Name: assessment of memory function in pilocarpine-induced epileptic mice
Uploaded: 2020-06-04T14:00:00
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ジェイミン・リー博士の技術サポートに感謝します。この研究は、韓国政府が資金を提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(NRF-2019R1A2C1003958、NRF-2019K2A9A2A0800167)によって支援されました。

すべての実験手順は、韓国のカトリック大学の倫理委員会によって承認され、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(NIH出版物第80-23号)に従って実施されました。
1. 新規オブジェクト位置テスト (NL)
<ol><li>ピロカルピン注射後4~6週間で、てんかんC57BL/6またはトランスジェニックマウスを準備します。 注:急性発作は腹腔内(IP)ピロカルピン注射によって?...

この研究は、慢性てんかんを有するマウスにおける認知機能を評価するための実験的手順を説明する。多くの異なる行動テストパラダイムは、マウス18の学習および記憶機能を評価するために使用される。モリス水迷路、ラジアルアーム迷路、Y迷路、文脈恐怖コンディショニング、およびオブジェクトベースのテストは、最も頻繁に使用される行動テストであり、信頼性の?...

てんかんは、自発的な,再発発作1、2、32を特徴とする1慢性疾患である。3反復発作は,5,,脳1、2、32において構造的および機能的異常を引き1起こす可能性があるため、異常発作活動は、最も一般的なてんかん関連の併存疾患の1つである認知機能障害に寄与し得る。3一過性で一時的な慢性的な発作イベントとは対照的に、認知障害はてんかん患者の生涯を通じて持続し、生活の質を低下させる可能性があります。したがって、てんかん関連認知機能低下の病態生理学的メカニズムを理解することが重要である。
,てんかんの様々な実験動物モデルは、慢性てんかん,7、8、9、10、11、128,に関連7する学習と記憶障害を12実証するために使用されてきた。91011例えば、モリス水迷路、文脈恐怖コンディショニング、ホールボード、新規物体位置(NL)、および新しい物体認識(NO)試験は、側頭葉てんかん(TLE)における記憶機能障害を評価するために頻繁に使用されてきた。海馬は、TLEが病理を示す主要領域の1つであるため、海馬依存性記憶機能を評価できる行動検査が優先的に選択されることが多い。しかし、発作が異常な海馬神経新生を誘発し、てんかん関連認知機能低下10に寄与する可能性があることを考えると、デンテート新生児神経機能を検査するための行動パラダイム(すなわち、空間パターン分離、PS)8、13はまた8,13、てんかんにおける記憶障害の細胞メカニズムに関する貴重な情報を提供することができる。
この記事では、てんかんマウスのメモリテスト(NL、NO、PS)のバッテリーを示します。テストは簡単で簡単にアクセスでき、洗練されたシステムを必要としません。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Sung-shim</td>
			<td></td>
			<td>Use with the 26 or 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Spray to clean the box and objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black curtain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For avoiding unnecessary visual cues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5042</td>
			<td>For Cresyl violet staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>E21040041</td>
			<td>For tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided sticky tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the firm placement of the objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol series</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>floor plate with narrow grid patterns</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>floor plate with wide grid patterns</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illuminometer</td>
			<td>TES Electrical Electronic Corp.</td>
			<td>1334A</td>
			<td>For the measurement of the room lighting (60 Lux)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensive care unit</td>
			<td>Thermocare</td>
			<td>#W-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine hydrochloride</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>7003</td>
			<td>Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp</td>
			<td>Lungo</td>
			<td>P13A-0422-WW-04</td>
			<td>Lighting for the behavioral test room</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objects</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>open field box</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper towel</td>
			<td>Yuhan-Kimberly</td>
			<td>47201</td>
			<td>Use to dry open field box and objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>104005</td>
			<td>Make 4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pilocarpine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ruler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to locate the objects in the open field box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scopolamine methyl nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2250</td>
			<td>Make 10X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart system 3.0</td>
			<td>Panlab</td>
			<td></td>
			<td>Video tracking system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopwatch</td>
			<td>Junso</td>
			<td>JS-307</td>
			<td>For the measurement of explorative activities of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>For cryoprotection of tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>terbutaline hemisulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2528</td>
			<td>Make 10X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video camera (CCD camera)</td>
			<td>Vision</td>
			<td>VCE56HQ-12</td>
			<td>Place the camera directly overhead of the open field box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer korea</td>
			<td>KR10381</td>
			<td>Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1307</td>
			<td>For Cresyl violet staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of memory function in pilocarpine-induced epileptic mice

