Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche Deutsche Forschungsgemeinschaft (GO 3060/1-1, numéro de projet 401540516, à la DG) et la subvention des National Institutes of Health R56 DC016880 (MTR).

Obtenir l’approbation du Comité local de soins et d’utilisation des animaux en établissement (IACUC) et adhérer aux lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvées par l’IACUC de l’Université du Michigan et étaient conformes aux lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparations chirurgicales
<ol><li>Effectuer des chirurgies dan...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

Nous avons constaté que CRACM est une technique puissante pour identifier et caractériser les entrées synaptiques à longue portée aux neurones de la souris IC. En suivant le protocole détaillé ici, nous avons réalisé une transfection robuste des neurones dans le DCN et IC ainsi que le trafic axonal fiable de Chronos et ChrimsonR aux terminaux synaptiques dans l’IC. En outre, nous avons démontré que cette technique permet la mesure et l’analyse des événements postsynaptiques, y compris l’amplitude PSP, ...

Les connexions synaptiques sont essentielles à la fonction du circuit neuronal, mais la topologie et la physiologie précises des synapses dans les circuits neuronaux sont souvent difficiles à sonder expérimentalement. C’est parce que la stimulation électrique, l’outil traditionnel de l’électrophysiologie cellulaire, active sans discernement les axones près du site de stimulation, et dans la plupart des régions du cerveau, les axones de différentes sources (locales, ascendantes et/ou descendantes) s’entremêlent. Cependant, en utilisant channelrhodopsine cartographie de circuit assisté (CRACM)1,2, cette limitation peut maintenant être surmontée3. Channelrhodopsin (ChR2) est une lumière activée, canal d’ions cation-sélectif à l’origine trouvé dans l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 peut être activé par la lumière bleue d’une longueur d’onde autour de 450-490 nm, dépolarisant la cellule par l’afflux de cation. ChR2 a été décrit pour la première fois et exprimé dans les ovocytes Xenopus par Nagel et ses collègues4. Peu de temps après, Boyden et ses collègues5 ont exprimé le ChR2 dans les neurones mammifères et ont montré qu’ils pouvaient utiliser des impulsions lumineuses pour contrôler de façon fiable les pointes sur une échelle de temps milliseconde, induisant des potentiels d’action de 10 ms après l’activation de ChR2 avec la lumière bleue. Des canaux optogénétiques avec des cinétiques encore plus rapides ont été trouvés récemment (par exemple, Chronos6).
L’approche de base d’une expérience CRACM est de transfect une population de neurones présynaptiques putatifs avec un virus adéno-associé recombinant (rAAV) qui porte l’information génétique pour une canalrhodopsine. La transfection des neurones avec le rAAV conduit à l’expression de la channelrhodopsine codée. Typiquement, la canalrhodopsine est marquée avec une protéine fluorescente comme GFP (protéine fluorescente verte) ou tdTomato (une protéine fluorescente rouge), de sorte que la transfection des neurones dans la région cible peut facilement être confirmée avec l’imagerie de fluorescence. Parce que les rAAV sont non pathogènes, ont un faible potentiel inflammatoire et l’expression génique de longue durée7,8, ils sont devenus une technique standard pour livrer des canalrhodopsines aux neurones. Si, après transfection d’une population présynaptique putative de neurones, l’activation d’une canalrhodopsine par des éclairs de lumière suscite des potentiels ou des courants postsynaptiques dans les neurones cibles, c’est l’évidence d’une connexion axonale du noyau transfecté à la cellule enregistrée. Puisque les axones coupés dans des expériences de tranche de cerveau peuvent être conduits pour libérer le neurotransmetteur par l’activation de canalrhodopsine, les noyaux qui se trouvent en dehors de la tranche aigue mais envoient des axones dans la région de cerveau postsynaptic peuvent être identifiés avec CRACM. La puissance de cette technique est que la connectivité et la physiologie des entrées synaptiques à longue portée identifiées peuvent être étudiées directement.
En plus de channelrhodopsines qui sont excitables par la lumière bleue, les enquêteurs ont récemment identifié plusieurs canalrhodopsines rouges décalées9,10, y compris Chrimson et son plus rapide analogique ChrimsonR, qui sont tous deux excités par la lumière rouge de 660 nm6. Les opsines à décalé rouge sont d’intérêt parce que la lumière rouge pénètre le tissu mieux que la lumière bleue, et la lumière rouge peut avoir une cytotoxicité inférieure à la lumière bleue10,11,12. Les canalrhodopsines décalées rouges ouvrent également la possibilité d’expériences CRACM à double couleur, où la convergence des axones de différents noyaux sur le même neurone peut être testée dans une expérience6,13,14. Cependant, les opsines rouges actuelles présentent souvent une activation croisée non désirée avec une lumière bleue15,16,17, ce qui rend deux expériences de couleur difficiles. En outre, certains rapports ont indiqué que ChrimsonR subit un trafic axonal limité, ce qui peut rendre difficile l’utilisation de ChrimsonR pour les expériences du CRACM16,17.
Presque toutes les projections ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral convergent dans le colliculus inférieur (IC), le centre de cerveau moyen de la voie auditive centrale. Cela comprend les projections du noyau cochléaire (CN)18,19, la plupart du complexe olivaire supérieur (SOC)20, et le dorsal (DNLL) et ventral (VNLL) noyaux du lemniscus latéral21. En outre, une grande projection descendante du cortex auditif se termine dans l’IC18,19,20,21,22, et les neurones IC eux-mêmes synapse largement dans les lobes locaux et contralatéraux de l’IC23. L’entremêlement d’axones provenant de nombreuses sources a rendu difficile la sonde des circuits IC à l’aide de la stimulation électrique24. En conséquence, même si les neurones de l’IC effectuent des calculs importants pour la localisation sonore et l’identification de la parole et d’autres sons de communication25,26, l’organisation des circuits neuronaux dans l’IC est largement inconnue. Nous avons récemment identifié les neurones VIP comme la première classe de neurones moléculairement identifiables dans l’IC27. Les neurones VIP sont des neurones stellates glutamatergiques qui projettent à plusieurs cibles à longue portée, y compris le thalamus auditif et colliculus supérieur. Nous sommes maintenant en mesure de déterminer les sources et la fonction des entrées locales et à longue portée aux neurones VIP et de déterminer comment ces connexions de circuit contribuent au traitement du son.
Le protocole présenté ici est conçu pour étudier les apports synaptiques aux neurones VIP dans l’IC des souris, en particulier de l’IC contralatéral et le DCN (Figure 1). Le protocole peut être facilement adapté à différentes sources d’entrée, un type de neurone différent ou une région différente du cerveau tout à fait. Nous montrons également que ChrimsonR est une canalrhodopsine rouge-décalée efficace pour la cartographie à longue distance de circuit dans le tronc cérébral auditif. Cependant, nous démontrons que ChrimsonR est fortement activé par la lumière bleue, même à faible intensité, et donc, pour combiner ChrimsonR avec Chronos dans des expériences CRACM bicolores, des contrôles prudents doivent être utilisés pour empêcher l’activation croisée de ChrimsonR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

