Name: visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes
Uploaded: 2020-03-02T13:00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

MRLS, Avustralya Lisansüstü Ödülü (APA) ve Moleküler Biyobilimler Araştırma Geliştirme Ödülü enstitüsü tarafından desteklenir. Wanida Phetsang UQ Uluslararası Burs (UQI) ve IMB Lisansüstü Ödülü (IMBPA) tarafından desteklendi. MAC bir NHMRC ilke araştırma görevlisi (APP1059354) ve aynı zamanda Queensland Üniversitesi'nde bir kesirli profesör araştırma görevlisi atama tutar, Inflazome Ltd CEO'su olarak kalan zamanı ile, inflamatuar hastalık klinik karşılanmamış ihtiyaçlarını gidermek için ilaç geliştiren bir şirket. MATB kısmen Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z ve NHMRC Development grant APP11113719 tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi, ACRF'nin desteğiyle kurulan Avustralya Kanser Araştırma Vakfı 'nda (ACRF)/Moleküler Biyobilim Kanser Biyolojisi Görüntüleme Tesisi'nde gerçekleştirildi.

<ol>
	<li>Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+liquid+chromatography/mass+spectrometry-based+drug+accumulation+assay+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa.</a> Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).</li><li>Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+based+assay+to+measure+intracellular+compound+levels+in+Mycobacterium+smegmatis:+Linking+compound+levels+to+cellular+potency.">LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency.</a> Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).</li><li>Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Platform+for+Systematic+Quantitative+Evaluation+of+Small-Molecule+Permeability+in+Bacteria.">General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).</li><li>Richter, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+compound+accumulation+rules+yield+a+broad-spectrum+antibiotic.">Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic.</a> Nature. 545, 299 (2017).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+LC-MS/MS+To+Measure+Accumulation+of+Compounds+within+Bacteria.">Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).</li><li>Prochnow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Quantification+of+Uptake+in+Gram-Negative+Bacteria.">Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).</li><li>Dumont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+efflux:+combined+spectrofluorimetry+and+mass+spectrometry+to+evaluate+the+involvement+of+concentration+and+efflux+activity+in+antibiotic+intracellular+accumulation.">Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).</li><li>Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Antibiotics:+New+Research+Tools+to+Fight+Antibiotic+Resistance.">Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance.</a> Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).</li><li>Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+10+fluoroquinolones+by+wild-type+or+efflux+mutant+Streptococcus+pneumoniae.">Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).</li><li>Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+used+for+measuring+the+accumulation+of+quinolones+by+enterobacteriaceae,+pseudomonas+aeruginosa+and+staphylococcus+aureus.">A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).</li><li>Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+N-substituted+erythromycylamines+to+ribosomes.">Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).</li><li>Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+affecting+chloramphenicol+uptake+by+bacteria+Their+effect+on+amino+acid+incorporation+in+a+cell-free+system.">Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+azido-oxazolidinone+antibiotic+for+live+bacterial+cell+imaging+and+generation+of+antibiotic+variants.">An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).</li><li>Phetsang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+trimethoprim+conjugate+probes+to+assess+drug+accumulation+in+wild+type+and+mutant+Escherichia+coli.">Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli.</a> ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).</li><li>Stone, M. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone-derived+fluorescent+probes+for+studies+of+bacterial+penetration+and+efflux.">Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux.</a> MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).</li></ol>

Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.

Başarılı bir floresan antibiyotik probu oluşturulması dikkatli planlama ve ana ilacın SAR dikkate ile başlamalıdır. SAR bilinmiyorsa veya tam olarak keşfediliyorsa, biyolojik aktivite ortadan kaldırılmadan seçici olarak değiştirilebilecek bir site bulmak için çeşitli seçeneklerin test edilmesi gerekebilir. Bir site/s tespit edildikten sonra, biyolojik etki alanı ile inaktif florofor arasında sterik boşluk sağlamak için bir bağlantı moiety kurulumu genellikle gereklidir. Dikkat, ötücük lere bağlayıcıyı takmak için kullanılan reaksiyonun biyo-stabil bir fonksiyonel grup bırakmasına dikkat edilmelidir, örneğin, esterlerin dekolteye duyarlı olan esterleri in vivo. Antibiyotiğin farmakodinamik ve farmakokinetik profiline bağlı olarak basit bir alkil bağlayıcı sı kullanılabilir veya polietilen glikol (PEG) bağlayıcısı gibi daha az lipofilik seçenek düşünülmelidir. Bağlı bağlayıcı ile, antibakteriyel aktivite ilgili bakterilere karşı MICs ana bileşik benzer olduğundan emin olmak için değerlendirilmelidir.
