Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projectnummer 401540516, aan DG) en National Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).

Krijg goedkeuring van het lokale Comité voor institutionele dierenverzorging en -gebruik (IACUC) en houd zich aan de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit van Michigan IACUC en waren in overeenstemming met NIH richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Chirurgie Voorbereidingen
<ol><li>Voer operaties uit in aseptische omstandigheden. Autoclave/steriliseren alle chirurg...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

We hebben ontdekt dat CRACM is een krachtige techniek voor het identificeren en karakteriseren van lange afstand synaptische ingangen aan neuronen in de muis IC. Naar aanleiding van het protocol dat hier is beschreven, bereikten we robuuste transfection van neuronen in de DCN en IC, evenals betrouwbare axonale handel van Chronos en ChrimsonR naar synaptische terminals in de IC. Daarnaast hebben we aangetoond dat deze techniek het mogelijk maakt om berichtenynaptische gebeurtenissen te meten en te analyseren, waaronder PS...

Synaptische verbindingen zijn van cruciaal belang voor neurale circuitfunctie, maar de precieze topologie en fysiologie van synapsen binnen neurale circuits zijn vaak moeilijk experimenteel te onderzoeken. Dit komt omdat elektrische stimulatie, het traditionele instrument van cellulaire elektrofysiologie, lukraak axonen activeert in de buurt van de stimulatiesite, en in de meeste hersengebieden verstrengelen axonen uit verschillende bronnen (lokaal, oplopend en/of dalend). Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, kan deze beperking nu worden overwonnen3. Channelrhodopsine (ChR2) is een licht geactiveerd, kation-selectieve ionenkanaal oorspronkelijk gevonden in de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan worden geactiveerd door blauw licht van een golflengte rond 450-490 nm, depolariseren van de cel door middel van kation instroom. ChR2 werd voor het eerst beschreven en uitgedrukt in Xenopus eicellen door Nagel en collega's4. Kort daarna, Boyden en collega's5 uitgedrukt ChR2 in zoogdierneuronen en toonde aan dat ze lichtpulsen konden gebruiken om betrouwbaar controle spiking op een milliseconde tijdschaal, inducerende actie potentials ~ 10 ms na activering van ChR2 met blauw licht. Optogenetische kanalen met nog snellere kinetiek zijn onlangs gevonden (bijvoorbeeld Chronos6).
De basisbenadering van een CRACM-experiment is om een populatie van vermeende presynaptische neuronen te transfectmet een recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) dat de genetische informatie voor een channelrhodopsine draagt. Transfection van neuronen met rAAV leidt tot de expressie van de gecodeerde channelrhodopsine. Typisch, de channelrhodopsine is gelabeld met een fluorescerend eiwit zoals GFP (Green Fluorescent Protein) of tdTomato (een rood fluorescerend eiwit), zodat transfection van neuronen in het doelgebied gemakkelijk kan worden bevestigd met fluorescentie beeldvorming. Omdat rAAVs niet-pathogene zijn, een laag ontstekingspotentieel hebben en langdurige genexpressie7,8, zijn ze een standaardtechniek geworden om channelrhodopsinen aan neuronen te leveren. Als, na transfection van een vermeende presynaptische populatie van neuronen, activering van een channelrhodopsine door middel van lichtflitsen lokt postsynaptische potentialen of stromingen in de doelneuronen, dit is het bewijs van een axonale verbinding van de transfected kern naar de geregistreerde cel. Omdat afgehakte axonen in hersenslice experimenten kunnen worden gedreven om neurotransmitter release door middel van channelrhodopsine activering, kernen die buiten de acute slice liggen, maar stuur axonen in de postsynaptische hersengebied kan worden geïdentificeerd met CRACM. De kracht van deze techniek is dat de connectiviteit en fysiologie van geïdentificeerde synaptische ingangen over lange afstand direct kunnen worden onderzocht.
In aanvulling op channelrhodopsins die prikkelbaar zijn door blauw licht, onderzoekers hebben onlangs geïdentificeerd verschillende rood-verschoven channelrhodopsins9,10, met inbegrip van Chrimson en zijn snellere analoge ChrimsonR, die beide zijn enthousiast met rood licht van ~ 660 nm6. Roodverschoven opsinen zijn van belang omdat rood licht weefsel beter doordringt dan blauw licht, en rood licht kan een lagere cytotoxiciteit hebben dan blauw licht10,11,12. Rood verschoven channelrhodopsinen openen ook de mogelijkheid van dual color CRACM experimenten, waarbij de convergentie van axonen uit verschillende kernen op hetzelfde neuron kan worden getest in een experiment6,13,14. Echter, de huidige rood-verschoven opsins vertonen vaak ongewenste kruisactivering met blauw licht15,16,17, waardoor twee kleur experimenten moeilijk. Bovendien hebben sommige rapporten aangegeven dat ChrimsonR beperkte axonale handel ondergaat, wat het moeilijk kan maken om ChrimsonR te gebruiken voor CRACM-experimenten16,17.
Bijna alle opgaande projecties van de lagere auditieve hersenstamkernen komen samen in de inferieure colliculus (IC), de midbrain hub van de centrale auditieve route. Dit omvat projecties van de cochleaire kern (CN)18,19, het grootste deel van het superieure olivariecomplex (SOC)20, en de dorsale (DNLL) en ventrale (VNLL) kernen van de laterale lemniscus21. Bovendien eindigt een grote dalende projectie van de auditieve cortex in de IC18,19,20,21,22, en IC-neuronen zelf synaps breed binnen de lokale en contralaterale kwabben van de IC23. Het vermengen van axonen uit vele bronnen heeft het moeilijk gemaakt om IC-circuits te sondemeten met behulp van elektrische stimulatie24. Als gevolg daarvan, hoewel neuronen in de IC berekeningen uit te voeren belangrijk voor geluidslokalisatie en de identificatie van spraak en andere communicatie geluiden25,26, de organisatie van neurale circuits in de IC is grotendeels onbekend. We hebben onlangs geïdentificeerd VIP neuronen als de eerste moleculair identificeerbare neuron klasse in de IC27. VIP-neuronen zijn glutamatergic stellate neuronen die projecteren op verschillende lange-afstandsdoelen, waaronder de auditieve thalamus en superieure colliculus. We zijn nu in staat om de bronnen en functie van lokale en lange-afstandsingangen voor VIP-neuronen te bepalen en te bepalen hoe deze circuitverbindingen bijdragen aan geluidsverwerking.
Het hier gepresenteerde protocol is afgestemd op het onderzoeken van synaptische ingangen van VIP-neuronen in de IC van muizen, met name van de contralaterale IC en de DCN (Figuur 1). Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende bronnen van input, een ander neuron type of een ander hersengebied helemaal. We laten ook zien dat ChrimsonR een effectieve roodverschoven kanaalrhodopsine is voor lange afstand circuit mapping in de auditieve hersenstam. We tonen echter aan dat ChrimsonR sterk wordt geactiveerd door blauw licht, zelfs bij lage intensiteiten, en dus, om ChrimsonR te combineren met Chronos in tweekleurige CRACM-experimenten, moeten zorgvuldige controles worden gebruikt om kruisactivering van ChrimsonR te voorkomen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