認知障害は、側頭葉てんかんの最も一般的な併存疾患の一つである。てんかんの動物モデルにおけるてんかん関連認知機能の低下を再現するために、ピロカルピン処理慢性てんかんマウスを生成した。これらのてんかんマウスを用いた3つの異なる行動テストのプロトコルを提示します:新しい物体位置(NL)、新規物体認識(NO)、パターン分離(PS)テストをそれぞれ、場所、物体、および文脈の学習と記憶を評価する。動物の基底運動活動を測定するオープンフィールドテストに続いて、行動装置を設定し、NL、NO、PS試験の実験手順を提供する方法を説明します。また、てんかんマウスにおける記憶機能を評価するための他の行動検査に関するNL、NO、およびPS試験の技術的利点についても説明する。最後に、てんかんマウスが慣れ親しんだセッション中に30 sの物体と良好な接触を行わなかった場合の考えられる原因と解決策について議論します。したがって、このプロトコルは、マウスを使用しててんかん関連記憶障害を評価する方法に関する詳細な情報を提供する。NL、NO、およびPSのテストは、てんかんマウスの異なる種類の記憶の評価に適した、シンプルで効率的なアッセイです。

認知機能を評価するための一般的な実験スケジュールと設定を図 1に示します。ピロカルピン誘発急性発作の導入から6週間後、マウスは、試験の間に3日間の休息期間で分離された順にNL、NO、およびPS試験を行った(図1A)。NL テストでは、慣れ親しんだセッション (F1) の間に 2 つの同一のオブジェクトがオープンフィールドに配置され、翌日に 1 つ?...

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Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

本稿では、ピロカルピン誘発てんかんマウスにおける記憶障害を評価するための実験的手順を提示する。このプロトコルは、てんかんの最も一般的な併存疾患の一つであるてんかん関連認知機能の病態メカニズムを研究するために使用することができる。

ピロカルピン誘導てんかんマウスにおける記憶機能の評価

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...

