Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل زمالة دويتشه فورشونججماينشافت للأبحاث (GO 3060/1-1، رقم المشروع 401540516، إلى DG) والمعاهد الوطنية للصحة منحة R56 DC016880 (MTR).

الحصول على موافقة لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية واستخدامها والالتزام بإرشادات المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات في هذا البروتوكول من قبل جامعة ميشيغان IACUC وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخ?...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

لقد وجدنا أن CRACM هو تقنية قوية لتحديد ووصف المدخلات متشابك المدى الطويل إلى الخلايا العصبية في IC الماوس. بعد البروتوكول المفصل هنا ، حققنا نقل قوي للخلايا العصبية في DCN و IC بالإضافة إلى الاتجار المحوري الموثوق به من Chronos و ChrimsonR إلى المحطات المتشابكة في IC. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا أن هذه الت?...

اتصالات متشابك ة حاسمة لوظيفة الدائرة العصبية، ولكن طوبولوجيا دقيقة وعلم وظائف الأعضاء من نقاط الاشتباك العصبي داخل الدوائر العصبية غالبا ما يكون من الصعب التحقيق تجريبيا. وذلك لأن التحفيز الكهربائي ، الأداة التقليدية للفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية ، ينشط بشكل عشوائي محاور عصبية بالقرب من موقع التحفيز ، وفي معظم مناطق الدماغ ، تتشابك المحاور من مصادر مختلفة (محلية ، تصاعدية ، و / أو تنازلية). ومع ذلك ، باستخدام channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر (CRACM)1،2، يمكن الآن التغلب على هذا القيد3. Channelrhodopsin (ChR2) هو ضوء تنشيط, قناة أيون انتقائية الميشن وجدت أصلا في الأخضر الغا Chlamydomonas reinhardtii. يمكن تنشيط ChR2 بواسطة الضوء الأزرق من الطول الموجي حول 450-490 نانومتر، وإزالة الاستقطاب الخلية من خلال تدفق التكيّف. تم وصف ChR2 لأول مرة وأعرب عنها في البويضات Xenopus من قبل ناجيل وزملاؤه4. بعد ذلك بوقت قصير، أعرب بويدن وزملاؤه5 ChR2 في الخلايا العصبية الثديية وأظهرت أنها يمكن أن تستخدم نبضات الضوء للسيطرة بشكل موثوق على spiking على مقياس زمني ميلي ثانية، مما أدى إلى إمكانات العمل ~ 10 مللي بعد تفعيل ChR2 مع الضوء الأزرق. تم العثور على قنوات البوجينية مع حركية أسرع في الآونة الأخيرة (على سبيل المثال ، Chronos6).
النهج الأساسي لتجربة CRACM هو نقل مجموعة من الخلايا العصبية presynaptic المفترضة مع فيروس الأدينو المرتبطة بالمؤتلف (rAAV) الذي يحمل المعلومات الوراثية لقناة rhorhodopsin. Transfection من الخلايا العصبية مع rAAV يؤدي إلى التعبير عن channelrhodopsin المشفرة. عادة، يتم وضع علامة channelrhodopsin مع بروتين الفلورسنت مثل GFP (البروتين الفلورسنت الأخضر) أو tdTomato (بروتين الفلورسنت الأحمر)، بحيث يمكن بسهولة أن يتم تأكيد transfection من الخلايا العصبية في المنطقة المستهدفة مع التصوير الفلوري. لأن rAAVs غير المسببة للأمراض، لديها إمكانات التهابية منخفضة وطويلة الأمد التعبير الجيني7،8، أصبحت تقنية قياسية لتسليم channelrhodopsins إلى الخلايا العصبية. إذا، بعد نقل السكان presynaptic المفترضة من الخلايا العصبية، وتفعيل channelrhodopsin من خلال ومضات الضوء يثير الإمكانات أو التيارات postynaptic في الخلايا العصبية المستهدفة، وهذا هو دليل على اتصال محور عصبي من النواة المنقولة إلى الخلية المسجلة. لأن محاور عصبية مقطوعة في تجارب شريحة الدماغ يمكن أن تكون مدفوعة لإطلاق الناقل العصبي من خلال تنشيط channelrhodopsin, يمكن التعرف على النوى التي تقع خارج شريحة حادة ولكن إرسال محاور عصبية في منطقة الدماغ postynaptic مع CRACM. قوة هذه التقنية هو أن الاتصال وعلم وظائف الأعضاء من المدخلات متشابك المدى الطويل المحدد يمكن التحقيق مباشرة.