Lors de l’étude des circuits neuronaux, une limitation standard de l’approche de pince de correction in vitro est que les axones de sources multiples sont souvent mélangés, ce qui rend difficile d’isoler les entrées de sources individuelles avec stimulation électrique. Cependant, en utilisant la cartographie assistée de circuit de canalrhodopsine (CRACM), cette limitation peut maintenant être surmontée. Ici, nous rapportons une méthode pour employer CRACM pour cartographier les entrées ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral et des entrées commissural à une classe identifiée de neurones dans le colliculus inférieur (IC), le noyau de midbrain du système auditif. Dans l’IC, les axones locaux, commissuraux, ascendants et descendants sont fortement entrelacés et donc indiscernables avec la stimulation électrique. En injectant une construction virale pour conduire l’expression d’un canalrhodopsin dans un noyau presynaptique, suivi de l’enregistrement de pince de correction pour caractériser la présence et la physiologie des entrées synaptiques channelrhodopsin-exprimant, projections d’une source spécifique à une population spécifique de neurones IC peut être cartographié avec une précision spécifique au type cellulaire. Nous montrons que cette approche fonctionne à la fois avec Chronos, une canalrhodopsine activée par la lumière bleue, et ChrimsonR, une canalrhodopsine à décalée rouge. Contrairement aux rapports précédents de l’avant-cerveau, nous constatons que ChrimsonR est solidement trafiqué dans les axones des neurones principaux du noyau cochléaire dorsal, ce qui indique que ChrimsonR peut être un outil utile pour les expériences CRACM dans le tronc cérébral. Le protocole présenté ici comprend des descriptions détaillées de la chirurgie par injection de virus intracrânien, y compris des coordonnées stéréotaxiques pour cibler les injections au noyau cochléaire dorsal et ic des souris, et comment combiner l’enregistrement de pince de patch cellulaire entier avec l’activation de channelrhodopsine pour étudier des projections à longue portée aux neurones ic. Bien que ce protocole soit conçu pour caractériser les apports auditifs à l’IC, il peut être facilement adapté pour étudier d’autres projections à long terme dans le tronc cérébral auditif et au-delà.

