Name: assessment of memory function in pilocarpine-induced epileptic mice
Uploaded: 2020-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice at JoVE.com

기술지원에 감사드린다. 이 작품은 한국 정부의 후원을 받은 국립연구재단(NRF)의 지원(NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167)에 의해 지원되었다.

모든 실험 절차는 가톨릭대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며, 국립과학수사연구원의 실험실동물 관리 및 이용안내(NIH 간행물 제80-23호)에 따라 실시되었다.
1. 새로운 개체 위치 테스트 (NL)
<ol><li>간질 C57BL/6 또는 필로카핀 주사 후 4-6주 후에 형질전환 마우스를 준비하십시오. 참고: 급성 발작은 복강 내(IP) 필로카핀 주사에 의해 유도되었고, 이전 보고서14에...

이 작품은 만성 간질을 가진 마우스에 있는 인식 기능을 평가하기 위한 실험적인 절차를 기술합니다. 많은 다른 행동 시험 패러다임은 마우스18에있는 학습 그리고 기억 기능을 평가하기 위하여 이용됩니다. 모리스 물 미로, 방사형 팔 미로, Y-미로, 상황 공포 컨디셔닝 및 개체 기반 테스트는 가장 자주 사용되는 행동 테스트이며 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다. 그 중에서도 NL...

간질은 자발적인 재발성발작을특징으로 하는 만성질환1,2,,3. 반복적 인 발작은 뇌의 구조적 및 기능적 이상을 일으킬 수 있기 때문에1,,2,,3,비정상적인 발작 활동은 가장 흔한 간질 관련 동반 작용 중 하나인 인지 기능 장애에 기여할 수 있습니다4,,5,,6. 일시적이고 일시적인 만성 발작 사건과는 달리, 인지 장애는 간질 환자의 삶 전반에 걸쳐 지속될 수 있으며 삶의 질을 악화시킬 수 있습니다. 따라서 간질과 관련된 인지 기능 저하의 병리 생리학적 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다.
간질의 다양한 실험 동물 모델은 만성 간질7,8,89,10,,9,11,,12와관련된 학습 및 기억 결핍을 입증하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 모리스 물 미로, 상황별 공포 컨디셔닝, 홀 보드, 새로운 개체 위치 (NL), 및 새로운 개체 인식 (NO) 테스트는 자주 측두엽 간질에서 메모리 기능 장애를 평가하는 데 사용되었습니다 (TLE). 해마는 TLE가 병리학을 보여주는 1 차적인 지구의 한개이기 때문에, 해마 의존적인 기억 기능을 평가할 수 있는 행동 시험은 수시로 우선적으로 선택됩니다. 그러나, 발작이 비정상적인 해마 신경 발생을 유도하고 간질 관련 인지 감소에 기여할 수 있다는 점을 감안할때,신생아 신경 기능 (즉, 공간 패턴 분리, PS)8,,13은 또한 간질에서 기억 장애의 세포 메커니즘에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.
이 문서에서는 간질 마우스에 대한 메모리 테스트, NL, NO 및 PS의 배터리를 보여 줍니다. 테스트는 간단하고 쉽게 접근할 수 있으며 정교한 시스템이 필요하지 않습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Sung-shim</td>
			<td></td>
			<td>Use with the 26 or 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Spray to clean the box and objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black curtain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For avoiding unnecessary visual cues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5042</td>
			<td>For Cresyl violet staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>E21040041</td>
			<td>For tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided sticky tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the firm placement of the objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol series</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>floor plate with narrow grid patterns</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>floor plate with wide grid patterns</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illuminometer</td>
			<td>TES Electrical Electronic Corp.</td>
			<td>1334A</td>
			<td>For the measurement of the room lighting (60 Lux)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensive care unit</td>
			<td>Thermocare</td>
			<td>#W-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine hydrochloride</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>7003</td>
			<td>Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp</td>
			<td>Lungo</td>
			<td>P13A-0422-WW-04</td>
			<td>Lighting for the behavioral test room</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objects</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>open field box</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper towel</td>
			<td>Yuhan-Kimberly</td>
			<td>47201</td>
			<td>Use to dry open field box and objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>104005</td>
			<td>Make 4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pilocarpine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ruler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to locate the objects in the open field box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scopolamine methyl nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2250</td>
			<td>Make 10X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart system 3.0</td>
			<td>Panlab</td>
			<td></td>
			<td>Video tracking system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopwatch</td>
			<td>Junso</td>
			<td>JS-307</td>
			<td>For the measurement of explorative activities of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>For cryoprotection of tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>terbutaline hemisulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2528</td>
			<td>Make 10X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video camera (CCD camera)</td>
			<td>Vision</td>
			<td>VCE56HQ-12</td>
			<td>Place the camera directly overhead of the open field box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer korea</td>
			<td>KR10381</td>
			<td>Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1307</td>
			<td>For Cresyl violet staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of memory function in pilocarpine-induced epileptic mice