Bu çalışmada, huigsen azide-alkyne [3+2] dipolar sikloaddition (tıklayın kimya, şekil 1'e bakınız ) florofordan antibiyotiğe kadar çeşitli nedenlerden dolayı kullanılmasını öneriyoruz. Tıklama reaksiyonları son derece seçici, antibiyotik reaktif grupların korunması gerekli değildir anlamı, ve daha fazla, reaksiyon istikrarlı bırakır, biyouyumlu triazol moiety. Azide bileşeni bizim prosedürlerde antibiyotik kısmına tanıtıldı, Bu genellikle daha kolay bir alkine giriş daha yapısal türleri çeşitli ile gerçekleştirilir gibi. Burada alkine türevi iki floroforun sentezleri açıklanmıştır, ancak istenirse diğerleri keşfedilebilir. NBD ve DMACA küçük boyutları nedeniyle seçildi, hücre penetrasyonu ve hedef etkileşimi ile müdahale olasılığını en aza indirmek. Tıklama reaksiyonu kendisi bakır kataliz kullanılarak gerçekleştirilir, burada ya Cu2+ (CuSO4, askorbik asit düşürücü ajan ile) veya Cu+ (CuI) başlangıç reaktifi olarak kullanılabilir. Arınmayı takiben(Şekil 2),MIC'ler azitte olduğu gibi test edilmelidir. Florofor seçimi ve bağlanma yeri dikkatli bir şekilde göz önünde bulundurulsa bile, kötü antibiyotik aktivitesinin gözlenme olasılığı vardır. Ancak bu, etkin olmayan bir sondanın kullanılmadığı anlamına gelmez. TMP probları ile gösterildiği gibi, kötü antibakteriyel aktivite ile bileşikler hala ana ilaç olarak aynı hedefe bağlanabilir. Bu eylem modu ve efflux gibi direnç, yol açan olayların incelenmesi üzerinde çalışmalar sağlayabilir.
Protokoller bölümünde belirtildiği gibi, basit bir spektrofotometri tonu(Şekil 3)veya akış sitometrisi(Şekil 4)kullanarak floresan antibiyotiklerle bakteri etiketlemeyi analiz etmek mümkündür . Her iki yöntem de hücresel birikimleri ölçebilme yeteneğine sahiptir ve hücreleri lysing ve lysate floresan lokalizasyonu inceleyerek hücre içi birikimi değerlendirmek mümkündür. Bu protokolde, hücre lisisi için lysozyme kullanımı, bu hızlı, evrensel bir teknik olduğu gibi tanımlanır. Glisin-HCl7ile gecetedavisi gibi diğer lysis koşulları da başarıyla kullanılmıştır. Bu tekniği kullanarak efflux'ün direnç mekanizması olan antibiyotik hücresel birikim üzerindeki etkisini incelemek mümkündür. Efflux gerçekten bakteri mevcut ise, hücre içi birikimi eksikliği gözlenecektir, Bu CCCP gibi bir efflux inhibitörü kullanılarak kurtarılabilir rağmen.
Mikroskopi, farklı bakterilerde prob lokalizasyonunu görsel olarak incelemek, etki şekli hakkında bilgi toplamak ve potansiyel olarak direnç sağlamak için de yapılabilir (temsili örnekler için Şekil 5'e bakınız). Bakterilerin içinde lokalizasyonu görebilmek için SIM (yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu), SR-SIM (süper çözünürlük-SIM), Airyscan veya STED (uyarılmış emisyon tükenmesi) gibi yeteneklerle donatılmış yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop gereklidir. Ayrıca, yüksek performanslı kapak fişleri kullanılmalı ve görüntüleme sonrası analizler uygun bir yazılım (örneğin, FIJI, Zen veya Imaris) üzerinde yapılmalıdır. Probların lokalizasyonu, Hoechst-33342 (mavi, nükleik asit), Syto-9 (yeşil, nükleik asit) ve FM4-64FX (kırmızı, membran) gibi belirli mimarileri lekeleyen boyalarla karşılaştırılır. Kullanılan her renk minimal spektral çakışma böylece boyaseçimi floresan antibiyotik maç yapılmalıdır. Mümkün olan en iyi görüntüleri elde etmek için optimizasyon gerekebilir. Örneğin, bakteriler slaytta çok kalabalıksa, askıda peletin sadece bir kısmını alın ve daha fazla montaj ortamıyla seyreltin. Buna karşılık, bakteri slayt üzerinde çok seyrek ise, sadece daha fazla bakteri ile başlar. Bu protokolde, canlı hücrelerle uyumlu bir termo geri dönüşümlü jel (örneğin, Cygel) canlı hücre görüntülemesi için tavsiye edilir, çünkü bakterileri hareketsiz hale getirsin (hareketli bakteriler dahil) ancak diğer montaj ortamları veya agarose da başarıyla kullanılmaktadır.