Bij het onderzoeken van neurale circuits, een standaard beperking van de in vitro patch klem aanpak is dat axonen uit meerdere bronnen zijn vaak gemengd, waardoor het moeilijk is om ingangen te isoleren van individuele bronnen met elektrische stimulatie. Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM), kan deze beperking nu worden overwonnen. Hier rapporteren we een methode om CRACM te gebruiken om opgaande ingangen van lagere auditieve hersenstamkernen en commissurale ingangen in kaart te brengen naar een geïdentificeerde klasse neuronen in de inferieure colliculus (IC), de midbrainkern van het auditieve systeem. In de IC zijn lokale, commissurale, opgaande en dalende axonen sterk met elkaar verweven en daardoor niet te onderscheiden met elektrische stimulatie. Door het injecteren van een virale constructie om expressie van een channelrhodopsine in een presynaptische kern te stimuleren, gevolgd door patch klem opname om de aanwezigheid en fysiologie van channelrhodopsin-uitdrukkende synaptische ingangen te karakteriseren, projecties van een specifieke bron aan een specifieke populatie ic-neuronen kan worden toegewezen met celtype-specifieke nauwkeurigheid. We laten zien dat deze aanpak werkt met zowel Chronos, een blauw licht geactiveerde kanaalrhodopsine, als ChrimsonR, een rood verschoven kanaalrhodopsine. In tegenstelling tot eerdere rapporten van het voorbrein, vinden we dat ChrimsonR robuust wordt verhandeld door de axonen van dorsale cochleair nucleus principal neuronen, wat aangeeft dat ChrimsonR een nuttig hulpmiddel kan zijn voor CRACM-experimenten in de hersenstam. Het hier gepresenteerde protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de intracraniële virusinjectiechirurgie, inclusief stereotaxiccoördinaten voor het richten van injecties op de rugslakkenkern en IC van muizen, en hoe hele celpatchklemregistratie te combineren met channelrhodopsine activering om lange-afstandsprojecties aan IC neuronen te onderzoeken. Hoewel dit protocol is afgestemd op het karakteriseren van auditieve ingangen aan de IC, kan het gemakkelijk worden aangepast om andere lange-afstandsprojecties in de auditieve hersenstam en daarbuiten te onderzoeken.