Nous avons croisé des souris VIP-IRES-Cre(Viptm1(cre)Zjh/J) et Ai14 Cre-reporter souris (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) pour générer la progéniture F1 dans laquelle les neurones VIP expriment la protéine fluorescente tdTomato. F1 progéniture de l’un ou l’autre sexe ont été utilisés, le jour postnatal âgé (P) 21 à P70. Au total, 22 animaux ont été utilisés dans cette étude.
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

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Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

La cartographie de circuit assistée par la chaînerhodopsine (CRACM) est une technique de précision pour la cartographie fonctionnelle des projections neuronales à longue portée entre les groupes anatomiques et/ou génétiquement identifiés des neurones. Ici, nous décrivons comment utiliser CRACM pour cartographier les connexions auditives du tronc cérébral, y compris l’utilisation d’une opsine rouge décalée, ChrimsonR.

Cartographie à long terme de circuit assisté e de Channelrhodopsine des neurones colliculus inférieurs avec des Channelrhodopsins bleus et rouges

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

La cartographie des circuits assistée par channelrhodopsine est une technique de précision pour la cartographie fonctionnelle des projections neuronales à longue portée. Ici, nous montrons comment utiliser cette approche pour étudier les circuits dans le tronc cérébral auditif. Dans les tranches de cerveau, les axones de sources multiples sont souvent mélangés, ce qui rend difficile l’isolement des entrées individuelles à l’aide de la stimulation électrique.En utilisant cracm, cette limitation peut être surmontée. Trouver lambda et constamment définir le système de coordonnées stéréotaxiques est difficile, tout comme le maintien de la durée de la procédure courte. Avoir toutes les étapes soigneusement cartographiées augmentera votre taux de réussite.Commencez par pulvériser la zone de chirurgie avec 70% d’éthanol pour assainir et placer des rideaux stériles de serviette pour couvrir la zone de chirurgie. Retirez la literie de cage pour limiter le risque d’asphyxie de la cage de récupération. Ensuite, placez un coussin chauffant sous la cage et fournissez une source de nourriture et d’eau.Ensuite, transférez l’animal dans un cadre stéréotaxique et continuez l’anesthésie. Insérez une sonde de température rectale et allumez le contrôleur de température homéostatique. Ensuite, appliquez de l’onguent ophtalmique pour empêcher les yeux de se dessécher.Administrer l’analgésique préemptif. Enfin, raser le cuir chevelu avec des tondeuses électriques. Désinfecter le cuir chevelu avec trois écouvillons alternatifs d’iode povidone et 70% d’éthanol.Commencez la chirurgie en faisant une incision dans le cuir chevelu le long de la ligne médiane, en commençant entre les oreilles et en continuant rostral aux yeux, exposant les sutures lambda et bregma. Poussez la peau sur le côté et retirez le périoste de l’os exposé si nécessaire. Ensuite, marquer la suture lambda avec un marqueur chirurgical, positionner la pointe du nano-injecteur de sorte qu’il est juste toucher lambda et zéro les coordonnées micromanipulateur.Utilisez la pointe nano-injecteur et le micromanipulateur pour mesurer la différence d’altitude entre les sutures lambda et bregma. Ajustez la hauteur de la barre de palette pour amener lambda et bregma à l’intérieur ou moins 100 micromètres de différence de hauteur. Cartographiez le site d’injection à l’aide de la pointe du nano-injecteur et du système de coordonnées du micromanipulateur et marquez le site à l’aide d’un marqueur chirurgical.Ensuite, utilisez une perceuse micromotrice avec une bavure de forage de 0,5 millimètre pour effectuer une craniotomie sur le site d’injection. Pour assurer une transfection large des neurones dans le noyau cible, utilisez un nano-injecteur pour faire des injections