Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da una Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, progetto numero 401540516, alla DG) e national Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).

Ottenere l'approvazione del Comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e attenersi alle linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure di questo protocollo sono state approvate dall'Università del Michigan IACUC ed erano conformi alle linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione Chirurgia
<ol><li>Eseguire interventi chirurgici in condizioni asettiche. Autoclave/sterilizzare tutti gli strumen...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

Abbiamo scoperto che CRACM è una tecnica potente per identificare e caratterizzare gli input sinaptici a lungo raggio ai neuroni nel mouse IC. Seguendo il protocollo qui descritto, abbiamo ottenuto una robusta trasfezione dei neuroni nella DCN e nell'IC, nonché un affidabile traffico assonale di Chronos e ChrimsonR nei terminali sinaptici nell'IC. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa tecnica consente la misurazione e l'analisi di eventi post-sinaptici, tra cui ampiezza PSP, mezza larghezza, tempo di decadimento e far...

Le connessioni sinaptiche sono fondamentali per la funzione del circuito neurale, ma la topologia precisa e la fisiologia delle sinapsi all'interno dei circuiti neurali sono spesso difficili da sondare sperimentalmente. Questo perché la stimolazione elettrica, lo strumento tradizionale dell'elettrofisiologia cellulare, attiva indiscriminatamente gli assoni vicino al sito di stimolazione, e nella maggior parte delle regioni cerebrali, gli assoni provenienti da fonti diverse (locali, ascendenti e/o discendenti) si intrecciano. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, questa limitazione può ora essere superata3. La channelrhodopsin (ChR2) è un canale ionico selettivo di luce originariamente presente nell'alga verde Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 può essere attivato dalla luce blu di una lunghezza d'onda intorno a 450-490 nm, depolarizzando la cellula attraverso l'afflusso di cation. ChR2 è stato descritto ed espresso per la prima volta in Xenopus oocytes da Nagel e colleghi4. Poco dopo, Boyden e colleghi5 hanno espresso ChR2 nei neuroni mammiferi e hanno dimostrato che potrebbero utilizzare impulsi di luce per controllare in modo affidabile l'abbagliamento su una scala temporale di millisecondi, inducendo potenziali di azione 10 ms dopo l'attivazione di ChR2 con luce blu. I canali optogenetici con cinetica ancora più veloce sono stati trovati di recente (ad esempio, Chronos6).
L'approccio di base a un esperimento CRACM è quello di transfetare una popolazione di neuroni pressinaptici putativi con un virus ricombinante adeno-associato (rAAV) che trasporta le informazioni genetiche per una channelrhodopsin. La trasfezione dei neuroni con rAAV porta all'espressione della channelrhodopsin codificata. Tipicamente, la channelrhodopsin è etichettata con una proteina fluorescente come GFP (Green Fluorescent Protein) o tdTomato (una proteina fluorescente rossa), in modo che la trasfezione dei neuroni nella regione bersaglio possa essere facilmente confermata con l'imaging di fluorescenza. Poiché i RAAV sono non patogeni, hanno un basso potenziale infiammatorio e un'espressione genica di lunga durata7,8, sono diventati una tecnica standard per fornire channelrhodopsins ai neuroni. Se, dopo la trasfezione di una popolazione pressiratica putativa di neuroni, l'attivazione di una channelrhodopsin attraverso lampi di luce suscita potenziali post-sinaptici o correnti nei neuroni bersaglio, questa è la prova di una connessione assonale dal nucleo trascurato alla cellula registrata. Poiché gli assoni recisi negli esperimenti sulle fette cerebrali possono essere spinti a rilasciare il neurotrasmettitore attraverso l'attivazione della channelrhodopsin, i nuclei che si trovano al di fuori della fetta acuta ma inviano assoni nella regione post-sinaptica del cervello possono essere identificati con CRACM. La potenza di questa tecnica è che la connettività e la fisiologia degli input sinaptici a lungo raggio identificati possono essere studiate direttamente.
Oltre alle channelrhodopsins che sono eccitabili dalla luce blu, gli investigatori hanno recentemente identificato diverse channelrhodopsins rosso-shifted9,10, tra cui Chrimson e la sua più veloce analogico ChrimsonR, entrambi i quali sono eccitati con la luce rossa di 660 nm6. Opsins rosso-spostato sono di interesse perché la luce rossa penetra tessuto meglio della luce blu, e la luce rossa può avere una citotossicità inferiore rispetto alla luce blu10,11,12. Le channelrhodopsins spostate in rosso aprono anche la possibilità di esperimenti CRACM a doppio colore, dove la convergenza di assoni da nuclei diversi sullo stesso neurone può essere testata in un esperimento6,13,14. Tuttavia, gli attuali opsin rossi spesso presentano un'attivazione incrociata indesiderata con luce blu15,16,17, rendendo difficili due esperimenti di colore. Inoltre, alcuni rapporti hanno indicato che ChrimsonR subisce un traffico assonale limitato, il che può rendere difficile l'utilizzo di ChrimsonR per esperimenti CRACM16,17.
Quasi tutte le proiezioni ascendenti dai nuclei del tronco encefalico meno basso convergono nel collicolo inferiore (IC), il centro cerebrale del percorso uditivo centrale. Questo include proiezioni dal nucleo cocleare (CN)18,19, la maggior parte del complesso di oliva superiore (SOC)20, e i nuclei dorsali (DNLL) e ventrale (VNLL) del lemniscus laterale21. Inoltre, una grande proiezione discendente dalla corteccia uditiva termina nei neuroni IC18,19,20,21,22e IC stessi si napsi ampiamente all'interno dei lobi locali e contralaterali dell'IC23. L'intreccio di assoni provenienti da molte fonti ha reso difficile sondare circuiti IC utilizzando la stimolazione elettrica24. Di conseguenza, anche se i neuroni nell'IC eseguono calcoli importanti per la localizzazione del suono e l'identificazione del discorso e di altri suoni di comunicazione25,26, l'organizzazione dei circuiti neurali nell'IC è in gran parte sconosciuta. Recentemente abbiamo identificato i neuroni VIP come la prima classe di neuroni identificabili molecolarmente nell'IC27. I neuroni VIP sono neuroni stellati glutamatergici che proiettano su diversi obiettivi a lungo raggio, tra cui il talamo uditivo e il collicolo superiore. Ora siamo in grado di determinare le fonti e la funzione degli input locali e a lungo raggio ai neuroni VIP e di determinare come queste connessioni di circuito contribuiscono all'elaborazione del suono.
Il protocollo qui presentato è basato su misura per studiare gli input sinaptici ai neuroni VIP nell'IC dei topi, in particolare dall'IC contralaterale e dal DCN (Figura 1). Il protocollo può essere facilmente adattato a diverse fonti di input, un diverso tipo di neurone o una regione del cervello diversa del tutto. Dimostriamo anche che ChrimsonR è un'efficace channelrhodopsin con spostamento rosso per la mappatura dei circuiti a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo. Tuttavia, dimostriamo che ChrimsonR è fortemente attivato dalla luce blu, anche a bassa intensità, e quindi, per combinare ChrimsonR con Chronos in esperimenti CRACM a due colori, è necessario utilizzare controlli accurati per prevenire l'attivazione incrociata di ChrimsonR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

