Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

이 작품은 도이치 Forschungsgemeinschaft 연구 펠로우십 (GO 3060/1-1, 프로젝트 번호 401540516, DG) 및 국립 보건 원부 R56 DC016880 (MTR)에 의해 지원되었습니다.

현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수합니다. 이 프로토콜의 모든 절차는 미시간 대학교 IACUC에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 승인되었습니다.
1. 수술 준비
<ol><li>무균 조건에서 수술을 수행합니다. 오토클레이브/수술 전에 모든 수술 도구 및 재료를 소독하십시?...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

우리는 CRACM이 마우스 IC에 있는 뉴런에 장거리 시냅스 입력을 확인하고 특성화하기 위한 강력한 기술이다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 DCN 및 IC에서 뉴런의 강력한 트랜스펙션뿐만 아니라 IC의 시냅스 터미널에 크로노스와 ChrimsonR의 신뢰할 수있는 축산 인신 매매를 달성했습니다. 또한, 우리는 이 기술이 PSP 진폭, 하프 폭, 부패 시간 및 수용체 약리...

시냅스 연결은 신경 회로 기능에 매우 중요하지만, 신경 회로 내의 시냅스의 정확한 토폴로지와 생리학은 종종 실험적으로 조사하기가 어렵습니다. 이는 세포 전기 생리학의 전통적인 도구인 전기 자극이 자극 부위 근처의 축사를 무차별적으로 활성화하고 대부분의 뇌 영역에서 다른 소스(로컬, 오름차순 및/또는 내림차순)의 축축을 서로 연결하기 때문입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)1,2를사용하여, 이러한 제한은 이제3을극복 할 수있다 . 채널로도셉신(ChR2)은 원래 녹색 조류 클라미도모나스 린하르트티에서발견되는 광 활성화, 양이온 선택적 이온 채널이다. ChR2는 450-490 nm 의 파장의 청색광에 의해 활성화될 수 있으며, 양이온 유입을 통해 세포를 탈분극화할 수 있다. ChR2는 먼저 나겔과 동료4에의해 제노푸스 oocytes에서 설명하고 표현되었다. 그 직후, Boyden과 동료5 포유류 뉴런에서 ChR2를 표현하고 그들이 안정적으로 밀리 초 타임 스케일에 스파이크를 제어하는 광 펄스를 사용할 수 있음을 보여 주었다, 블루 라이트와 ChR2의 활성화 후 ~ 10 ms 행동 전위를 유도. 더 빠른 역학을 가진 광유전학 채널은 최근에 발견되었습니다 (예를 들어, 크로노스6).
CRACM 실험에 대한 기본적인 접근법은 채널로도프신에 대한 유전 정보를 전달하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)로 가설전전 시냅스 뉴런의 집단을 트랜스펙트하는 것이다. rAAV를 가진 뉴런의 형질감염은 인코딩된 채널로도프신의 발현을 이끈다. 전형적으로, 채널로집신은 GFP (녹색 형광 단백질) 또는 tdTomato (적색 형광 단백질) 같이 형광 단백질로 꼬리표를 붙입니다, 그래서 표적 지구에 있는 신경의 형질감염은 형광 화상 진찰로 쉽게 확인될 수 있습니다. rAAV는 비병원성이기 때문에, 낮은 염증 전위 및 오래 지속되는 유전자발현7,8,그들은 뉴런에 채널로도신을 전달하는 표준 기술이 되었다. 만약, 뉴런의 시냅스 전 형질전환 후, 빛 깜박임을 통한 채널로도냅신의 활성화가 표적 뉴런의 후통 전위 또는 전류를 유도하는 경우, 이것은 형질전환된 핵에서 기록된 세포로의 축삭 연결의 증거이다. 뇌 슬라이스 실험에서 절단 된 축삭은 channelrhodopsin 활성화를 통해 신경 전달 물질을 방출하도록 구동 될 수 있기 때문에, 급성 슬라이스의 외부에 놓여 있지만 후시 냅스 뇌 영역으로 축삭을 보내는 핵은 CRACM으로 식별 할 수 있습니다. 이 기술의 힘은 확인 된 장거리 시 냅 스 입력의 연결 및 생리 직접 조사 될 수 있다.