Genel olarak, biyolojik olarak aktif floresan antibiyotik türevlerinin hazırlanmasında karşılaşılabilecek zorluklara rağmen, kullanımlarının basitliği ve çok yönlülüğü bu sondaları AMR'de araştırma için cazip araçlar haline getirmelidir. Floresan antibiyotikler kullanarak gelecekteki çalışma antibiyotik direnci mekanizmaları içine fikir sağlamak için potansiyele sahiptir, mevcut antibiyotikler nasıl çalıştığını anlayışımızı geliştirmek, ve daha iyi ilaçların geliştirilmesine yardımcı.

Antimikrobiyal direnç (AMR) dünya çapında insan sağlığı için büyük bir tehdit oluşturan yükselen bir krizdir. Antibiyotiklerin çoğuna direnç bildirilmiştir ve klinik olarak mevcut tüm ilaçlara dirençli bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlar ortaya çıkmaktadır. AMR'nin yükselişiyle mücadele etmek için, bu çok yönlü fenomeni ve antibiyotikler ve bakteriler arasındaki temel mekanizmaları ve etkileşimleri anlamamızı artırmamız gerekir. Tarihsel olarak kötü anlaşılmış bir yönü bakteri içine antibiyotik geçirmasyon, birikimi ve efflux olayları ile birlikte. Bu bilgi, yeni ilaçların tasarlanmasında ve direnç mekanizmalarının anlaşılmasında çok önemlidir. Bu nedenle, bu AMR araştırmakritik bir rol oynar.
Antibiyotik konsantrasyonu ölçmek için alınabilecek iki ana yaklaşım vardır: doğrudan ilacın ölçülmesi veya sayısallaştırmayı kolaylaştırmak için tasarlanmış bir moiety ile etiketleme. Antibiyotik etiketleme algılama geliştirir rağmen, Bu ilacın biyolojik aktivitesi perturb olabilir, antimikrobiyal aktivite ve geçirgenlik gibi. Bu, etiketlenmemiş yöntemler için bir sorun değildir; ancak, algılama zor olabilir. Son birkaç yıl içinde, teknolojik gelişmeler doğrudan bakteri1antibiyotik konsantrasyonu ölçmek için kütle spektrometresi (MS) kullanarak araştırma bir patlamayol açmıştır1 ,2,3,5,5,6,7. Bu çalışmalar, gram-negatif bakterilerin en çok incelediği çeşitli bakterilerde hücre içi birikimiincelemenin mümkün olduğunu göstermiştir. Molekül geçirgenliğinin nicelemesi daha sonra aktiviteile bağlantılı olmuştur ve ilaç gelişimini bilgilendirmek için kullanılır2,3,4, ancak doğrudan birikimi ve hedef aktivitesi 5 şişirme zaman dikkatli alınmalıdır . MS gelişiminden önce, konsantrasyonu doğrudan ölçülebilen tek antibiyotikler tetrasiksin ve kinolonlar 8,9,10,11gibi içsel floresan sahip olanlardı. Kapsamı açıkça sınırlı olmasına rağmen, birikim ve efflux incelenmiş ve ölçülen, floresan tabanlı nicelik yararlılığını gösteren.