بالإضافة إلى channelrhodopsins التي هي منفعل من الضوء الأزرق، وقد حددت المحققين مؤخرا العديد من channelrhodopsins الأحمر تحول9،10، بما في ذلك Chrimson وأسرع ChrimsonR التناظرية، وكلاهما متحمس مع الضوء الأحمر من ~ 660 نانومتر6. الأوبسينات الحمراء المتحولة هي ذات فائدة لأن الضوء الأحمر يخترق الأنسجة أفضل من الضوء الأزرق ، والضوء الأحمر قد يكون له سمية سيتانية أقل من الضوء الأزرق10،11،12. قناة حمراء تحول أيضا فتح إمكانية تجارب CRACM اللون المزدوج، حيث يمكن اختبار التقارب بين محاور عصبية من نوى مختلفة على نفس الخلايا العصبية في تجربة واحدة6،13،14. ومع ذلك ، فإن opsins الحالية ذات التحول الأحمر غالبًا ما تعرض تنشيطًا متقاطعًا غير مرغوب فيه مع الضوء الأزرق15،16،17، مما يجعل تجربتين لونيتين صعبتين. وبالإضافة إلى ذلك، أشارت بعض التقارير إلى أن ChrimsonR يخضع للاتجار المحوري محدودة، والتي يمكن أن تجعل من الصعب استخدام ChrimsonR لتجارب CRACM16،17.
تقريبا جميع التوقعات التصاعدية من نواة جذع الدماغ السمعي السفلي تتلاقى في الكوليكولوس السفلي (IC)، محور منتصف الدماغ للمسار السمعي المركزي. وهذا يشمل الإسقاطات من نواة القوقعة (CN)18،19، معظم مجمع القلة العليا (SOC)20، والظهرية (DNLL) والبطنية (VNLL) نواة lemniscus الجانبية21. بالإضافة إلى ذلك، إسقاط تنازلي كبير من القشرة السمعية ينتهي في IC18،19،21،22،والخلايا العصبية IC أنفسهم متشابكة على نطاق واسع داخل الفصوص المحلية ومضادة للIC23. وقد جعل اختلاط المحاور من مصادر عديدة من الصعب التحقيق الدوائر IC باستخدام التحفيز الكهربائي24. ونتيجة لذلك، على الرغم من الخلايا العصبية في IC أداء حسابات هامة لتوطين الصوت وتحديد الكلام والاتصالات الأخرى الأصوات25،26، وتنظيم الدوائر العصبية في IC غير معروف إلى حد كبير. لقد حددنا مؤخرًا الخلايا العصبية VIP كأول فئة عصبية يمكن تحديدها جزيئيًا في IC27. الخلايا العصبية VIP هي الخلايا العصبية ستيلاتي الجلوتامات التي مشروع إلى العديد من الأهداف بعيدة المدى, بما في ذلك المهاد السمعيو وcolliculus متفوقة. ونحن الآن قادرون على تحديد مصادر ووظيفة المدخلات المحلية وطويلة المدى للخلايا العصبية VIP وتحديد كيفية هذه الاتصالات الدائرة تسهم في معالجة الصوت.
البروتوكول المعروض هنا مصمم للتحقيق في المدخلات متشابك للخلايا العصبية VIP في IC من الفئران، وتحديدا من IC المعضدة وDCN(الشكل 1). يمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع مصادر مختلفة من المدخلات، نوع الخلايا العصبية المختلفة أو منطقة الدماغ مختلفة تماما. نظهر أيضا أن ChrimsonR هو قناة فعالة حمراء تحول rhodopsin لرسم خرائط الدوائر طويلة المدى في جذع الدماغ السمعي. ومع ذلك، نحن نثبت أن يتم تنشيط ChrimsonR بقوة من الضوء الأزرق، حتى في كثافة منخفضة، وبالتالي، للجمع بين ChrimsonR مع كرونوس في تجارب CRACM لونين، يجب استخدام ضوابط دقيقة لمنع التنشيط المتبادل من ChrimsonR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