認知障害は、側頭葉てんかんにおける最も一般的な共罹患率の1つである。慢性てんかんのマウスモデルを用いて記憶障害を評価する方法を説明するプロトコルを提示する。新しい物体の位置、新しい物体認識およびパターン分離テストは、動物に最小限のストレスを与えることができるシンプルで短いお尻である。これは、自発的な再発発作のための追加のトリガーなしに、てんかんマウスの記憶機能を評価するために、このテストを最適にします。まず、動物を自宅のケージの低光に少なくとも30分間順応させる。開いているフィールド ボックスを準備します。1日目に、開いたフィールドボックスの中央に習慣、場所、照度計を配置します。そして、照度を60ルクスに調整します。各マウスの運動活動を評価するには、動物行動ビデオ追跡ソフトウェアを使用します。ビデオトラッキングソフトウェアを開いたら、開いているフィールドボックスのサイズを調整します。次に、壁に面したオープンフィールドボックスに実験用マウスをそっと置きます。スマートプログラムを開き、[カスタマイズして受け入れる]をクリックします。[イメージ ソース] をクリックします。インストールされているカメラを選択したら、設定ボタンを押します。カメラの解像度を調整し、押して、受け入れます。キャリブレーションのクリック後、ボックスサイズに合わせてコンピュータのマウスをドラッグします。そして、内側のボックスのサイズを記入します。[ゾーン定義] をクリックして、各ボックスのサイズを保存して調整し、[保存] をクリックします。赤いボックスは追跡範囲であるため、内側のボックスサイズに収まり、ピンクのボックスはアウトラインに収まります。[検出設定]を押します。[スナップショット] をクリックし、[テストの開始] をクリックして特定の領域が追跡されているかどうかを確認し、テストの終了を事前に確認してから[承認]をクリックします。[時刻の設定] をクリックします。事前設定時間を選択した後、3秒の取得時間で待ち時間を15分に設定し、[Accept]を押します。[サブジェクト] を押してコード名を設定します。[スケジューラ] をクリックして既存の詳細を削除し、サブジェクトで変更したコード名をセッション 1 にドラッグします。[データ収集]をクリックします。[録音]ボタンをクリックし、[開始]をクリックします。ボックスにマウスを入れて、15分間追跡します。録音の15分後にマウスをホームケージに戻します。明るい光を元に戻します。[データ取得] をクリックします。次に、[アクティブ解析] コード名 Sham を隣のウィンドウにドラッグします。[レポート定義] ボタンをクリックします。[新しいレポート定義] ボタンをクリックし、[概要レポート] をクリックして[承認]をクリックします。[サブジェクト名] と [ゾーンの距離] をクリックし、横に送信します。次に、[同意]ボタンを押します。赤いチェック マークをクリックし、[分析] をクリックします。結果を確認します。2日目と3日目に、習慣セッションを繰り返します。4日目に慣れ親しんだセッションを実行します。薄暗い光の中で、空のオープンフィールドに各マウスを3分間置きます。この短い習慣の後、その家のケージに動物を返します。隣接する壁から5センチメートル離れたオープンフィールドアリーナに、2つの同一のオブジェクト、ゴム人形を置きます。両面テープでオブジェクトを固定します。実験マウスを、オブジェクトから最も遠い壁に面したオープンフィールドボックスに導入します。20 分間の無料探索を許可し、2 つのストップウォッチを使用して両方のオブジェクトを探索するのにかかる時間を手動で測定します。動物の出物が物体を指さない探索的な時間、どんな行動としても定量化しないでください。マウスが 30 秒の最小探索時間に達したら、2 つのオブジェクトの場合、F1 セッションを停止し、マウスをホーム ケージに移します。マウスが 20 分以内にオブジェクトを 30 秒間探索できない場合は、開いているフィールド ボックスからマウスを削除し、それ以降のセッションから除外します。5 日目に、新規オブジェクトの位置テスト セッションを実行します。マウスを開いたフィールド領域に移動して、3 分間再び使用します。その後、そのホームケージに戻します。1 つのオブジェクトを対角線位置に移動し、開いたフィールド ボックスの壁に対して実験用マウスを配置します。ビデオ追跡システムで10分間の無料探索と録画を行うことができます。2つのストップウォッチを使用して、各オブジェクトを探索するのにかかる時間を測定します。次に、尾をつかんでマウスをホームケージに移します。3日間、マウスは食べ物と水への無料アクセスで休ませてください。9日目に1匹のマウスに対して15分間の習慣セッションを行います。10日目に、簡単な再居住セッションを3分間実行します。その後、一時的に自宅のケージに戻します。隣接する壁から5センチメートル離れたオープンフィールドに、40ミリリットルの水で満たされた50ミリリットルのプラスチックチューブの2つの同一の物体を置きます。開いたフィールド ボックスに、オブジェクトから最も遠い壁に向かって実験用マウスを導入します。マウスはNOテストの2つの異なるオブジェクト、40ミリリットルの水で満たされた50ミリリットルのプラスチックチューブ、ガラスのコプリン瓶に露出します。慣れ親しんだセッション中に、グループ内の動物の半分に対して2つの同一のオブジェクト、ガラスコプリン瓶ジャーを提示することによって、オブジェクトのバランスを取ります。次に、2 つの異なるオブジェクトを使用して、20 分間の無料探索を許可し、2 つのストップウォッチを使用して両方のオブジェクトを探索するのにかかる時間を手動で測定します。