Tagged antibiyotikler radyoaktif ve floresan etiketleri yaygın olan, dağılımları, eylem modları ve direnç çalışma için uzun yıllar kullanılmıştır. Radyo etiketli problar ana bileşik le hemen hemen aynı olma avantajına sahiptir, bu nedenle biyolojik aktivitenin önemli ölçüde farklı olması olası değildir. 3 H, 14C ve 15N gibi izotoplar sık antibiyotiklerde bu elementlerin önemi nedeniyle kullanılmıştır, ve antibiyotik iskeleler çeşitli incelenmiştir 1,10,12,13. Radyo-probların tespiti basit olmakla birlikte, bu yaklaşımın kullanımını sınırlandıran bir dizi lojistik kaygı (örneğin, güvenlik, izotop yarı ömrü) vardır. Başka bir strateji floresan etiketli antibiyotikler. Bu problar, MS'den daha basit bir teknoloji kullanarak veradyasyonunlojistik sorunları olmadan ana ilacın dağılımını ve eylem ve direncini incelemek için kullanılabilir 8 . Bu yaklaşımın ana dezavantajı antibiyotikler genellikle nispeten küçük moleküller olmasıdır, dolayısıyla bir floresan moiety giriş önemli bir kimyasal değişiklik teşkil eder. Bu değişiklik fizyokimyasal özellikleri ve antibakteriyel aktiviteyi etkileyebilir. Bu nedenle, ana antibiyotik temsilcisi sonuç üretmek için bu faktörleri değerlendirmek için dikkatli olunmalıdır.
Bu çalışmada, bir yöntem sentezlemek için tarif edilir, değerlendirmek, ve floresan antibiyotik kullanmak, Bizim önceki yayınlarda olduğu gibi14,15,16. Önceki çalışmalar sayesinde, floresan antibiyotikler bir dizi hazırlanmış ve çeşitli amaçlar için kullanılmıştır (Stone ve ark.8bakınız). Bu çalışmada azotoksadiazol (NBD, yeşil) ve 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl (DMACA, mavi) gibi biyolojik aktiviteyi etkileme olasılığını en aza indirmek için çok küçük floropororlar kullanılmaktadır. Ayrıca, mikrobroth seyreltme minimum inhibisyon konsantrasyonu (MIC) tsay kullanarak antibakteriyel aktivitenin değerlendirilmesi açıklanmıştır, böylece aktivite üzerindeki değişikliklerin etkisi ölçülebilir. Bu floresan etiketli problar spektrofotometrik tahliller, akış sitometrisi ve mikroskopide kullanılabilir. Olası uygulamaların aralığı floresan antibiyotiklerin avantajı yatıyor. Hücresel birikim tek başına MS kullanılarak mümkün olmayan bir şey, ölçülebilir, kategorize ve görselleştirilmiş olabilir. Floresan antibiyotik kullanımı ile edinilen bilginin direnç anlayışımıza ve AMR ile mücadelemize yardımcı olacağı umulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-(dimethylamino)phenol</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>B23067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-7-nitro-benzofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163260-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186008205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 &#215; 50 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchi Reveleris C18 12g Cartridge</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>BUC145152103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celite 545</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22140-5KG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cygel</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>Ab109204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64FX, fixable analog of FM&#8482; 4-64 membrane stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma 2-16 LSCplus lyophilise</td>
			<td>CHRIST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson HPLC 2020</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Zentrifugen Rotofix 32</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)</td>
			<td>Schott/Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white 
			lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton II Broth Cation adjusted</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P50900-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reveleris GRACE MPLC</td>
			<td>Buchi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu LCMS-2020</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 1-15 Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1093859025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies Australia Pt</td>
			<td>S34854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 PRO</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of bacterial resistance using fluorescent antibiotic probes

Floresan antibiyotikler, diğer yöntemlere göre önemli avantajları nedeniyle antimikrobiyal direnç çalışmaları için kolayca kullanılan çok amaçlı araştırma araçlarıdır. Bu probları hazırlamak için, antibiyotiklerin azit türevleri sentezlenir, daha sonra tıklama kimyası ile azide-alkyne dipolar sikloek kullanılarak alkine-florofororlarla birleştiğinde. Arınma sonrasında floresan antibiyotiğin antibiyotik aktivitesi minimum inhibitör konsantrasyon değerlendirmesi ile test edilir. Bakteriyel birikimi incelemek için, radyoaktif antibiyotik türevlerine dayanan yöntemlere göre çok daha basit analizler için spektrofotometri veya akış sitometrisi kullanılabilir. Ayrıca, konfokal mikroskopi bakterilerin içinde lokalizasyonu incelemek için kullanılabilir, eylem modu ve dirençli türlerde meydana gelen değişiklikler hakkında değerli bilgiler sağlayan. Antimikrobiyal direnç çalışmalarında floresan antibiyotik probların kullanımı gelecekteki genişleme için çok potansiyele sahip güçlü bir yöntemdir.