عند التحقيق في الدوائر العصبية ، فإن القيد القياسي لنهج المشبك في المختبر هو أن المحاور من مصادر متعددة غالبًا ما تكون مختلطة ، مما يجعل من الصعب عزل المدخلات من المصادر الفردية مع التحفيز الكهربائي. ومع ذلك، باستخدام channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدائرة (CRACM)، يمكن الآن التغلب على هذا القيد. هنا، نبلغ عن طريقة لاستخدام CRACM لرسم خريطة المدخلات التصاعدية من نواة جذع الدماغ السمعي السفلي والمدخلات الجماعية إلى فئة محددة من الخلايا العصبية في الكوليكولوس السفلي (IC)، نواة الدماغ المتوسط للنظام السمعي. في IC ، تكون المحاور المحورية المحلية والمندوبية والصاعدة والتنازلية متشابكة بشكل كبير وبالتالي لا يمكن تمييزها مع التحفيز الكهربائي. عن طريق حقن بناء الفيروسية لدفع التعبير عن channelrhodopsin في نواة presynaptic، تليها تسجيل المشبك التصحيح لتوصيف وجود وعلم وظائف الأعضاء من المدخلات متشابك عبر channelrhodopsin، والإسقاطات من مصدر معين يمكن تعيين إلى مجموعة محددة من الخلايا العصبية IC مع دقة نوع الخلية محددة. نظهر أن هذا النهج يعمل مع كل من كرونوس، قناة زرقاء تنشيط الضوء، وChrimsonR، قناة حمراء تحول. على النقيض من التقارير السابقة من الدماغ الأمامي، نجد أن يتم الاتجار بقوة ChrimsonR أسفل محاور عصبية الخلايا العصبية الرئيسية نواة القوقعة الظهرية، مشيرا إلى أن ChrimsonR قد تكون أداة مفيدة لتجارب CRACM في جذع الدماغ. يتضمن البروتوكول المعروض هنا وصفًا تفصيليًا لجراحة حقن الفيروسات داخل الجمجمة ، بما في ذلك إحداثيات stereotaxic لاستهداف الحقن إلى نواة القوقعة الهروية وIC للفئران ، وكيفية الجمع بين تسجيل المشبك المشبك في الخلايا الكاملة مع تنشيط channelrhodopsin للتحقيق في التوقعات بعيدة المدى للخلايا العصبية IC. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم خصيصًا لتوصيف المدخلات السمعية للIC ، إلا أنه يمكن تكييفه بسهولة للتحقيق في الإسقاطات الأخرى طويلة المدى في جذع الدماغ السمعي وما بعده.

عبرنا فئران VIP-IRES-Cre(Viptm1 (cre)Zjh/J) وAi14 Cre-reporter الفئران (B6). Cg-Gt (ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) لتوليد نسل F1 الذي تعبر فيه الخلايا العصبية VIP عن tdTomato البروتين الفلوري. تم استخدام نسل F1 من أي من الجنسين، الذين تتراوح أعمارهم بين يوم ما بعد الولادة (P) 21 إلى P70. وقد استخدم ما ...

Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

رسم خرائط الدوائر بمساعدة Channelrhodopsin (CRACM) هو تقنية دقيقة لرسم الخرائط الوظيفية للإسقاطات العصبية بعيدة المدى بين مجموعات الخلايا العصبية المحددة تشريحياو/ أو وراثيا. هنا ، ونحن نصف كيفية استخدام CRACM لرسم خريطة وصلات جذع الدماغ السمعية ، بما في ذلك استخدام أوبسين أحمر التحول ، ChrimsonR.