Quando si studiano i circuiti neurali, una limitazione standard dell'approccio di morsetto patch in vitro è che gli assoni provenienti da più fonti sono spesso intermixed, rendendo difficile isolare gli input da singole fonti con stimolazione elettrica. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assistited circuit mapping (CRACM), questa limitazione può ora essere superata. Qui, riportiamo un metodo per utilizzare CRACM per mappare gli input ascendenti da nuclei del tronco encefalico meno bassi uditivi e input commissurali a una classe identificata di neuroni nel collicolo inferiore (IC), il nucleo midbrain del sistema uditivo. Nell'IC, gli assoni locali, commissri, ascendenti e discendenti sono fortemente intrecciati e quindi indistinguibili dalla stimolazione elettrica. Iniettando un costrutto virale per guidare l'espressione di una channelrhodopsin in un nucleo presintatico, seguita dalla registrazione dei blocchi di patch per caratterizzare la presenza e la fisiologia degli ingressi sinaptici che esprimono channelrhodopsin, proiezioni da una fonte specifica a una popolazione specifica di neuroni IC possono essere mappati con precisione specifica del tipo di cellula. Dimostriamo che questo approccio funziona sia con Chronos, una channelrhodopsin ad attivazione della luce blu, sia con ChrimsonR, una channelrhodopsin con cambio rosso. In contrasto con i precedenti rapporti dal prosencefalo, troviamo che ChrimsonR è robustamente trafficato lungo gli assi dei neuroni principali del nucleo cocleare dorsale, indicando che ChrimsonR può essere uno strumento utile per gli esperimenti CRACM nel tronco encefalico. Il protocollo qui presentato include descrizioni dettagliate della chirurgia di iniezione di virus intracranico, incluse le coordinate stereotassiche per indirizzare le iniezioni al nucleo cocleare dorsale e all'IC dei topi, e come combinare la registrazione dei morsetti a tutta cella con attivazione della channelrhodopsin per studiare le proiezioni a lungo raggio ai neuroni IC. Anche se questo protocollo è adattato per caratterizzare gli input uditivi all'IC, può essere facilmente adattato per studiare altre proiezioni a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo e oltre.

