Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projektnummer 401540516, til GD) og National Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).

Få godkendelse fra den lokale institutionelle Animal Care and Use Committee (IACUC) og overholde NIH retningslinjer for pleje og brug af laboratoriedyr. Alle procedurer i denne protokol blev godkendt af University of Michigan IACUC og var i overensstemmelse med NIH retningslinjer for pleje og brug af laboratoriedyr.
1. Kirurgi Præparater
<ol><li>Udfør operationer under aseptiske forhold. Autoklave / sterilisere alle kirurgi værktøjer og materialer før operationen. Bær kirurgi kjole og...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

Vi har konstateret, at CRACM er en kraftfuld teknik til at identificere og karakterisere langtrækkende synaptiske input til neuroner i musen IC. Efter den protokol, der er beskrevet her, opnåede vi robust transfection af neuroner i DCN og IC samt pålidelig axonal handel med Chronos og ChrimsonR til synaptiske terminaler i IC. Derudover viste vi, at denne teknik muliggør måling og analyse af postsynaptiske hændelser, herunder PSP amplitude, halvbredde, henfaldstid og receptorfarmakologi. Vores erfaring tyder på, at...

Synaptiske forbindelser er afgørende for neurale kredsløb funktion, men den præcise topologi og fysiologi af synapser i neurale kredsløb er ofte vanskelige at sonde eksperimentelt. Dette skyldes, at elektrisk stimulation, det traditionelle værktøj af cellulær elektrofysiologi, vilkårligt aktiverer axoner nær stimulering sstedet, og i de fleste hjerneregioner, axoner fra forskellige kilder (lokale, stigende, og / eller faldende) intertwine. Ved hjælp af channelrhodopsin assisteret kredsløb kortlægning (CRACM)1,2, denne begrænsning kan nu overvindes3. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktiveret, kation-selektiv ion kanal oprindeligt findes i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres ved blåt lys af en bølgelængde omkring 450-490 nm, depolariserende cellen gennem kation tilstrømning. ChR2 blev først beskrevet og udtrykt i Xenopus oocytes af Nagel og kolleger4. Kort tid efter udtrykte Boyden og kolleger5 ChR2 i pattedyrneuroner og viste, at de kunne bruge lysimpulser til pålideligt at styre spiking på en millisekund tidsskala, inducerende virkningpotentialer ~ 10 ms efter aktivering af ChR2 med blåt lys. Optogenetiske kanaler med endnu hurtigere kinetik er blevet fundet for nylig (f.eks Chronos6).
Den grundlæggende tilgang til en CRACM eksperiment er at transfect en befolkning af formodede presynaptic neuroner med en rekombinant adeno-associeret virus (rAAV), der bærer den genetiske information til en kanalrhodopsin. Transfection af neuroner med rAAV fører til udtryk for den kodede channelrhodopsin. Typisk er kanalrhodopsin mærket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescerende Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), således at transfection af neuroner i målregionen nemt kan bekræftes med fluorescensbilleddannelse. Fordi rAV'er er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potentiale og langvarig genekspression7,8, er de blevet en standard teknik til at levere kanalrhodopsins til neuroner. Hvis aktivering af en kanalrhodopsin gennem lysblinker efter transfection af en formodet presynaptisk population af neuroner fremkalder postsynaptiske potentialer eller strømme i målneuronerne, hvilket er tegn på en axonal forbindelse fra den transfunderede kerne til den registrerede celle. Fordi afhuggede axoner i hjernen skive eksperimenter kan køres til at frigive neurotransmitter gennem channelrhodopsin aktivering, kerner, der ligger uden for den akutte skive, men sende axoner ind i postsynaptiske hjerne regionen kan identificeres med CRACM. Kraften i denne teknik er, at tilslutning og fysiologi af identificerede langtrækkende synaptiske input kan undersøges direkte.
Ud over kanalrhodopsins, der er excitable af blåt lys, efterforskere har for nylig identificeret flere rød-flyttet channelrhodopsins9,10, herunder Chrimson og dens hurtigere analogChrimsonR, som begge er begejstrede med rødt lys på ~ 660 nm6. Rød-skiftede opsins er af interesse, fordi rødt lys trænger væv bedre end blåt lys, og rødt lys kan have en lavere cytotoksicitet end blåt lys10,11,12. Rød-flyttet channelrhodopsins også åbne mulighed for dobbelt farve CRACM eksperimenter, hvor konvergensen af axoner fra forskellige kerner på samme neuron kan testes i et eksperiment6,13,14. Men, nuværende rød-skiftede opsins ofte udviser uønsket krydsaktivering med blåt lys15,16,17, hvilket gør to farveeksperimenter vanskelig. Desuden har nogle rapporter vist, at ChrimsonR gennemgår begrænset axonal handel, hvilket kan gøre det udfordrende at bruge ChrimsonR til CRACM eksperimenter16,17.
Næsten alle stigende fremskrivninger fra den lavere auditive hjernestammen kerner konvergerer i ringere colliculus (IC), midthjernen hub af den centrale auditive vej. Dette omfatter fremskrivninger fra cochlear kernen (CN)18,19, det meste af det overlegne olivary kompleks (SOC)20, og ryg (DNLL) og ventral (VNLL) kerner af den laterale lemniscus21. Derudover en stor faldende fremskrivning fra den auditive cortex ophører i IC18,19,20,21,22, og IC neuroner selv synapse bredt inden for de lokale og kontralaterale lapper af IC23. Sammenblanding af axoner fra mange kilder har gjort det vanskeligt at sonde IC kredsløb ved hjælp af elektrisk stimulation24. Som et resultat, selv om neuroner i IC udføre beregninger vigtigt for lyd lokalisering og identifikation af tale og anden kommunikation lyde25,26, organiseringen af neurale kredsløb i IC er stort set ukendt. Vi har for nylig identificeret VIP neuroner som den første molekylært identificerbare neuron klasse i IC27. VIP neuroner er glutamatergic stellate neuroner, der projektet til flere langtrækkende mål, herunder auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nu i stand til at bestemme kilderne til og funktionen af lokale og langtrækkende input til VIP neuroner og til at bestemme, hvordan disse kredsløb forbindelser bidrager til lydbehandling.
Protokollen præsenteres her er skræddersyet til at undersøge synaptiske input til VIP neuroner i IC af mus, specielt fra den kontralaterale IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan nemt tilpasses forskellige kilder til input, en anden neuron type eller en anden hjerne region helt. Vi viser også, at ChrimsonR er en effektiv rød-flyttet kanalrhodopsin for langtrækkende kredsløb kortlægning i auditive hjernestammen. Men vi viser, at ChrimsonR er stærkt aktiveret af blåt lys, selv ved lave intensiteter, og dermed, at kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farve CRACM eksperimenter, omhyggeligkontrol skal bruges til at forhindre krydsaktivering af ChrimsonR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