Şekil 1 Floresan antibiyotiklerin hazırlanması için anahtar tıklama kimya reaksiyonu(A)gösterir, ve ile (B) siprofloksasin dayalı bizim yayınlanan floresan antibiyotik yapıları örnekleri (cipro), trimetoprim (TMP), ve linezolid. Bu probların hepsi bir azit ara yoluyla ilgili antibiyotikler sentezlendi. Daha sonra NBD ve DMACA floropores, her bir alkine ile fonksiyonel birleştiğinde.
Şekil 2 örnek LCMS izleri bir siprofloksasin-N3 ve NBD-alkyne tıklama reaksiyonu, nerede azide 3.2 dk ve ürün 3.8 dk. karşılaştırarak 1 ve 2 azide tepe (UV veya MS dedektörü) ortadan kaybolması takip olabilir gösterir. Spectra 3 arınmanın etkisini gösterir, hatalı zirveler MS ve UV izlerinden kaybolur. Hem saflık hem de reaksiyon ilerlemesi, ürün zirvesinin ve herhangi bir safsızlık zirvelerinin entegrasyonuyla ölçülebilir.
Şekil 3, hücre içi birikimin efflux varlığında ve yokluğunda floresan spektroskopi ile değerlendirilmesinden elde edilen tipik sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, E. coli Proton güdü kuvvetini (PMF) çökerten CCCP ile veya eklemeden TMP-NBD ile tedavi edildi. Bakterilerin hücre içi floresansı CCCP ile önlanda tedavi edildiğinde önemli ölçüde daha yüksekti, bu da efflux'ün bu bakterilerdeki birikimi azalttığını gösteriyor. Bu deney tolcbakteri eksikliği kullanılarak tekrarlandı , bireysel efflux pompa bileşenlerinin etkisini incelemek için bu tetkik kapasitesini gösteren. Bu durumda, yabani tip bakterilere göre hücre içi floresansında artış olmasına rağmen, CCCP birikimi hala artmıştır. Bu bulgular tolC inTMP efflux yer alır ama dahil tek PMF sürücü pompa olmadığını göstermektedir.
Şekil 4, Şekil 2ile aynı deneyin sonucunu gösterir, ancak spektroskopi yerine akış sitometrisi ile ölçülen birikim ile. Aynı veri eğilimleri gözlendi ve her iki tekniğin de efflux aracılı hücre içi birikim olgusunun incelenmesinde kullanılabileceğini gösterdi.
Şekil 5,gram-pozitif(S. aureus)ve gram-negatif bakterilerin(E. coli)TMP-NBD (1) ve cipro-NBD (2 + 3) floresan problarla etiketlenmiş temsili konfokal mikroskopi görüntülerini göstermektedir. Her iki durumda da eş lokalizasyonu karşılaştırmak için kırmızı membran boyası FM4-64FX eklendi. TMP-NBD için mavi nükleik asit boyası Hoechst-33342 de kullanıldı. Bu görüntüler inşilerek, bakterilerdeki antibiyotiğin lokalizasyonu görselleştirildi. Paneller 2 ve 3 karşılaştırıldığında efflux etkisinin nasıl incelendiği gösterilmektedir, efflux inhibitörü CCCP ile kullanılan 2, hücre içi birikimi ile sonuçlanan. Panel 3'e,hiçbir CCCP eklenmedi. Bu nedenle efflux aktiftir ve sonda birikimi görülmedi.
Şekil 6, DMACA etiketli oksazolidinone probu Lz-NBD ile etiketlenmiş Gram-pozitif(S. aureus)bakterilerin intemsili konfokal mikroskopi görüntülerini göstermektedir. Co-lokalizasyonu karşılaştırmak için kırmızı membran boyası FM4-64FX eklendi ve yeşil nükleik asit boyası Hoechst-33342 de kullanıldı. Bu görüntüler inşilerek, bakterilerdeki antibiyotiğin lokalizasyonu görselleştirilerek membran ve nükleik asitten farklı iç lokalizasyon görüldü.