Abbiamo attraversato topi VIP-IRES-Cre(Viptm1 (cre) -Jh/J) e topi Cre-reporter Ai14 (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) per generare la prole F1 in cui i neuroni VIP esprimono la proteina fluorescente tdTomato. È stata usata la prole F1 di entrambi i sessi, il giorno postnatale (P) da 21 a P70. In questo studio sono stati utilizzati in totale 22 animali.
Iniezione stereotassica ...

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Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

La mappatura dei circuiti assistiti da channelrhodopsin (CRACM) è una tecnica di precisione per la mappatura funzionale delle proiezioni neuronali a lungo raggio tra gruppi di neuroni anatomicamente e/o geneticamente identificati. Qui, descriviamo come utilizzare CRACM per mappare le connessioni uditive del tronco, incluso l'uso di un opsin in rosso, ChrimsonR.

Mappatura del circuito a lungo raggio assistita da Channelrhodopsin dei neuroni Colliculus inferiori con Channelrhodopsins blu e rosso

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

La mappatura del circuito assistito da channelrhodopsin è una tecnica di precisione per la mappatura funzionale di proiezioni neurali a lungo raggio. Qui, mostriamo come usare questo approccio per indagare i circuiti nel tronco uditivo del cervello. Nelle fette cerebrali, gli assoni provenienti da più fonti sono spesso intermixati, rendendo difficile isolare i singoli input usando la stimolazione elettrica.Utilizzando CRACM, questa limitazione può essere superata. Trovare lambda e definire costantemente il sistema di coordinate stereotassiche è impegnativo così come mantenere breve la durata della procedura. Avere tutti i passaggi accuratamente mappati aumenterà il tuo tasso di successo.Inizia spruzzando l'area chirurgica con il 70% di etanolo per sanificare e posizionare tende per asciugamani sterili per coprire l'area dell'intervento chirurgico. Rimuovere la lettiera a gabbia per limitare il rischio di asfissia dalla gabbia di recupero. Quindi, metti una pastiglia di riscaldamento sotto la gabbia e fornisci una fonte di cibo e acqua.Successivamente, trasferire l'animale in una cornice stereotassica e continuare l'anestesia. Inserire una sonda di temperatura rettale e accendere il regolatore di temperatura omeostatico. Quindi, applicare un unguento oftalmico per evitare che gli occhi si asciughino.Somministrare analgesico preemptivo. Infine, radere il cuoio capelluto con tosaerba elettriche. Disinfettare il cuoio capelluto con tre tamponi alternati di iodio di povidone e 70% di etanolo.Inizia l'intervento chirurgico facendo un'incisione nel cuoio capelluto lungo la linea mediana, iniziando tra le orecchie e continuando rostrale agli occhi, esponendo le suture lambda e bregma. Spingere la pelle di lato e rimuovere il periostio dall'osso esposto, se necessario. Quindi, contrassegnare la sutura lambda con un marcatore chirurgico, posizionare la punta del nano-iniettore in modo che tocchi solo lambda e azzerare le coordinate del micromanipolatore.Utilizzare la punta del nano-iniettore e il micromanipolatore per misurare la differenza di elevazione tra le suture lambda e bregma. Regola l'altezza della barra della tavolozza per portare lambda e bregma entro più o meno 100 micrometri di differenza di altezza. Mappare il sito di iniezione utilizzando la punta del nano-iniettore e il sistema di coordinate del micromanipolatore e contrassegnare il sito con un marcatore chirurgico.Quindi, utilizzare un trapano micromotore con una bava di perforazione di 0,5 millimetri per eseguire una craniotomia sul sito di iniezione. Per garantire un'ampia trasfezione dei neuroni nel nucleo bersaglio, utilizzare un nano-iniettore per fare iniezioni a varie