طويلة المدى Channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر من الخلايا العصبية الدنيا Colliculus مع الأزرق والأحمر تحول Channelrhodopsins

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

رسم خرائط الدوائر بمساعدة Channelrhodopsin هو تقنية دقيقة لرسم الخرائط الوظيفية للإسقاطات العصبية طويلة المدى. هنا، نعرض كيفية استخدام هذا النهج للتحقيق في الدوائر في جذع الدماغ السمعي. في شرائح الدماغ، غالباً ما تكون المحاور من مصادر متعددة متشابكة، مما يجعل من الصعب عزل المدخلات الفردية باستخدام التحفيز الكهربائي.باستخدام CRACM، يمكن التغلب على هذا القيد. العثور على لامدا وتحديد باستمرار نظام الإحداثيات stereotaxic هو التحدي كما هو الحفاظ على مدة الإجراء قصيرة. بعد أن كل الخطوات التي تم تعيينها بعناية سيزيد من معدل نجاحك.تبدأ برش منطقة الجراحة مع 70٪ الإيثانول لتعقيم ووضع الستائر منشفة معقمة لتغطية منطقة الجراحة. إزالة الفراش قفص للحد من خطر الاختناق من قفص الانتعاش. بعد ذلك، ضع وسادة تدفئة تحت القفص وتوفير مصدر للغذاء والماء.بعد ذلك، نقل الحيوان إلى إطار استريو واكمل التخدير. أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم والتبديل على وحدة تحكم درجة الحرارة المثلية. ثم، وتطبيق مرهم العيون لمنع العينين من الجفاف.إدارة مسكن وقائي. وأخيرا، حلق فروة الرأس مع مقصات كهربائية. تطهير فروة الرأس مع ثلاث مسحات بالتناوب من اليود povidone والإيثانول 70٪.تبدأ عملية جراحية عن طريق إجراء شق في فروة الرأس على طول خط الوسط، بدءا بين الأذنين واستمرار الرسترال إلى العينين، وفضح الغرز لامدا وbregma. ادفع الجلد إلى الجانب وأزل الـ periosteum من العظام المكشوفة إذا لزم الأمر. المقبل، بمناسبة خياطة لامدا مع علامة جراحية، موقف غيض من نانو حاقن بحيث يكون مجرد لمس لامدا وصفر إحداثيات ميكرومانيبولاتور.استخدام طرف نانو حاقن وmicromanipulator لقياس الفرق في الارتفاع بين الغرز لامدا وbregma. ضبط ارتفاع شريط لوحة لجلب لامدا وbregma إلى داخل زائد أو ناقص 100 ميكرومتر الارتفاع الفرق. خريطة موقع الحقن باستخدام طرف نانو حاقن ونظام تنسيق micromanipulator ووضع علامة على الموقع مع علامة جراحية.ثم، استخدم حفر micromotor مع حفر 0.5 ملليمتر لإجراء عملية استئصال القحف على موقع الحقن. لضمان نقل الخلايا العصبية على نطاق واسع في النواة المستهدفة ، استخدم حقن نانو لإجراء الحقن في أعماق مختلفة في الأنسجة وفي حالة مناطق الدماغ الأكبر ، مثل الكوليكولو أدنى ، وجعل الحقن على مدى اثنين أو أكثر من الاختراقات في إحداثيات X و Y مختلفة. لحقن كوليكولوس أدنى، إيداع 20 نانولترات من الفيروس في فترات من 250 ميكرومتر على طول محور Z بين 2، 250 ميكرومتر و 1، 750 ميكرومتر عمق.للحقن في نواة القوقعة الظهرية، قم بإيداع 20 نانويتلتر من الفيروس على عمق 4، 750 ميكرومتر و4، 550 ميكرومتر على التوالي. بعد الحقن في كل إحداثي Z، انتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل نقل المحاقن إلى إحداثي Z التالي لإتاحة الوقت للفيروس لانتشار بعيدا عن موقع الحقن، مما يقلل من احتمال أن يتم امتصاص الفيروس حتى المسالك الحقن عندما يتم إعادة وضع حقن نانو. ثم، بعد الحقنة الأخيرة، انتظر ثلاث إلى خمس دقائق قبل سحب نانو حاقن من الدماغ.