à différentes profondeurs dans le tissu et dans le cas de plus grandes régions du cerveau, comme le colliculus inférieur, faire des injections au cours de deux pénétrations ou plus à différentes coordonnées X et Y. Pour injecter le colliculus inférieur, déposez 20 nanolitres de virus dans les intervalles de 250 micromètres le long de l’axe Z entre 2 250 micromètres et 1 750 micromètres de profondeur.Pour les injections dans le noyau cochléaire dorsal, déposer 20 nanolitres de virus à une profondeur de 4 750 micromètres et 4 550 micromètres respectivement. Après l’injection à chaque coordonnée Z, attendez deux à trois minutes avant de déplacer l’injecteur vers la coordonnée Z suivante pour laisser le temps au virus de se diffuser loin du site d’injection, réduisant ainsi la probabilité que le virus soit aspiré dans le tractus d’injection lorsque le nano-injecteur est repositionné. Puis, après la dernière injection, attendez trois à cinq minutes avant de retirer le nano-injecteur du cerveau.Lorsque le nano-injecteur est retiré du cerveau entre les pénétrations et entre les animaux, éjecter un petit volume de virus de la pointe pour vérifier que la pointe n’est pas obstruée. Après les injections, utiliser PBS stérile pour mouiller les bords coupés du cuir chevelu, puis déplacer doucement la peau vers la ligne médiane. Fermez la plaie avec de simples sutures interrompues à l’aide de sutures en nylon 6-0.Ensuite, appliquez 0,5 à un millilitre de gelée de lidocaïne de 2% sur la plaie. Retirez les barres d’oreille et la sonde de température, tournez l’isoflurane et retirez l’animal de la barre de palette et transférez-le dans la cage de récupération. Enfin, surveillez de près la récupération.Une fois que l’animal est complètement éveillé, se déplaçant et ne montrant aucun signe de douleur ou de détresse, transférez-le dans sa cage et retournez la cage au vivarium. Utilisez des méthodes standard de pince à patch pour faire des enregistrements. Commencez par placer la tranche dans une chambre d’enregistrement sous un microscope droit à stade fixe et profusez continuellement avec du liquide céphalo-rachidien artificiel à deux millilitres par minute.Ensuite, patch neurones sous contrôle visuel à l’aide d’un amplificateur de pince patch approprié. Enfin, lors d’enregistrements en gros, activez Chronos en livrant de brèves impulsions de lumière de 470 nanomètres ou de ChrimsonR par de brèves impulsions de lumière de 580 nanomètres grâce à des LED disponibles dans le commerce. Les résultats ont indiqué que l’injection de ChrimsonR a mené à l’expression forte dans le DCN avec la fluorescence de tdTomato visible dans les cellules et les fibres.Dans la CPI contralatérale, les fibres fortement étiquetées avec tdTomato étaient clairement visibles après trois semaines, démontrant la capacité de trafic à longue portée de la construction ChrimsonR-tdTomato lorsqu’elles sont injectées dans des noyaux auditifs de tige cérébrale. Activation optique des EPSP allongés ChrimsonR dans les neurones VIP IC, ce qui indique que ChrimsonR est un outil utile pour les expériences à longue portée cracm lorsque les paramètres expérimentaux exigent l’utilisation de la lumière rouge au lieu de la lumière bleue. Cependant, nous avons constaté que ChrimsonR a été facilement activé avec la lumière bleue, montrant le même seuil pour l’activation de la lumière bleue que Chronos.Pour ce protocole, il est très important de s’assurer que les coordonnées stéréotaxiques sont correctes et de confirmer que le virus n’a été exprimé que dans votre région ciblée du cerveau. En échangeant le Chronos ChrimsonR viroconstruct avec un autre virus, par exemple, un virus Flex spécifique à une cellule, vous pouvez répondre à plusieurs questions anatomiques ou physiologiques sans modifier le protocole de chirurgie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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