Tablo 1 floresan antibiyotik, siprofloksasin, trimetoprim (TMP) ve linezolid (Lz) üç dizi için MIC değerleri gösterir, her biri ebeveyn antibiyotik, NBD ve DMACA türevleri için sunulan veriler. Her bir antibiyotik için temsili türler seçildi, hem gram-pozitif hem de gram-negatif dahil. Siprofloksasin serisi için, her iki floresan problar ana ilaca göre antibiyotik aktivitesi kaybetti, ancak tüm türlere karşı bazı aktivite korudu. Benzer şekilde, linezolid problar bazı aktivite kaybetti, ancak zayıf antibiyotik orta kaldı. TMP probları yabani tip bakterilere karşı hemen hemen tüm aktivite kaybetti, ancak efflux eksikliği E. colikarşı aktif , antibakteriyel aktivite kaybı birikimi eksikliği nedeniyle olduğunu belirten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig01.jpg"> Şekil 1: Antibiyotik kaynaklı probların sentezi ve yapıları. (A) Azide-antibiyotik ve alkine-floroporlardan floresan antibiyotik problarının sentezi için genel reaksiyon şeması. (B) Yayınlanan problarımızın yapıları siprofloksasin, trimetoprim ve linezolid dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig02.jpg"> Şekil 2: Antibiyotik kaynaklı prob saflık larının LCMS ile ölçülmesi. Analitik LCMS izleri (1) eksik, (2) tam, ve (3) HPLC saflaştırılmış siprofloksasin-N3 + NBD-alkyne tıklama reaksiyonları reaksiyon tamamlandıktan sonra başlangıç materyalinin kaybolması gösteren, ve arıtma üzerinde çeşitli zirveler. A = UV-Vis izi (250 nm'de absorbe), B = MS izi (pozitif ve negatif mod). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig03.jpg"> Şekil 3: Antibiyotik kaynaklı prob birikiminin plaka okuyucu ölçümü. TMP-NBD (50 μM) hücresel birikiminin vahşi tipte (1, ATCC 25922) ve ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli'nin (A)ile ve (B) CCCP (100 μM) eklenmeden inkübe edilmiş hücresel birikiminin floresan spektroskopik ölçümü. İstatistiksel anlamlılık (**p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001) CCCP'nin yokluğu veya varlığı ile yabani tip ile ΔtolCE. coliarasında gösterilir. Rapor edilen veriler üç deney için ortalama ± SD'dir. Bu rakam önceki yayınımız15'tenuyarlanmıştır ve hücre içi birikimde efflux'ün rolünü açıklamak için spektroskopi nin kullanımını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig04.jpg"> Şekil 4: Antibiyotik kaynaklı prob birikiminin akış sitometri ölçümü. TMP-NBD kullanılarak vahşi tipte (1, ATCC 25922) ve ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli ile ve CCCP (100 μM) ilavesi olmadan hücre birikiminin akış sitometriölçümü. Ortanca floresan aktivitesi 10.000 bakteriyel olaydan, İstatistiksel anlamlılık (***, p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001) cccp'nin yokluğu ve varlığı ile yabani tip ile ΔtolCE. coliarasında gösterilir. Rapor edilen veriler üç deney için ortalama ± SD'dir. Bu rakam önceki yayınımız15'tenuyarlanmıştır ve hücre içi birikimde efflux'ün rolünü açıklamak için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig05.jpg"> Şekil 5: NBD-probu lokalizasyonunun konfokal mikroskopi görselizasyonu. Konfokal mikroskopi görüntüleri 1) canlı S. aureus Hoechst-33342 (mavi, nükleik asit), TMP-NBD (yeşil), FM4-64FX (kırmızı, membran) ve overlaid ile etiketlenmiş; 2) canlı E. coli CCCP ile tedavi (efflux inhibitörü) cipro-NBD (yeşil), FM4-64FX (kırmızı, membran) ile etiketlenmiş ve overlaid; 3) canlı E. coli cipro-NBD (yeşil), FM4-64FX (kırmızı, membran) ile etiketlenmiş ve overlaid. Bu rakam önceki yayınlarımızdan uyarlanmıştır15,16, ve efflux etkisi de dahil olmak üzere prob lokalizasyonu incelemek için mikroskopi kullanımını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60743/60743fig06.jpg"> Şekil 6: DMACA-probu lokalizasyonunun konfokal mikroskopi görselizasyonu. Oxazolidinone probu Lz-DMACA (mavi), Sytox green (yeşil, nükleik asit) ve FM4-64FX (kırmızı, membran) ile etiketlenmiş canlı S. aureus'un konfokal mikroskopi görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60743/60743fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3"></td>