両方のオブジェクトの最小有効期限が 30 秒に達したら、慣れ親しんだセッションを停止します。翌日、新規オブジェクト認識テストセッションを実行します。まず、マウスを開いたフィールドに移して、3分間、再び住み、それからホームケージに戻します。隣接する壁から5センチメートル離れた場所で、チューブをガラスのコプリン瓶瓶に交換して、マウスが1つのチューブと1つのガラスコプリン瓶に露出するようにします。最初の慣れ親しんだセッション中にガラスコプリン瓶にさらされた半分の動物については、ガラスのコプリン瓶を40ミリリットルの水で満たされた50ミリリットルのプラスチックチューブに置き換えます。マウスが1つのチューブと1つのガラスコプリン瓶に露出するように。ビデオ追跡システムを使用して録画しながら、10分間の無料探索を可能にします。次に実験用マウスの尾をつかみ、ホームケージに移します。3日間、マウスは食べ物と水への無料アクセスで休ませます。NL 分析の場合は、[プログラムのカスタマイズを開始] を開いて[受け入れる]をクリックします。[イメージ ソース] をクリックします。インストールされているカメラを選択したら、設定ボタンを押します。カメラの解像度を押して[同意]を押します。[ビデオフォルダを開く] ボタンをクリックして、保存した動画を開きます。保存したビデオをマウスが入った時間から 10 分間視聴し、各オブジェクトの探索に費やした時間を測定します。15日目に、最初にPSテストの最初の慣れ親しんだセッションを行いました。これは、マウスが再生息するためのオープンフィールド領域に3分間です。広いグリッドと 2 つの同一のオブジェクトを持つフロア プレートを配置します。50ミリリットルの水で満たされたプラスチックTフラスコは、オープンフィールドボックスに。次に、実験用マウスを、オブジェクトから最も遠い壁に面したオープンフィールドボックスに導入しました。20分間無料で探索できます。また、2つのストップウォッチを使用して両方のオブジェクトを探索するのに費やす時間を手動で測定します。マウスが両方のオブジェクトの 30 秒の最小探査時間に達したら、最初の慣れ親しんだセッションを停止し、そのホーム ケージに動物を転送します。動物の半分のオブジェクトとパターンの分離テストのバランスを取るために、広いグリッドと2つの同一のオブジェクトで床板を配置し、オープンフィールドボックスでカウンターバランス実験のためのガラスボトル。次に、実験用マウスを開いたフィールドボックスに導入し、20分間無料で探索できるようにします。マウスが2つのオブジェクトの最低探査時間である30秒に達したら、最初の慣れ親しんだセッションを停止し、動物を自宅のケージに移します。翌日、マウスをフィールドエリアに移して3分間再居住します。そして、そのホームケージにそれを返します。次に、狭いグリッドフロアに2つのガラス瓶を使用して2回目の慣れ親しんだセッションを行います。カウンターバランス実験では、狭いグリッドフロアに水で満たされた2つのTフラスコで2回目の慣れ親しんだセッションを行います。次の日にパターン分離テストセッションを実行します。オブジェクトを持たないオープンフィールドエリアにマウスを移動し、3分間再生息します。そして、そのホームケージにそれを返します。次に、水とガラス瓶で満たされたTフラスコを狭いグリッドフロアに置きます。Tフラスコを水で満たして、新しい物体にします。カウンターバランス実験の場合は、狭いグリッドの床に各オブジェクトを配置して、ガラス瓶を新規のオブジェクトにします。その後、実験用マウスを10分間オープンフィールド領域に進めて探索する。ビデオトラッキングシステムを使用して、10分間の無料探索と記録を許可します。実験マウスの尾をつかみ、ホームケージに移します。2 つのストップウォッチを使用して各オブジェクトの探索に費やした時間を測定します。そして、新しいオブジェクトと使い慣れたオブジェクトの間の時間差を2つのオブジェクトを探索する合計時間で割った差別比を計算します。ピロカルピンの導入から6週間後に急性発作を誘発した。マウスは、新しいオブジェクトの位置テストを受けます。新規物体認識試験とパターン分離試験その順序でテストの間に3日間の休息期間で区切られる。2つのオブジェクトの間に有意な好みがないことを確認した。てんかんマウスは、シャム対照と比較して3つの試験における差別比において有意な減少を示した。空間記憶障害のデモンストレーション。運動活動の測定は、てんかん動物の有意な増加を示した。一方、オブジェクトを探索する動機は、シャムとてんかん動物の間で比較されました。最後に海馬細胞死を、ピロカルピン誘導状態てんかんの後に、結晶紫色染色を用いて、発作誘発神経損傷を確認した後に評価した。ピロカルピン処理動物は、シャムコントロールとは異なり、海馬のCA3サブフィールドとピノスティック細胞に実証した。NOとPSテストでカウントアップは、このデバイス固有のオブジェクトに可能な固有のバイアスを減らすために重要です。さらに、慢性てんかんマウスは、実験設定に十分な賞賛国家のための複数の習慣的なステップを必要とする高められた不安を示しています。プロトコル内のオブジェクトの数や場所などの時間変更は、メモリテストを提供することができます。これは、認知機能の低下に関連するてんかんの複雑なメカニズムを精巧にするのに役立ちます。このビデオを見た後, てんかんの記憶障害のさまざまな側面を評価する方法をよく理解している必要があります。.

Research

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