Når man undersøger neurale kredsløb, en standard begrænsning af in vitro patch klemme tilgang er, at axoner fra flere kilder er ofte blandet, hvilket gør det vanskeligt at isolere input fra individuelle kilder med elektrisk stimulation. Men ved hjælp af channelrhodopsin assisteret kredsløb kortlægning (CRACM), kan denne begrænsning nu overvindes. Her rapporterer vi en metode til at bruge CRACM til at kortlægge stigende input fra lavere auditive hjernestammen kerner og commissural input til en identificeret klasse af neuroner i ringere colliculus (IC), midthjernen kernen i det auditive system. I IC, lokale, commissural, stigende, og faldende axoner er stærkt sammenflettet og derfor umulig at skelne med elektrisk stimulation. Ved at injicere en viral konstruktion til at drive udtryk for en kanalrhodopsin i en presynaptic kerne, efterfulgt af patch clamp optagelse til at karakterisere tilstedeværelsen og fysiologi en kanalrhodopsin-udtrykke synaptiske indgange, fremskrivninger fra en bestemt kilde til en bestemt population af IC-neuroner kan kortlægges med celletypespecifik nøjagtighed. Vi viser, at denne tilgang virker med både Chronos, en blå lyse-aktiveret channelrhodopsin, og ChrimsonR, en rød-flyttet kanalrhodopsin. I modsætning til tidligere rapporter fra forhjernen, finder vi, at ChrimsonR er robust smuglet ned axoner af rygsamarbejde cochlear kerne vigtigste neuroner, hvilket indikerer, at ChrimsonR kan være et nyttigt redskab til CRACM eksperimenter i hjernestammen. Protokollen præsenteres her indeholder detaljerede beskrivelser af intrakraniel virus injektion kirurgi, herunder stereotaxic koordinater for målretning injektioner til rygsamarbejde cochlear kernen og IC af mus, og hvordan man kombinerer hele celle patch clamp optagelse med channelrhodopsin aktivering for at undersøge langtrækkende fremskrivninger til IC neuroner. Selv om denne protokol er skræddersyet til at karakterisere auditive input til IC, kan den nemt tilpasses til at undersøge andre langtrækkende fremskrivninger i den auditive hjernestammen og videre.