			<td colspan="9">MIC (3g/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tür</td>
			<td>Zorlanma</td>
			<td>Cipro</td>
			<td>Cipro-NBD</td>
			<td>Cipro-DMACA</td>
			<td>Tmp</td>
			<td>TMP-NBD</td>
			<td>TMP-DMACA</td>
			<td>Linezolid (Lz)</td>
			<td>Lz-NBD</td>
			<td>Lz-DMACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>0.125 - 0.5</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 43300</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Streptococcus pneumoniae</td>
			<td>ATCC 700677</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>64</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Enterococcus faecium</td>
			<td>ATCC 35667</td>
			<td>1 - 8</td>
			<td>32</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>ATCC 51559</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>ATCC 13883</td>
			<td>0.015 - 0.06</td>
			<td>8 - 16</td>
			<td>8 - 32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>ATCC 27853</td>
			<td>0.25 - 1</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td>32 - ≥64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Escherichia coli</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>≤0,004</td>
			<td>8</td>
			<td>2</td>
			<td>0.5</td>
			<td>>64</td>
			<td>>64</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td>Mutant ΔtolC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.125</td>
			<td>0.25</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Siprofloksasin dayalı floresan antibiyotik probların antibiyotik faaliyetleri, trimetoprim, ve linezolid uygun klinik olarak ilgili bakteriyel suşları karşı, et suyu mikroseyreltme MIC tahlilleri ile ölçülen. Çoğu durumda, problar ana ilaca göre bazı aktivite kaybetti, ancak bazı ölçülebilir antibiyotik potens korudu (daha ileri çalışmalarda yararlı olmak için yeterli).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes at JoVE.com

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Floresan antibiyotiklerin hazırlanması spektrofotometri ve mikroskopi gibi uygun analitik teknikler ile bakteriler içinde bu terapötik reaktiflerin lokalizasyonu nun değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı antibiyotik lokalizasyonunun kolaylıkla belirlenebildiğidir. Bu yerelleştirme efflux de dahil olmak üzere olayların bir dizi ilgilidir.Tıklama bir reaksiyon prosedürü gerçekleştirmek için, yuvarlak bir alt şişe ilgi azide antibiyotik yerleştirin ve şişe azide milimole başına 25 mililitre tert-butanol ve 25 mililitre su ekleyin. Çözeltiye hazırlanan florofor alkyne'yi ekleyin ve reaksiyonu 50 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra, şişeye 0,6 eşdeğer bakır sülfat ve 2,4 eşdeğeri askorbik asit ekleyin.Reaksiyonu bir saat veya LCMS tarafından analiz edilene kadar karıştırın reaksiyonun tamamlaşAcağı belirtin. Sonra serin ve antibiyotik iskele için uygun olarak reaksiyon arındırın. Burada, siprofloksasin, linezolid ve trimetoprim bazlı bir azide ara ile ilgili antibiyotiklersentez yapı örnekleri ile floresan antibiyotik hazırlanması için anahtar tıklayın kimya reaksiyonu gösterilmiştir.Bu sıvı kromatografi kütle spektrometresi bir siprofloksasin azide ve NBD alkine tıklama reaksiyonu izleri, azide 3.2 dakika ve ürün 3.8 dakika eluted edildi. Tıklama reaksiyonunun ilerlemesini azide tepenin kaybolması takip edebilir. Bu spektrumlarda, arınmanın etkisi hatalı zirvelerin kaybolması ile görselleştirilebilir.Sentezlenen antibiyotik antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için, LB agar plakaları üzerine antibiyotik iskele için uygun bakteriyel suşların çizgi gliserol stokları ve 37 santigrat derece bir gecede kültürleri büyümek. Ertesi sabah, her tabak ve kültür den tek bir koloni seçin koloniler bir gecede 37 santigrat derece kültür başına CAMHB