Name: assessment of memory function in pilocarpine-induced epileptic mice
Uploaded: 2020-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Jae-Min Lee por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la National Research Foundation of Korea (NRF) financiadas por el gobierno de Corea (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad Católica de Corea y se llevaron a cabo de conformidad con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publications No. 80-23).
1. Prueba de ubicación de objetos novedosos (NL)
<ol><li>Preparar ratones epilépticos C57BL/6 o transgénicos 4–6 semanas después de la inyección de pilocarpina. NOTA: Las convulsiones agudas fueron ind...

Este trabajo describe procedimientos experimentales para evaluar la función cognitiva en ratones con epilepsia crónica. Muchos paradigmas de prueba de comportamiento diferentes se utilizan para evaluar las funciones de aprendizaje y memoria en ratones18. El laberinto de agua Morris, el laberinto de brazos radiales, el laberinto Y, el acondicionamiento contextual del miedo y las pruebas basadas en objetos son las pruebas de comportamiento más utilizadas y proporcionan resultados confiables. Entr...

La epilepsia es un trastorno crónico caracterizado por convulsiones recurrentes espontáneas1,,2,,3. Debido a que las convulsiones repetitivas pueden causar anomalías estructurales y funcionales en el cerebro1,2,3, la actividad convulsiva anormal puede contribuir a la disfunción cognitiva, que es una de las comorbilidades asociadas a la epilepsia más comunes4,5,6. Contrariamente a los eventos de convulsiones crónicas, que son transitorios y momentáneos, los deterioros cognitivos pueden persistir a lo largo de la vida de los pacientes epilépticos, deteriorando su calidad de vida. Por lo tanto, es importante entender los mecanismos fisiofitosiológicos del deterioro cognitivo asociado a la epilepsia.
Se han utilizado varios modelos animales experimentales de epilepsia para demostrar los déficits de aprendizaje y memoria asociados con la epilepsia crónica7,8,9,10,11,12. Por ejemplo, el laberinto de agua de Morris, el acondicionamiento contextual del miedo, el tablero de agujeros, la localización de objetos novedosos (NL) y las pruebas de reconocimiento de objetos novedosos (NO) se han utilizado con frecuencia para evaluar la disfunción de la memoria en la epilepsia del lóbulo temporal (TLE). Debido a que el hipocampo es una de las regiones primarias en las que TLE muestra patología, las pruebas conductuales que pueden evaluar la función de memoria dependiente del hipocampo a menudo se seleccionan preferentemente. Sin embargo, dado que las convulsiones pueden inducir neurogénesis hipocampal aberrante y contribuir al deterioro cognitivo asociado a la epilepsia10,los paradigmas conductuales para probar la función neuronal del recién nacido dengunato (es decir, la separación del patrón espacial, PS)8,,13 también pueden proporcionar información valiosa sobre los mecanismos celulares de las deficiencias de memoria en la epilepsia.
En este artículo, demostramos una batería de pruebas de memoria, NL, NO y PS, para ratones epilépticos. Las pruebas son simples y de fácil acceso y no requieren un sistema sofisticado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Sung-shim</td>
			<td></td>
			<td>Use with the 26 or 30 gauge needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Spray to clean the box and objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black curtain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For avoiding unnecessary visual cues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5042</td>
			<td>For Cresyl violet staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>E21040041</td>
			<td>For tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided sticky tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the firm placement of the objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol series</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>floor plate with narrow grid patterns</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>floor plate with wide grid patterns</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illuminometer</td>
			<td>TES Electrical Electronic Corp.</td>
			<td>1334A</td>
			<td>For the measurement of the room lighting (60 Lux)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensive care unit</td>
			<td>Thermocare</td>
			<td>#W-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine hydrochloride</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>7003</td>
			<td>Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp</td>
			<td>Lungo</td>
			<td>P13A-0422-WW-04</td>
			<td>Lighting for the behavioral test room</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objects</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>open field box</td>
			<td>Leehyo-bio</td>
			<td></td>
			<td>Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper towel</td>
			<td>Yuhan-Kimberly</td>
			<td>47201</td>
			<td>Use to dry open field box and objects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>104005</td>
			<td>Make 4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pilocarpine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ruler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to locate the objects in the open field box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scopolamine methyl nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2250</td>
			<td>Make 10X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart system 3.0</td>
			<td>Panlab</td>
			<td></td>
			<td>Video tracking system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopwatch</td>
			<td>Junso</td>
			<td>JS-307</td>
			<td>For the measurement of explorative activities of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td>For cryoprotection of tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>terbutaline hemisulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2528</td>
			<td>Make 10X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video camera (CCD camera)</td>
			<td>Vision</td>
			<td>VCE56HQ-12</td>
			<td>Place the camera directly overhead of the open field box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer korea</td>
			<td>KR10381</td>
			<td>Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>UN1307</td>
			<td>For Cresyl violet staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of memory function in pilocarpine-induced epileptic mice