عندما يتم إزالة حقن نانو من الدماغ بين الاختراقات وبين الحيوانات، وإخراج كمية صغيرة من الفيروس من طرف للتأكد من أن الطرف لم تسد. بعد الحقن، واستخدام برنامج تلفزيوني معقمة لبلل حواف قطع من فروة الرأس ومن ثم نقل بلطف الجلد مرة أخرى نحو خط الوسط. إغلاق الجرح مع الغرز انقطاع بسيطة باستخدام 6-0 خياطة النايلون.ثم، تطبيق 0.5 إلى ملليلتر واحد من هلام 2٪ ليدوكاين إلى الجرح. إزالة أشرطة الأذن ومسبار درجة الحرارة، بدوره من ايزوفلوران، وإزالة الحيوان من شريط لوحة ونقله إلى قفص الانتعاش. وأخيرا، رصد الانتعاش عن كثب.مرة واحدة الحيوان مستيقظا تماما، والتحرك حولها، وتظهر أي علامات الألم أو الضيق، ونقلها مرة أخرى إلى قفصه والعودة القفص إلى فيفاريوم. استخدام أساليب المشبك التصحيح القياسية لجعل التسجيلات. تبدأ من خلال وضع شريحة في غرفة تسجيل تحت مجهر مستقيم مرحلة ثابتة وافر باستمرار مع السائل النخاعي الاصطناعي في ملليلتر اثنين في الدقيقة.المقبل, الخلايا العصبية التصحيح تحت السيطرة البصرية باستخدام مضخم المشبك التصحيح مناسبة. وأخيرا، أثناء التسجيلات بالجملة، قم بتنشيط كرونوس عن طريق تقديم نبضات قصيرة من 470 نانومتر خفيف أو ChrimsonR بواسطة نبضات قصيرة من 580 ضوء نانومتر من خلال مصابيح LED المتاحة تجاريا. وأشارت النتائج إلى أن حقن ChrimsonR أدى إلى التعبير القوي في DCN مع الفلوري tdTomato مرئية في الخلايا والألياف.في ICC contralateral، كانت الألياف التي تحمل علامة قوية مع tdTomato مرئية بوضوح بعد ثلاثة أسابيع، مما يدل على قدرة الاتجار طويلة المدى من بناء ChrimsonR-tdTomato عندما حقنها في النوى الجذعية الدماغ السمعية. التنشيط البصري لChrimsonR epsps في الخلايا العصبية VIP IC، مما يشير إلى أن ChrimsonR هو أداة مفيدة لتجارب CRACM طويلة المدى عندما تتطلب المعلمات التجريبية استخدام الضوء الأحمر بدلا من الضوء الأزرق. ومع ذلك ، وجدنا أن ChrimsonR تم تنشيطه بسهولة مع الضوء الأزرق ، مما يظهر نفس العتبة لتنشيط الضوء الأزرق كما Chronos.لهذا البروتوكول من المهم جدا للتأكد من أن إحداثيات stereotaxic صحيحة والتأكد من أن الفيروس تم التعبير عنها فقط في منطقة الدماغ المستهدفة. من خلال تبادل Chronos ChrimsonR viroconstruct مع فيروس مختلف، على سبيل المثال، خلية محددة فليكس الفيروس، يمكنك الإجابة على العديد من الأسئلة التشريحية أو الفسيولوجية دون تغيير بروتوكول الجراحة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

تعيين وظيفي مع MEG الفورية وEEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع<em&gt; التوكسوبلازما</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

في فيفو الحقن المجسمة داخل الدماغ لتحفيز البصريات من المدخلات بعيدة المدى في شرائح الدماغ الماوس

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

تسجيل بصري ذو صورة واحدة في شرائح الدماغ باستخدام صبغ حساس للجهد الكهربائي

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

التحليل التلوي لدراسات التصوير العصبي المستندة إلى Voxel باستخدام رسم الخرائط d القائم علي البذور مع الطفرة في الصور الموضوعة (المبادرة)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

السابقين فيفو الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...