We staken VIP-IRES-Cre muizen (Viptm1 (cre)Zjh/J) en Ai14 Cre-reporter muizen (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) om F1-nakomelingen te genereren waarin VIP-neuronen het fluorescerende eiwit tdTomato uitdrukken. F1 nakomelingen van beide geslachten werden gebruikt, leeftijd postnatale dag (P) 21 tot P70. In totaal werden 22 dieren gebruikt in deze studie.
Stereotaxic injectie van...

Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) is een precisietechniek voor het functioneel in kaart brengen van lange afstandneuronale projecties tussen anatomische en/of genetisch geïdentificeerde groepen neuronen. Hier beschrijven we hoe we CRACM kunnen gebruiken om auditieve hersenstamverbindingen in kaart te brengen, inclusief het gebruik van een roodverschoven opsin, ChrimsonR.

Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

Channelrhodopsine-assisted circuit mapping is een precisietechniek voor functionele mapping van neurale projecties met lange afstand. Hier laten we zien hoe we deze aanpak kunnen gebruiken om circuits in de auditieve hersenstam te onderzoeken. In de hersenen plakjes, axonen uit meerdere bronnen zijn vaak vermengd, waardoor het moeilijk is om individuele ingangen te isoleren met behulp van elektrische stimulatie.Door cracm te gebruiken, kan deze beperking worden overwonnen. Het vinden van lambda en consequent definiëren van de stereotaxic coördinaat systeem is een uitdaging als is het houden van de duur van de procedure kort. Het hebben van alle stappen zorgvuldig in kaart gebracht zal uw slagingspercentage te verhogen.Begin met het besproeien van de operatie gebied met 70% ethanol te ontsmetten en plaats steriele handdoek gordijnen om de operatie gebied te dekken. Verwijder kooibedden om het risico op verstikking uit de herstelkooi te beperken. Zet vervolgens een verwarmingskussen onder de kooi en zorg voor een voedsel- en waterbron.Breng het dier vervolgens over naar een stereotaxic-frame en ga verder met anesthesie. Plaats een rectale temperatuursonde en schakel de homeostatische temperatuurregelaar in. Breng vervolgens oogheelkundige zalf aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.Beheer preventieve pijnstillende. Scheer ten slotte de hoofdhuid met elektrische tondeuse. Desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende wattenstaafjes povidone jodium en 70% ethanol.Begin met de operatie door een incisie in de hoofdhuid langs de middellijn te maken, te beginnen tussen de oren en de aanhoudende rostral aan de ogen, waardoor de lambda en bregma hechtingen worden bloot. Duw de huid naar de zijkant en verwijder periosteum van het blootgestelde bot indien nodig. Vervolgens, markeer de lambda hechting met een chirurgische marker, plaats de punt van de nano-injector, zodat het gewoon aanraken lambda en nul de micromanipulator coördinaten.Gebruik de nano-injector tip en micromanipulator om het verschil in hoogte tussen de lambda en bregma hechtingen te meten. Pas de hoogte van de paletbalk aan om lambda en bregma binnen plus of min hoogteverschil van 100 micrometer te brengen. Breng de injectieplaats in kaart met behulp van de nano-injector tip en micromanipulator coördinaatsysteem en markeer de site met een chirurgische marker.Gebruik vervolgens een micromotorische boor met een boorbraam van 0,5 millimeter om een craniotomie over de injectieplaats uit te voeren. Om een brede transfectie van neuronen in de doelkern te garanderen, gebruikt u een nano-injector om injecties te maken op verschillende diepten in het weefsel en in het geval van grotere hersengebieden, zoals de inferieure colliculus, injecties te maken in de loop van twee of meer penetraties op verschillende X- en Y-coördinaten. Om de inferieure colliculus te injecteren, deponeren 20 nanoliter van het virus in de intervallen van 250 micrometer langs de Z-as tussen 2, 250 micrometer en 1, 750 micrometer diepte.Voor injecties in de dorsale cochleaire kern, deponeren 