인지 장애는 측두엽 간질에서 가장 흔한 동반기능 중 하나입니다. 간질의 동물 모델에서 간질 관련 인지 감소를 재현하기 위해, 우리는 필로카핀 처리 만성 간질 마우스를 생성했다. 우리는 이 간질 마우스를 사용하여 3개의 다른 행동 시험을 위한 프로토콜을 제시합니다: 새로운 객체 위치 (NL), 새로운 객체 인식 (NO), 및 패턴 분리 (PS) 시험은 장소, 객체 및 문맥에 대한 학습 및 기억을 각각 평가하기 위하여. 우리는 동물의 기저 운동 활동을 측정하는 개방 필드 테스트에 따라 행동 장치를 설정하고 NL, NO 및 PS 테스트에 대한 실험 절차를 제공하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 간질 마우스에 있는 기억 기능을 평가하기 위한 그밖 행동 시험에 관하여 NL, NO 및 PS 시험의 기술적인 이점을 기술합니다. 마지막으로, 우리는 성공적인 메모리 테스트를위한 중요한 단계인 친숙한 세션 동안 개체와 30 초의 좋은 접촉을하지 못하는 간질 마우스에 대한 가능한 원인과 해결책을 논의합니다. 따라서, 이 프로토콜은 마우스를 사용하여 간질 관련 기억 손상을 평가하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공합니다. NL, NO 및 PS 시험은 간질 마우스에 있는 기억의 다른 종류의 평가에 적합한 간단하고 능률적인 분석입니다.

인지 기능 평가를 위한 일반적인 실험 일정 및 설정은 그림 1에나와 있습니다. 필로카핀-유도 급성 발작의 도입 6주 후, 마우스는 시험 사이의 3일 휴식 기간에 의해 분리된 순서로 NL, NO 및 PS 시험을 실시하였다(도1A). NL 테스트의 경우 친숙한 세션(F1) 동안 두 개의 동일한 개체가 열린 필드에 배치되었고 다음 날 한 개체가 새 위치로 이동되었습니다. NO ?...

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Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

이 문서는 필로카핀 유도 간질 마우스에 있는 기억 손상을 평가하기 위한 실험적인 절차를 제출합니다. 이 프로토콜은 간질에 있는 일반적인 comorbidities의 한개인 간질 관련한 인식 쇠퇴의 병리생리학 기계장치를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

필로카핀 유도 간질 마우스에 있는 기억 기능의 평가

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...