beş mililitre. Ertesi gün, taze CAMHB kültürleri yaklaşık 40 kat seyreltmek ve 0.4 ve 0.8 arasında 600 nanometre bir optik yoğunluğu ile orta günlük fazbakteri büyümek.Daha sonra, steril suda%20 dimetil sülfoksit mililitre başına 1,28 miligram her floresan antibiyotik stok çözümleri hazırlamak ve 96-iyi plaka ilk sütunun her kuyusu için antibiyotik 10 mikrolitre ekleyin. İlk sütunun her kuyusu için 90 mikrolitre CAMHB ve diğer tüm kuyulara 50 mikrolitre ekleyin. Sonra plaka üzerinde bir seri iki kat seyreltme gerçekleştirin.Iyice karıştırdıktan sonra, orta log faz kültürlerini mililitre başına altıncı koloni oluşturan birimlere yaklaşık bir kez 10'a seyreltin ve her kültürün 50 mikrolitresini seyreltme kuyularına ekleyerek mililitrede beşinci koloni oluşturan ünitelere yaklaşık beş kat 10'luk son konsantrasyon elde edin. Tüm bakteriler kaplandığında, tabaklara kapaklar yerleştirin ve 18 ila 24 saat boyunca kültürleri 37 santigrat derecede titremeden kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, plakaları görsel olarak inceleyin.Minimum inhibisyon konsantrasyonu görünür büyüme ile de en düşük konsantrasyon olacaktır. Sonda birikimi analizi için, 37 santigrat derece bir gecede kuluçka için LB agar plakaları üzerine bakteriyel suşların çizgi gliserol stokları. Ertesi sabah, 37 santigrat derece lysogeny suyu gece kültürü için plaka tek bir koloni seçin.Ertesi sabah, taze ortamda yaklaşık 50 kat bir gecede kültürü seyreltin. Kültür orta log fazına ulaştığında, santrifüj ile bakteri pelet ve orta decant. PBS bir mililitre bakteri resuspend ve tekrar bakteri santrifüj.Supernatant decant ve iki 600 nanometre bir optik yoğunluğu pbs yıkanmış pelet resuspend. PBS'de 10,1 mikrolitre 10 milimolar CCCP'yi bir mililitre bakteriye ekleyin ve bakterileri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, santrifüj ile bakteri toplamak ve PBS 10 ila 100 mikromolar floresan antibiyotik çözeltisi bir mililitre pelet resuspend.37 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, hücreleri yıkama başına bir mililitre soğuk PBS'de dört kez santrifüj le yıkayın. Yıkandıktan sonra bakterileri 180 mikrolitre lysis tamponu ve 70 mikrolitre likitme ile lyse. 37 santigrat derecede 30 dakika sonra, bakterileri sırasıyla 5 dakika ve 34 santigrat derece eksi 78 derecede üç kez dondurun-eritin.Donma-erime son turdan sonra, 65 santigrat derece 30 dakikalık kuluçka ardından 20 dakika boyunca örnek sonicate. Kuluçka sonunda, santrifüj ile lysed örnek toplamak ve 10 kilodalton filtre membran ıslanması. Filtreyi yıkama başına 100 mikrolitre suyla dört kez yıkayın ve her biri siyah düz alt 96 kuyunun ayrı kuyularına yıkayın.Daha sonra florofora uygun uyarma ve emisyon dalga boyları ile bir plaka okuyucuüzerinde floresan yoğunluğunu ölçün. Efflux varlığı ve yokluğunda floresan spektroskopi ile hücre içi birikiminin değerlendirilmesinden elde edilen bu tipik sonuçlar, cccp ile yapılan ön tedaviden sonra bakterilerin hücre içi floresansının bakterilerin içindeki birikimi azalttığını gösteren hücre içi floresansının önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermektedir. Gram pozitif ve Gram negatif bakterilerin bu temsili konfokal mikroskopi görüntülerinde, antibiyotiklerin bakteriler içinde lokalizasyonu CCCP tedavisinden sonra görselleştirilebilir.CCCP eklenmediğinde bu olgu gözlenmez. Floresan antibiyotik kullanırken, hangi bilgileri toplamayı hedeflediğinize dikkat edin ve bu verileri elde ederken hangi protokolün en yararlı olacağını göz önünde bulundurun. Onların sentezini takiben, floresan antibiyotikler ilaç hedef etkileşimleri ve direnç değişiklikleri de dahil olmak üzere bakteriyel süreçlerin bir dizi çalışma için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Bakteriyel Keratite Karşı İlaç Tedavilerini İncelemek İçin Porcine Ex Vivo Kornea Modeli Kurulması

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...