El deterioro cognitivo es una de las comorbilidades más comunes en la epilepsia del lóbulo temporal. Para recapitular el deterioro cognitivo asociado a la epilepsia en un modelo animal de epilepsia, generamos ratones epilépticos crónicos tratados con pilocarpina. Presentamos un protocolo para tres pruebas de comportamiento diferentes utilizando estos ratones epilépticos: localización de objetos nuevos (NL), reconocimiento de objetos nuevos (NO) y pruebas de separación de patrones (PS) para evaluar el aprendizaje y la memoria de lugares, objetos y contextos, respectivamente. Explicamos cómo configurar el aparato conductual y proporcionar procedimientos experimentales para las pruebas NL, NO y PS después de una prueba de campo abierto que mide las actividades de locomotora basal de los animales. También describimos las ventajas técnicas de las pruebas NL, NO y PS con respecto a otras pruebas de comportamiento para evaluar la función de la memoria en ratones epilépticos. Por último, analizamos las posibles causas y soluciones para que los ratones epilépticos no puedan hacer 30 s de buen contacto con los objetos durante las sesiones de familiarización, lo que es un paso crítico para las pruebas de memoria exitosas. Por lo tanto, este protocolo proporciona información detallada sobre cómo evaluar las deficiencias de memoria asociadas a la epilepsia mediante ratones. Las pruebas NL, NO y PS son ensayos simples y eficientes que son apropiados para la evaluación de diferentes tipos de memoria en ratones epilépticos.

En la Figura 1se muestra un cronograma experimental general y una configuración para evaluar la función cognitiva. Seis semanas después de la introducción de las convulsiones agudas inducidas por la pilocarpina, los ratones fueron sometidos a las pruebas de NL, NO y PS en ese orden separados por períodos de descanso de 3 días entre las pruebas (Figura 1A). Para la prueba NL, se colocaron dos objetos idénticos en el campo abierto durante la sesión de fami...

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Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Este artículo presenta procedimientos experimentales para evaluar las deficiencias de memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina. Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos fisiofitosiológicos del deterioro cognitivo asociado a la epilepsia, que es una de las comorbilidades más comunes en la epilepsia.

Evaluación de la función de la memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...