인지 장애는 측두엽 간질에서 가장 흔한 공동 이환율 중 하나입니다. 만성 간질의 마우스 모델을 사용하여 메모리 장애를 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜을 발표할 것입니다. 새로운 물체 위치, 새로운 물체 인식 및 패턴 분리 테스트는 동물을 최소한으로 스트레스를 할 수있는 간단하고 짧은 내구입니다.그것은 간질 마우스에 있는 기억 기능을 평가하기 위한 이 시험을 최적입니다, 자발적인 재발성 포착을 위한 추가 트리거 없이. 우선, 적어도 30 분 동안, 자신의 집 케이지에서 낮은 빛에 동물을 적응. 열린 필드 박스를 준비합니다.오픈 필드 박스의 중앙에 습관, 장소 및 조명계의 첫 날에. 그리고 60 Lux로 조도를 조정합니다. 각 마우스의 운동 활동을 평가하려면 동물 행동 비디오 추적 소프트웨어를 사용합니다.비디오 추적 소프트웨어가 열리면 열린 필드 상자의 크기를 보정합니다. 그런 다음 실험을 하는 마우스를 벽을 향한 열린 필드 박스에 부드럽게 놓습니다. 스마트 프로그램을 열고 사용자 지정을 클릭하고 수락합니다.이미지 소스를 클릭합니다. 설치된 카메라를 선택한 후 설정 버튼을 누릅니다. 카메라 해상도를 조정하고 누르고 수락합니다.교정을 클릭한 후 컴퓨터 마우스를 드래그하여 상자 크기에 맞게 합니다. 그리고 내부 상자 크기를 채웁니다. 영역 정의를 클릭하여 각 상자 크기를 저장하고 조정한 다음 저장을 클릭합니다.빨간색 상자는 추적 된 범위이므로 내부 상자 크기에 맞고 분홍색 상자는 윤곽선에 맞습니다. 프레스 감지 설정. 스냅샷을 클릭하고 테스트를 시작하여 특정 영역이 추적되었는지 확인한 다음 테스트를 중지한 다음 수락합니다.시간 설정을 클릭합니다. 사전 설정 시간을 선택한 후 3초 에 3초 획득 시간을 15분으로 설정하고 수락을 누릅니다. 피사체를 눌러 코드명을 설정합니다.스케줄러를 클릭하여 기존 세부 정보를 삭제하고 주제에서 수정된 코드 이름을 세션 1로 드래그합니다. 데이터 수집을 클릭합니다. 레코드 버튼을 클릭하고 시작을 클릭합니다.상자에 마우스를 넣고 15 분 동안 추적합니다. 기록 15 분 후 홈 케이지에 마우스를 반환합니다. 밝은 빛을 복원합니다.데이터 수집을 클릭합니다. 그런 다음 활성 해석 드래그 코드 이름 Sham을 옆 창으로 클릭합니다. 보고서 정의 버튼을 클릭합니다.새 보고서 정의 버튼을 클릭한 다음 요약 보고서 및 수락을 누릅니다. 영역의 제목 이름과 거리를 클릭하고 옆으로 보냅니다. 그런 다음 수락 버튼을 누릅니다.빨간색 확인 표시를 클릭하고 분석을 클릭합니다. 결과를 확인합니다. 둘째 날과 셋째 날에는 습관 세션을 반복합니다.4일째에는 친숙한 세션을 수행합니다. 희미한 빛에 각 마우스를 빈 열린 필드에 3분간 배치합니다. 이 짧은 습관 후 집 케이지에 동물을 반환합니다.인접한 벽에서 5센티미터 떨어진 열린 들판 경기장에 고무 인형 두 개를 놓습니다. 양면 테이프로 물체를 수정합니다. 실험 마우스를 오브젝트에서 가장 멀리 떨어진 벽을 향한 열린 필드 박스에 소개합니다.20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 개체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 동물 주아웃이 물체를 가리키지 않는 탐색시간, 어떤 동작으로도 정량화하지 마십시오. 마우스가 최소 탐색 시간을 30초에 도달하면 두 개체의 경우 F1 세션을 중지하고 마우스를 홈 케이지로 옮춥시다.마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 마우스를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다. 5일째에는 새 개체 위치 테스트 세션을 수행합니다. 마우스를 3분 동안 재활을 위해 마우스를 열린 필드 영역으로 옮기습니다.