profondità nel tessuto e nel caso di regioni cerebrali più grandi, come il collicolo inferiore, fare iniezioni nel corso di due o più penetrazioni a diverse coordinate X e Y. Per iniettare il collicolo inferiore, depositare 20 nanolitri di virus negli intervalli di 250 micrometri lungo l'asse Z tra 2.250 micrometri e 1.750 micrometri di profondità.Per le iniezioni nel nucleo cocleare dorsale, depositare 20 nanolitri di virus a una profondità rispettivamente di 4.750 micrometri e 4.550 micrometri. Dopo aver iniettato ad ogni coordinata Z, attendere da due a tre minuti prima di spostare l'iniettore alla coordinata Z successiva per consentire al virus di diffondersi lontano dal sito di iniezione, riducendo la probabilità che il virus venga risucchiato nel tratto di iniezione quando il nano-iniettore viene riposizionato. Quindi, dopo l'ultima iniezione, attendere da tre a cinque minuti prima di ritrarre il nano-iniettore dal cervello.Quando il nano-iniettore viene rimosso dal cervello tra le penetrazioni e tra gli animali, espellere un piccolo volume di virus dalla punta per verificare che la punta non si sia intasata. Dopo le iniezioni, utilizzare PBS sterile per bagnare i bordi tagliati del cuoio capelluto e quindi spostare delicatamente la pelle verso la linea mediana. Chiudere la ferita con semplici suture interrotte utilizzando 6-0 suture di nylon.Quindi, applicare 0,5 a un millilitro di gelatina di lidocaina al 2% sulla ferita. Rimuovere le barre dell'orecchio e la sonda di temperatura, girare l'isoflurane e rimuovere l'animale dalla barra della tavolozza e trasferirlo nella gabbia di recupero. Infine, monitorare attentamente la ripresa.Una volta che l'animale è completamente sveglio, muovendosi e non mostrando segni di dolore o angoscia, trasferiscilo di nuovo nella sua gabbia e riporta la gabbia al vivaio. Utilizzare metodi standard di patch clamp per effettuare registrazioni. Inizia posizionando la fetta in una camera di registrazione sotto un microscopio verticale a stadio fisso e continuamente abbondante con liquido cerebrospinale artificiale a due millilitri al minuto.Successivamente, patch neuroni sotto controllo visivo utilizzando un amplificatore patch clamp adatto. Infine, durante le registrazioni all'ingrosso, attivare Chronos fornendo brevi impulsi di luce di 470 nanometri o ChrimsonR con brevi impulsi di luce di 580 nanometri attraverso LED disponibili in commercio. I risultati hanno indicato che l'iniezione di ChrimsonR ha portato a una forte espressione nel DCN con fluorescenza tdTomato visibile in cellule e fibre.Nell'ICC contralaterale, le fibre fortemente etichettate con tdTomato erano chiaramente visibili dopo tre settimane, dimostrando la capacità di traffico a lungo raggio del costrutto ChrimsonR-tdTomato quando iniettate nei nuclei uditivi del tronco encefalico. Attivazione ottica di EPS elicted ChrimsonR nei neuroni VIP IC, indicando che ChrimsonR è uno strumento utile per esperimenti CRACM a lungo raggio quando i parametri sperimentali richiedono l'uso della luce rossa invece della luce blu. Tuttavia, abbiamo scoperto che ChrimsonR è stato prontamente attivato con la luce blu, mostrando la stessa soglia per l'attivazione della luce blu di Chronos.Per questo protocollo è più importante assicurarsi che le coordinate stereotassiche siano corrette e confermare che il virus è stato espresso solo nella regione cerebrale mirata. Scambiando il virocostruzione Chronos ChrimsonR con un virus diverso, ad esempio un virus Flex specifico per le cellule, è possibile rispondere a diverse domande anatomiche o fisiologiche senza modificare il protocollo chirurgico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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