse i en rund bottenkolv och tillsätt 25 milliliter tert-butanol och 25 milliliter vatten per millimol av azid till kolven. Tillsätt den förberedda fluorophore alkyne till lösningen och värm reaktionen till 50 grader Celsius. Tillsätt därefter 0,6 ekvivalenter kopparsulfat och 2,4 ekvivalenter askorbinsyra till kolven.Rör om reaktionen i en timme eller tills analys från LCMS indikerar reaktionskomplettering. Kyl sedan och rena reaktionen på lämpligt sätt för antibiotikumställningen. Här, nyckeln nyckeln klicka kemi reaktion för beredning av fluorescerande antibiotika med exempel på strukturen syntetiseras från motsvarande antibiotika via en azide mellanliggande baserat på ciprofloxacin, linezolid, och trimetoprim visas.I dessa flytande kromatografi masspektrometri spår från en ciprofloxacin azide och en NBD alkyne klickreaktion, azide eluted på 3,2 minuter och produkten eluted på 3,8 minuter. Framsteget för klickreaktionen kan följas av försvinnandet av azidetoppen. I dessa spektra kan effekten av reningen visualiseras med felaktiga toppar försvinner.För att bedöma den antimikrobiella aktiviteten hos det syntetiserade antibiotikumet, strimma glycerol lager av bakteriestammar lämpliga för antibiotika byggnadsställning på LB agar plattor och odla kulturer över natten på 37 grader Celsius. Nästa morgon, plocka en enda koloni från varje platta och kultur kolonierna över natten i fem milliliter CAMHB per kultur vid 37 grader Celsius. Nästa dag, späda ut kulturerna ungefär 40-faldig i färsk CAMHB och odla bakterierna till mitten av log fas med en optisk densitet vid 600 nanometer mellan 0,4 och 0,8.Därefter förbereda lager lösningar av varje fluorescerande antibiotikum på 1.28 milligram per milliliter i 20%dimetylsulfoxid i sterilt vatten och tillsätt 10 mikroliter av antibiotika till varje brunn av den första kolumnen i en 96-brunnsplatta. Lägg till 90 mikroliter av CAMHB till varje brunn i den första kolumnen och 50 mikroliter till alla de andra brunnarna. Utför sedan en seriell tvåfaldig utspädning över plattan.Efter noggrant blandning, späd mitten log faskulturer till ungefär en gånger 10 till den sjätte kolonin bildar enheter per milliliter och tillsätt 50 mikroliter av varje kultur till utspädning brunnarna för att få en slutlig koncentration av cirka fem gånger 10 till den femte kolonin bildar enheter per milliliter. När alla bakterier har pläterat, placera lock på plattorna och inkubera kulturerna i 18 till 24 timmar vid 37 grader Celsius utan att skaka. Nästa dag, visuellt inspektera plattorna.Den minsta inhibitionskoncentrationen kommer att vara den lägsta koncentrations väl med ingen synlig tillväxt. För sond ackumulering analys, strimma glycerol lager av bakteriestammar på LB agar plattor för en övernattning inkubation vid 37 grader Celsius. Nästa morgon, plocka en enda koloni från plattan för övernattning kultur i lysogeny buljong vid 37 grader Celsius.Nästa morgon, späd natten kultur cirka 50-faldig i färskt medium. När kulturen når mitten av logfasen pelleterar bakterierna genom centrifugering och dekanterar mediet. Resuspend bakterierna i en milliliter av PBS och centrifug bakterierna igen.Dekantera supernatanten och resuspend den tvättade pelleten i PBS till en optisk densitet vid 600 nanometer av två. Tillsätt 10,1 mikroliter på 10 millimolar CCCP i PBS till en milliliter bakterier och inkubera bakterierna vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Vid slutet av inkubationen, samla bakterierna genom centrifugeringen och resuspend pelleten i en milliliter av 10 till 100 mikromolär fluorescerande antibiotikalösning i PBS.Efter en 30 minuters inkubation vid 37 grader Celsius, tvätta cellerna genom centrifugation fyra gånger i en milliliter kall PBS per tvätt. Efter tvätten, lysa bakterierna med 180 mikroliter av lysbuffert och 70 mikroliter av lysozym. Efter 30 minuter vid 37 grader Celsius, frysa-tina bakterierna tre gånger vid minus 78 grader Celsius i fem minuter och 34 grader Celsius i 15 minuter respektive.Efter den sista omgången av frys-upptining, sonicate provet i 20 minuter följt av en 30 minuters inkubation vid 65 grader Celsius. I slutet av inkubationen, samla det lystna provet genom centrifugering och sila rörinnehållet genom ett 10 kilodaltons filtermembran. Tvätta filtret fyra gånger med 100 mikroliter vatten per tvätt och alikvot varje tvätt i enskilda brunnar av en svart platt botten 96-brunnsplatta.Mät sedan fluorescensintensiteten på en plattläsare med excitation och emissionsvåglängder som är lämpliga för fluorofoforen. Dessa typiska resultat från bedömningen av intracellulär ackumulering genom fluorescensspektroskopi i närvaro och frånvaro av efflux visar att bakteriernas intracellulära fluorescens är betydligt högre efter förbehandling med CCCP som tyder på att efflux minskar ackumuleringen inom bakterierna. I dessa representativa confocal microscopy avbildar av Grampositiv och Gram negationbakterier, localizationen av antibiotikummet inom bakterierna kan visualiseras efter CCCP-behandling.Detta fenomen observeras inte när ingen CCCP läggs till. När du använder fluorescerande antibiotika, vara uppmärksam på vilken information du syftar till att samla in och se till att överväga vilket protokoll kommer att vara mest användbart när du får dessa data. Efter deras syntes, fluorescerande antibiotika kan användas för att studera ett antal bakteriella processer inklusive läkemedelsmålet interaktioner och resistens modifieringar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Program för bakteriell patogen Detection och provning av antimikrobiell resistens från blododlingar

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snabb Screening av hiv omvänt transkriptas och Grashämmare

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser för studerar roll för Aktiebolaget Trav &amp; galopp i bakteriell vidhäftning och Serum motstånd

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering av IL-22-uttryckande lymfocyter med hjälp av Reporter Möss

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering av Candida albicans i murin mag-tarmkanalen med fluorescerande in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotikum Dereplication med hjälp av antibiotikaresistens plattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Etablera en Porcine Ex Vivo Cornea-modell för att studera läkemedelsbehandlingar mot bakteriell keratit

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...