Vi krydsede VIP-IRES-Cre mus(Viptm1 (cre) Zjh/ J) og Ai14 Cre-reporter mus (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/ J) til at generere F1 afkom, hvor VIP neuroner udtrykke fluorescerende protein tdTomato. F1 afkom af begge køn blev brugt, alderen postnatal dag (P) 21 til P70. I alt 22 dyr blev anvendt i denne undersøgelse.
Stereotaxic injektion af AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH ind i ...

Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Channelrhodopsin-assisteret kredsløb kortlægning (CRACM) er en præcision teknik til funktionel kortlægning af langtrækkende neuronal fremskrivninger mellem anatomisk og / eller genetisk identificerede grupper af neuroner. Her beskriver vi, hvordan du udnytter CRACM til at kortlægge auditive hjernestammen forbindelser, herunder brugen af en rød-flyttet opsin, ChrimsonR.

Langtrækkende Channelrhodopsin-assisteret Circuit Kortlægning af ringere Colliculus Neuroner med blå og rød-flyttet Channelrhodopsins

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

Channelrhodopsin-assisteret kredsløb kortlægning er en præcision teknik til funktionel kortlægning af langtrækkende neurale fremskrivninger. Her viser vi, hvordan vi bruger denne tilgang til at undersøge kredsløb i den auditive hjernestamme. I hjerne skiver, axoner fra flere kilder er ofte blandet, hvilket gør det vanskeligt at isolere individuelle indgange ved hjælp af elektrisk stimulation.Ved at bruge CRACM, kan denne begrænsning overvindes. Finde lambda og konsekvent definere stereotaxic koordinatsystem er udfordrende, som er at holde varigheden af proceduren kort. Under alle trin omhyggeligt kortlagt vil øge din succesrate.Begynd med at sprøjte kirurgi området med 70% ethanol til at desinfærere og placere sterile håndklæde gardiner til at dække kirurgi området. Fjern bur strøelse for at begrænse risikoen for kvælning fra genvindingsburet. Dernæst sætte en varmepude under buret og give en mad og vandkilde.Dernæst overføre dyret til en stereotaxic ramme og fortsætte anæstesi. Sæt en rektal temperatursonde i, og tænd for den hjemmepotiske temperaturregulator. Derefter anvende oftalmologiske salve for at forhindre øjnene i at tørre ud.Administrere forebyggende smertestillende. Endelig barber hovedbunden med elektriske klippere. Desinficere hovedbunden med tre vekslende svaberprøver af povidone jod og 70% ethanol.Begynd kirurgi ved at gøre et snit i hovedbunden langs midterlinjen, der starter mellem ørerne og fortsætter rostral til øjnene, udsætter lambda og bregma suturer. Skub huden til siden og fjern periosteum fra den eksponerede knogle, hvis det er nødvendigt. Marker derefter lambda suturen med en kirurgisk markør, placer spidsen af nanoinjektoren, så den bare rører lambda og nulstiller mikromanipulatorkoordinaterne.Brug nanoinjektorspidsen og mikromanipulatoren til at måle forskellen i højde mellem lambda- og bregma-suturerne. Juster paletbarhøjden for at bringe lambda og bregma inden for plus eller minus 100 mikrometerhøjdeforskel. Kort over injektionsstedet ved hjælp af nanoinjektorspidsen og mikromanipulatorkoordinatorsystemet, og marker stedet med en kirurgisk markør.Brug derefter en mikromotorisk boremaskine med en 0,5 millimeter boretren til at udføre en kraniotomi over injektionsstedet. For at sikre bred transinfektion af neuroner i målkernen, bruge en nano-injektor til at foretage injektioner på forskellige dybder i vævet og i tilfælde af større hjerneregioner, ligesom ringere colliculus, gøre injektioner i løbet af to eller flere gennemføringer på forskellige X og Y koordinater. For at injicere de ringere colliculus, deponere 20 nanoliters af virus i intervallerne på 250 mikrometer langs Z aksen mellem 2, 250 mikrometer og 1, 750 mikrometer dybde.Ved injektioner i den dorsale cochlearkerne aflejrer 20 nanoliters virus i en dybde på henholdsvis 4, 750 mikrometer og 4.550 mikrometer. Efter injektion ved hver Z-koordinat skal du vente to til tre minutter, før injektoren