그런 다음 홈 케이지로 돌아갑니다. 하나의 오브젝트를 대각선 위치로 이동하고 실험마우스가 열린 필드 상자의 벽을 향하도록 배치합니다. 비디오 추적 시스템으로 10분 동안 무료 탐색및 녹화를 허용합니다.측정, 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 개체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정합니다. 다음으로 꼬리를 잡고 마우스를 홈 케이지로 옮습니다. 3 일 동안 마우스가 음식과 물에 무료로 액세스 할 수 있도록 하십시오.9일째에는 마우스 1개로 15분 간의 습관 세션을 진행합니다. 10일에는 3분간 간단한 재활 세션을 진행합니다. 그런 다음 일시적으로 홈 케이지로 돌아갑니다.인접한 벽에서 5센티미터 떨어진 오픈 필드에 40밀리리터의 물로 채워진 50밀리리터 플라스틱 튜브 두 개를 동일한 물체 두 개를 놓습니다. 실험용 마우스를 열린 필드 박스에 도입하여 오브젝트에서 가장 멀리 있는 벽을 향합니다. 마우스가 NO Test의 두 가지 다른 물체에 노출됨에 따라 40 밀리리터의 물로 채워진 50 밀리리터 플라스틱 튜브와 코플린 항아리 병이 있습니다.친숙한 세션 동안 물체의 균형을 맞추기 위해, 그룹 내 동물의 절반에 대해 두 개의 동일한 물체인 유리 코플린 항아리항아리를 제시한다. 그런 다음 두 개의 서로 다른 개체를 사용하면 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 개체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 만료 시간에 도달하면 익숙한 세션을 중지합니다.다음 날, 새로운 객체 인식 테스트 세션을 수행합니다. 먼저, 재활을 위해 마우스를 열린 필드로 옮은 다음 홈 케이지로 되돌려 놓습니다. 인접한 벽에서 5센티미터 떨어진 곳에 튜브를 코플린 항아리로 교체하여 마우스가 하나의 튜브와 하나의 유리 코플린 항아리항아리에 노출되도록 합니다.첫 번째 친숙한 세션 동안 유리 코플린 항아리항아리에 노출된 동물의 절반은 40밀리리터의 물로 채워진 50밀리리터 플라스틱 튜브로 유리 코플린 항아리 항아리를 교체하십시오. 마우스가 하나의 튜브와 하나의 유리 코플린 항아리항아리에 노출되도록합니다. 비디오 추적 시스템을 사용하여 녹화하는 동안 10분 동안 무료 탐색을 허용합니다.그런 다음 실험 용 마우스의 꼬리를 잡고 홈 케이지로 옮습니다. 3 일 동안 마우스가 음식과 물에 무료로 액세스 할 수 있도록 하십시오. NL 분석을 위해 시작 프로그램 사용자 지정 및 수락을 엽니다.이미지 소스를 클릭합니다. 설치된 카메라를 선택한 후 설정 버튼을 누릅니다. 그냥 카메라 해상도 및 눌러 수락.비디오 열기 폴더 버튼을 클릭하여 저장된 비디오를 엽니다. 저장된 비디오를 마우스가 입력한 시간으로부터 10분 동안 시청하고 각 개체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정합니다. 15일 PS 테스트에 대한 첫 번째 친숙한 세션을 처음 수행했습니다.즉, 3 분 동안 재활을위한 열린 필드 영역에 마우스입니다. 바닥 플레이트에 와이드 그리드와 두 개의 동일한 오브젝트를 배치합니다. 플라스틱 T 플라스크는 오픈 필드 박스에 50 밀리리터의 물로 가득 합니다.그런 다음 실험용 마우스를 오브젝트에서 가장 멀리 떨어진 벽을 향한 열린 필드 박스에 도입했습니다. 20분 동안 무료 탐험을 허용하십시오. 또한 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 개체를 탐색하는 데 소요되는 시간을 수동으로 측정합니다.마우스가 두 오브젝트의 최소 탐색 시간에 도달하면 첫 번째 친숙한 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮춥니까. 