20 nanoliters van het virus op een diepte van 4, 750 micrometer en 4, 550 micrometer respectievelijk. Wacht na het injecteren bij elke Z-coördinaat twee tot drie minuten voordat u de injector naar de volgende Z-coördinaat verplaatst om tijd te geven voor het virus om zich van de injectieplaats te verspreiden, waardoor de kans wordt verkleind dat het virus het injectiekanaal wordt opgezogen wanneer de nano-injector wordt verplaatst. Wacht vervolgens na de laatste injectie drie tot vijf minuten voordat u nano-injector uit de hersenen intrekt.Wanneer de nano-injector wordt verwijderd uit de hersenen tussen penetraties en tussen dieren, uitwerpen van een klein volume van het virus uit de tip om te controleren of de tip niet is verstopt. Gebruik na injecties steriele PBS om de snijranden van de hoofdhuid nat te maken en beweeg de huid vervolgens voorzichtig terug naar de middellijn. Sluit de wond met eenvoudige onderbroken hechtingen met behulp van 6-0 nylon hechtingen.Breng vervolgens 0,5 op een milliliter van 2% lidocaïnegelei aan op de wond. Verwijder de oorbalken en temperatuursonde, draai van isoflurane, en verwijder het dier uit de palettebalk en breng het naar de herstelkooi. Tot slot, houd het herstel nauwlettend in de gaten.Zodra het dier volledig wakker is, bewegen, en het tonen van geen tekenen van pijn of nood, breng het terug in zijn kooi en de kooi terug te keren naar het vivarium. Gebruik standaard patchklemmethoden om opnames te maken. Begin met het plaatsen van de slice in een opnamekamer onder een vaste fase rechtop microscoop en voortdurend overvloedig met kunstmatige hersenvocht op twee milliliter per minuut.Vervolgens patch neuronen onder visuele controle met behulp van een geschikte patch klem versterker. Ten slotte, tijdens groothandel opnames, activeren Chronos door het leveren van korte pulsen van 470 nanometer licht of ChrimsonR door korte pulsen van 580 nanometer licht door middel van commercieel beschikbare LED's. De resultaten gaven aan dat de injectie chrimsonR tot sterke uitdrukking in DCN met tdTomato fluorescentie zichtbaar in cellen en vezels leidde.In het contralaterale ICC waren vezels die sterk zijn gelabeld met tdTomato na drie weken duidelijk zichtbaar, wat aantoont dat de chrimsonR-tdTomato-constructie op lange afstand kan worden geïnjecteerd wanneer ze in auditieve hersenstamkerkernen worden geïnjecteerd. Optische activering van ChrimsonR geëtcteerde EPSP's in IC VIP-neuronen, wat aangeeft dat ChrimsonR een nuttig hulpmiddel is voor lange afstand CRACM-experimenten wanneer de experimentele parameters het gebruik van rood licht in plaats van blauw licht vereisen. We vonden echter dat ChrimsonR gemakkelijk werd geactiveerd met blauw licht, met dezelfde drempel voor blauw licht activering als Chronos.Voor dit protocol is het van het grootste belang om ervoor te zorgen dat de stereotaxic coördinaten correct zijn en om te bevestigen dat het virus alleen werd uitgedrukt in uw beoogde hersengebied. Door de Chronos ChrimsonR viroconstruct uit te wisselen met een ander virus, bijvoorbeeld een celspecifiek Flex-virus, u verschillende anatomische of fysiologische vragen beantwoorden zonder het operatieprotocol te wijzigen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functionele Mapping met gelijktijdige MEG en EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellulaire opname, Sensory Velden bij, en het kweken geïdentificeerde neuronen in de Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected<em&gt; In Vivo</em&gt; Met<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-veld single-foton optische opname in de hersenen schijfjes met behulp van spanning-gevoelige kleurstof

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

Meta-analyse van op Voxel gebaseerde neuroimaging-onderzoeken met behulp van op zaad gebaseerde d-mapping met permutatie van Onderwerpafbeeldingen (SDM-PSI)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...