flyttes til den næste Z-koordinat for at give virusset tid til at sprede sig væk fra injektionsstedet, hvilket reducerer sandsynligheden for, at virus vil blive suget op i injektionskanalen, når nanoinjektoren flyttes. Derefter, efter den sidste injektion, vente tre til fem minutter før tilbagetrækning nano-injektor fra hjernen.Når nanoinjektoren fjernes fra hjernen mellem gennemføringer og mellem dyr, skubbes en lille mængde virus ud af spidsen for at kontrollere, at spidsen ikke er tilstoppet. Efter injektioner, bruge sterile PBS at våd de afskårne kanter af hovedbunden og derefter forsigtigt flytte huden tilbage mod midterlinjen. Luk såret med simple afbrudte suturer ved hjælp af 6-0 nylon suturer.Derefter anvendes 0,5 til en milliliter 2% lidocain gelé til såret. Fjern ørestængerne og temperatursonden, isofluranens drejning, og fjern dyret fra palettens bar, og overfør det til genfindingsburet. Endelig overvåge inddrivelse nøje.Når dyret er helt vågen, bevæger sig rundt, og viser ingen tegn på smerte eller angst, overføre det tilbage i sit bur og returnere buret til vivarium. Brug standard patch clamp metoder til at lave optagelser. Begynd med at placere skiven i et optagelseskammer under et fast trin opretstående mikroskop og kontinuerligt kraftig med kunstig cerebrospinalvæske på to milliliter i minuttet.Dernæst patch neuroner under visuel kontrol ved hjælp af en passende patch klemme forstærker. Endelig aktiveres Chronos under engrosoptagelser ved at levere korte impulser på 470 nanometerlys eller ChrimsonR med korte impulser på 580 nanometerlys gennem kommercielt tilgængelige lysdioder. Resultaterne viste, at ChrimsonR injektion førte til stærke udtryk i DCN med tdTomato fluorescens synlig i celler og fibre.I den kontralaterale ICC, fibre stærkt mærket med tdTomato var klart synlige efter tre uger, viser langtrækkende menneskehandel evne ChrimsonR-tdTomato konstruere, når injiceres i auditive hjernestammekerner. Optisk aktivering af ChrimsonR elicted EPSPs i IC VIP neuroner, hvilket indikerer, at ChrimsonR er et nyttigt værktøj til langtrækkende CRACM eksperimenter, når de eksperimentelle parametre kræver brug af rødt lys i stedet for blåt lys. Men vi fandt, at ChrimsonR var let aktiveret med blåt lys, viser den samme tærskel for blåt lys aktivering som Chronos.For denne protokol er det vigtigst at sikre, at stereotaxic koordinater er korrekte, og at bekræfte, at virus blev udtrykt kun i din målrettede hjerne region. Ved at udveksle Chronos ChrimsonR viroconstruct med en anden virus, for eksempel en celle specifik Flex virus, kan du besvare flere anatomiske eller fysiologiske spørgsmål uden at ændre kirurgi protokol.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk Undersøgelse af Axon Regeneration med dyrkede voksne dorsale rodganglie neuroner

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellulær Optagelse, Sensory Field Mapping, og dyrkning Identificerede neuroner i Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling af olfaktoriske receptor neuroner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging og analyse af neuroner Inficerede<em&gt; In Vivo</em&gt; Med<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp optagelser til elektrofysiologisk bestemmelse af ion selektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebral Stereotaxiske injektioner til Optogenetisk stimulering af langtrækkende indgange i musehjerne skiver

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-felt enkelt-photon optisk optagelse i hjernen skiver ved hjælp af spændings følsom Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

Meta-analyse af voxel-baserede Neuro Imaging undersøgelser ved hjælp af Seed-baserede d kortlægning med permutation af motiv billeder (SDM-PSI)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetisk forhør af langtrækkende synaptisk transmission og plasticitet fra medial præfrontal cortex til lateral entorhinal cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...