El deterioro cognitivo es una de las co-morbilidades más comunes en la epilepsia del lóbulo temporal. Presentaremos un protocolo que describe cómo evaluar el deterioro de la memoria utilizando un modelo de ratón de epilepsia crónica. La ubicación de objetos novedosos, el reconocimiento de objetos novedosos y la prueba de separación de patrones son simples y cortos que pueden enfatizar mínimamente a los animales.Hace que esta prueba sea óptima para evaluar la función de la memoria en ratones epilépticos, sin desencadenantes adicionales para convulsiones recurrentes espontáneas. Para empezar, aclimatar a los animales a la luz baja en sus jaulas de origen, durante al menos 30 minutos. Prepare un cuadro de campo abierto.En el primer día de la habituación, coloque e ilusómetro en el centro de la caja de campo abierto. Y ajusta la iluminancia a 60 Lux. Para evaluar la actividad locomotora de cada ratón, utilice el software de seguimiento de vídeo de comportamiento animal.Una vez abierto el software de seguimiento de vídeo, calibre el tamaño de la caja de campo abierto. A continuación, coloque suavemente un ratón experimental en la caja de campo abierto frente a la pared. Abra el programa inteligente, haga clic en Personalizado y Aceptar.Haga clic en Origen de la imagen. Después de seleccionar la cámara instalada, pulse el botón Establecer. Ajuste la resolución de la cámara y pulse Aceptar.Después de nuestro clic de calibración, arrastre el ratón del ordenador para que se ajuste al tamaño de la caja. Y rellene el tamaño de la caja interior. Haga clic en Definición de zona para guardar y ajustar cada tamaño de cuadro y, a continuación, haga clic en Guardar.La caja roja es el rango rastreado, por lo que cabe en el tamaño de la caja interior, mientras que la caja rosa se ajusta al contorno. Ajuste de detección de prensa. Haga clic en Instantánea y presione Iniciar prueba para comprobar si se realiza el seguimiento de un área específica, a continuación, pres Detener prueba y, a continuación, Aceptar.Haga clic en Configuración de tiempo. Después de seleccionar el tiempo preestablecido, establezca el tiempo de latencia, en tres segundos de tiempo de adquisición a 15 minutos y pulse Aceptar. Presione Subjectos para establecer el nombre en clave.Haga clic en Programador para eliminar los detalles existentes y arrastre el nombre de código modificado en los temas a la primera sesión. Haga clic en Adquisición de datos. Haga clic en el botón Grabar y haga clic en Inicio.Coloque el ratón en la caja y rastree durante 15 minutos. Después de 15 minutos de grabación, devuelva el ratón a su jaula de origen. Restaure la luz brillante.Haga clic en Adquisición de datos. Y luego haz clic Análisis Activo Arrastrar nombre de código Sham a la ventana al lado de él. Haga clic en el botón Definiciones de informe.Haga clic en el botón Nuevas definiciones de informe y, a continuación, en Informe de resumen y pulse Aceptar. Haga clic en Nombre del sujeto y Distancia en la zona y envíelo a un lado. A continuación, pulse el botón Aceptar.Haga clic en la marca de verificación roja y haga clic en Analizar. Compruebe los resultados. En el segundo día, y el tercer día, repita las sesiones de habituación.En el cuarto día, realice la sesión de familiarización. En la luz tenue, coloque cada ratón en el campo abierto vacío durante tres minutos. Después de esta breve habituación devolver el animal a su jaula de origen.Coloque dos objetos idénticos, muñecas de goma, en la arena de campo abierto, a cinco centímetros de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental, en la caja de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos.Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. No cuantificar como tiempo exploratorio, ningún comportamiento, en el que el hocico del animal no apunta hacia el objeto. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración de 30 segundos, para los dos objetos, detenga la sesión de F1 y transfiera el ratón a su jaula de inicio.Si el mouse no puede explorar los objetos durante 30 segundos en los 20 minutos, quite el mouse del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones. En el día cinco, realice la sesión de prueba de ubicación de objetos novedosos. Transfiera el ratón al área de campo abierto para su rehabilitación durante tres minutos.Entonces devuélvelo a su jaula de casa. Mueva un objeto a la posición diagonal y coloque el ratón experimental frente a la pared del cuadro de campo abierto. Permita 10 minutos de exploración y grabación gratuita con un sistema de seguimiento de vídeo.Mida, el tiempo dedicado a explorar cada objeto, utilizando dos cronómetros. A continuación, transfiera el ratón a su jaula de inicio, agarrando la cola. Durante tres días, deje reposar el ratón con acceso gratuito a alimentos y agua.En el día nueve realizar una sesión de habituación de 15 minutos, para un ratón. El día 10 realizar la breve sesión de rehabilitación, durante tres minutos. Luego devuélvelo temporalmente a su jaula de casa.Coloque dos objetos idénticos, tubos de plástico de 50 mililitros llenos de 40 mililitros de agua, en el campo abierto, a cinco centímetros de las paredes adyacentes. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto, frente a la pared más alejada de los objetos. Como el ratón se expondrá a los dos objetos diferentes en la prueba NO, un tubo de plástico de 50 mililitros lleno de 40 mililitros de agua, y un frasco de tarros Coplin de vidrio.Contrapesar el objeto durante la sesión de familiarización, presentando dos objetos idénticos, frascos de vidrio Coplin, para la mitad de los animales del grupo. A continuación, con dos objetos diferentes, permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo de expiración mínimo de 30 segundos para ambos objetos, detenga la sesión de familiarización.Al día siguiente, realice la nueva sesión de prueba de reconocimiento de objetos. Primero, transfiera el ratón al campo abierto para la rehabilitación, durante tres minutos, y luego devuélvalo a su jaula de origen. A cinco centímetros de distancia de las paredes adyacentes, reemplace el tubo con un frasco de vidrio de Coplin, de modo que los ratones estén expuestos a un tubo y un frasco de tarros coplin de vidrio.Para la mitad de los animales que estuvieron expuestos a frascos de vidrio Coplin durante la primera sesión de familiarización, reemplace el frasco de tarros de vidrio Coplin por un tubo de plástico de 50 mililitros lleno de 40 mililitros de agua. Para que los ratones estén expuestos a un tubo y un frasco de tarros coplin de vidrio. Permita 10 minutos de exploración gratuita mientras lo graba utilizando un sistema de seguimiento de vídeo.A continuación, agarre la cola del ratón experimental, y transferirlo a su jaula de casa. Durante tres días y dejar reposar el ratón con acceso gratuito a alimentos y agua. Para el análisis NL, abra Iniciar programa personalizado y Aceptar.Haga clic en Origen de la imagen. Después de seleccionar la cámara instalada, pulse el botón Establecer. Sólo la resolución de la cámara y pulse Aceptar.Haga clic en el botón Abrir carpeta de vídeos para abrir el vídeo guardado. Vea el vídeo guardado durante 10 minutos desde el momento en que entra el ratón y mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto. El día 15 realizó por primera vez la primera sesión de familiarización para la prueba PS.Eso es para el ratón a la zona de campo abierto para la rehabilitación, por tres minutos. Coloque la placa de suelo con la rejilla ancha y dos objetos idénticos. Frascos T de plástico llenos de 50 mililitros de agua, en la caja de campo abierto.A continuación, introdujo el ratón experimental en la caja de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos. Permita la exploración gratuita durante 20 minutos. Y mida manualmente el tiempo que pasa explorando ambos objetos usando dos cronómetros.Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración de 30 segundos para ambos objetos, detenga la primera sesión de familiarización y transfiera al animal a su jaula de origen. Para contrarrestar la prueba de separación de objetos y patrones para la mitad de los animales coloque la placa de suelo con la rejilla ancha y dos objetos idénticos, botellas de vidrio para el experimento de contrapeso en la caja de campo abierto. A continuación, introduzca el ratón experimental en la caja de campo abierto y permita la exploración gratuita durante 20 minutos.Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración de 30 segundos para los dos objetos, detenga la primera sesión de familiarización y transfiera al animal a su jaula de origen. Al día siguiente, transfiera el ratón al área de campo para su rehabilitación durante tres minutos. Y luego devuélvelo a su jaula de casa.A continuación, realice la segunda sesión de familiarización con dos botellas de vidrio en el estrecho suelo de rejilla. Para los experimentos de contrapeso, realice la segunda sesión de familiarización con dos frascos en T llenos de agua en un suelo de rejilla estrecho. Al día siguiente, realice la sesión de prueba de separación de patrones.Transfiera el ratón al área de campo abierto sin objeto para la rehabilitación durante tres minutos. Y luego devuélvelo a su jaula de casa. A continuación, coloque el matraz T lleno de agua y una botella de vidrio en el estrecho suelo de la rejilla.Hacer los frascos T llenos de agua, en objeto novedoso. Para experimentos de contrapeso, coloque cada objeto en el piso estrecho de la rejilla para hacer de la botella de vidrio un objeto novedoso en este caso. A continuación, para el ratón experimental a la zona de campo abierto durante 10 minutos para explorar.Permita 10 minutos de exploración y grabación gratuitas utilizando un sistema de seguimiento de vídeo. Coge la cola del ratón experimental y transfiételo a su jaula de origen. Mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando dos cronómetros.Y calcular la relación de discriminación que equivale a la diferencia de tiempo pasado entre el objeto novedoso y el objeto familiar dividido por el tiempo total explorando los dos objetos. Seis semanas después de la introducción de la pilocarpina inducida convulsiones agudas. Los ratones se someterán a la prueba de localización de objetos novedosos.Prueba de reconocimiento de objetos novedosa y prueba de separación de patrones. En ese orden separados por períodos de descanso de tres días entre pruebas. Se confirmó que no había una preferencia significativa entre los dos objetos presentados juntos.Los ratones epilépticos mostraron una reducción significativa.en la relación de discriminación en las tres pruebas en comparación con los controles de Sham. Demostración de deterioro de la memoria espacial. La medición de la actividad locomotora, mostró un aumento significativo en animales epilépticos.Mientras que la motivación para explorar los objetos era comparable entre Sham y los animales epilépticos. Finalmente se evaluó la muerte de la célula hipocampal después de un estado epiléptico inducido por pilocarpina utilizando tinción violeta cristalina para confirmar el daño neuronal inducido por la convulsión. Los animales tratados con pilocarpina demostraron células piknóticas en el subcampo CA3 del hipocampo, a diferencia de los controles Sham.Contar en pruebas DE NO y PS es fundamental para reducir el sesgo inherente posible en este dispositivo objetos específicos. Además, los ratones epilépticos crónicos abiertos muestran una mayor ansiedad, que requiere múltiples pasos de habituación para la suficiente aclamación de la nación a los entornos experimentales. las modificaciones de tiempo como el número o la ubicación de los objetos en nuestro protocolo pueden proporcionar las pruebas de memoria.Que puede ser útil para elaborar mecanismos complejos de epilepsia asociados con el deterioro cognitivo. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo evaluar diferentes aspectos del deterioro de la memoria en la epilepsia.

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