동물의 절반에 대한 물체와 패턴 분리 테스트의 균형을 맞추기 위해 바닥판을 넓은 그리드와 두 개의 동일한 물체, 개방형 필드 박스에 카운터 밸런싱 실험을 위한 유리 병을 배치한다. 그런 다음 실험용 마우스를 열린 필드 박스에 소개하고 20분 동안 무료 탐색을 허용합니다.마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간에 도달하면 첫 번째 친숙한 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮춥니까. 다음 날, 3 분 동안 재활을 위해 필드 영역으로 마우스를 전송합니다. 그리고 홈 케이지로 돌아갑니다.다음으로 좁은 그리드 바닥에 두 개의 유리 병으로 두 번째 친숙한 세션을 수행합니다. 카운터밸런싱 실험을 위해 좁은 그리드 바닥에 물이 채워진 두 개의 T 플라스크로 두 번째 친숙한 세션을 수행합니다. 다음 날에는 패턴 분리 테스트 세션을 수행합니다.마우스를 3분 동안 재활을 위한 개체가 없는 열린 필드 영역으로 전송합니다. 그리고 홈 케이지로 돌아갑니다. 다음으로, 좁은 그리드 바닥에 물과 유리 병으로 채워진 T 플라스크를 놓습니다.T 플라스크를 물로 가득 채우게 하여 새로운 물체로 만듭니다. 카운터밸런싱 실험을 위해 각 오브젝트를 좁은 그리드 바닥에 배치하여 유리 병을 이 경우 새 개체로 만듭니다. 그런 다음 실험용 마우스를 10분 동안 열린 필드 영역으로 탐색합니다.비디오 추적 시스템을 사용하여 10분 동안 무료 탐색 및 녹화를 허용합니다. 실험 용 마우스의 꼬리를 잡고 홈 케이지로 옮습니다. 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 개체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정합니다.그리고 두 객체를 탐색하는 총 시간으로 나눈 새 개체와 친숙한 개체 간의 소요 시간의 차이와 동일한 차별 비율을 계산합니다. 필로카핀의 도입 후 6 주 급성 발작을 유도. 마우스는 새로운 개체 위치 테스트를 받게 됩니다.새로운 개체 인식 테스트 및 패턴 분리 테스트. 그 순서에서 테스트 사이에 3 일 휴식 기간에 의해 분리. 함께 제시된 두 개체 사이에는 상당한 선호도가 없는 것으로 확인되었습니다.간질 마우스는 Sham 대조군과 비교하여 3가지 테스트에서 차별 비율에서 상당한 감소를 보였다. 공간 메모리 장애를 입증합니다. 운동 활동의 측정은 간질 동물의 상당한 증가를 보였다.물체를 탐구하는 동기는 샴과 간질 동물 과 비교할 수 있었습니다. 마지막으로 해마 세포 사멸은 필로카르핀 유도 된 상태 간질 후 결정 보라색 염색을 사용하여 발작 유도 신경 손상을 확인 하였다. 필로카핀 처리 동물은 샴 컨트롤과 달리 해마의 CA3 하위 필드에 있는 pyknotic 세포및 pyknotic 세포에 입증했습니다.NO 및 PS 테스트에서 카운트업하는 것은 이 장치 특정 개체에서 가능한 고유의 바이어스를 줄이는 데 중요합니다. 또한 만성 간질 마우스 오픈 쇼 고조 불안, 실험 설정에 충분 한 찬사 국가에 대 한 여러 습관 단계를 필요로 하는. 프로토콜의 개체 수 또는 위치와 같은 시간 수정은 메모리 테스트를 제공할 수 있습니다.이는 인지 기능 저하와 관련된 간질의 정교한 복잡한 메커니즘에 유용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청 한 후 간질에서 기억 장애의 다른 측면을 평가하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.

Research

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연구

행동분석학

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