청색광에 의해 흥분되는 channelrhodopsins 이외에, 조사자는 최근에 Chrimson및 그것의 더 빠른 아날로그 ChrimsonR를 포함하여 몇몇 적색 이동 채널로도실9,10를확인했습니다, 둘 다 ~ 660 nm6의빨간 빛으로 흥분됩니다. 적색시프트 옵신은 청색광보다 조직에 더 잘 침투하기 때문에 관심의, 적색광은청색광(10,11,12)보다세포독성이 낮을 수 있다. 적색 이동 채널러도프신은 또한 동일한 뉴런상에 상이한 핵으로부터 축세포의 수렴이 하나의실험6,13,14에서시험될 수 있는 이중색 CRACM 실험의 가능성을 열어주어있다. 그러나, 현재 적색 이동 opsins 종종 블루 라이트와 원치 않는 교차 활성화를 전시15,16,17,두 가지 색상 실험을 어렵게 만들기. 또한, 일부 보고서는 ChrimsonR이 제한된 축산 인신 매매를 겪고 있음을 지적했으며, 이는 CRACM 실험16,17에ChrimsonR을 사용하기가 어려울 수 있습니다.
하부 청각 뇌간 핵에서 거의 모든 오름차순 예측은 열등한 콜리큘러스 (IC)에 수렴, 중앙 청각 통로의 중뇌 허브. 이는 달팽이관 핵(CN)18,19,대부분의 우수한 올리바리 복합체(SOC)20,및 측면 lemniscus21의등쪽(DNLL) 및 복부(VNLL) 핵으로부터의 투영을 포함한다. 부가적으로, 청각 피질로부터의 큰 내림차순 투영은 IC18,19,20,21,22,및 IC 뉴런 자체가 IC23의국소 및 반대측 엽 내에서 광범위하게 시냅스로 종료된다. 많은 소스에서 축색의 혼합은 전기 자극(24)을사용하여 IC 회로를 프로브하기 어렵게했다. 그 결과, IC 내의 뉴런들이 건전한 국소화 및 음성 및 기타 통신소리의 식별에 중요한 계산을 수행하더라도25,26,IC 내의 신경 회로의 조직은 크게 알려지지 않았다. 우리는 최근에 IC27에있는 첫번째 분자로 식별가능한 뉴런 으로 VIP 뉴런을 확인했습니다. VIP 뉴런은 청각 시상및 우수한 콜리큘러스를 포함한 여러 장거리 표적에 투영되는 글루타마테르이트 성세포 뉴런이다. 이제 VIP 뉴런에 대한 로컬 및 장거리 입력의 소스와 기능을 결정하고 이러한 회로 연결이 사운드 처리에 어떻게 기여하는지 확인할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 마우스의 IC에서 VIP 뉴런에 대한 시냅스 입력을 조사하기 위해, 특히 반대쪽 IC 및 DCN(그림1)에서맞춤화된다. 프로토콜은 입력의 다른 근원, 다른 신경 모형 또는 전부 다른 두뇌 지구에 쉽게 적응될 수 있습니다. 우리는 또한 ChrimsonR청각 뇌간에서 장거리 회로 매핑을위한 효과적인 적색 이동 채널로도프신임을 보여줍니다. 그러나 ChrimsonR은 낮은 강도에서도 청색광에 의해 강력하게 활성화되어 있으므로 ChrimsonR과 크로노스를 2가지 색상의 CRACM 실험에서 결합하기 위해서는 ChrimsonR의 교차 활성화를 방지하기 위해 신중한 컨트롤을 사용해야 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

신경 회로를 조사할 때, 시험관 내 패치 클램프 접근법의 표준 제한은 여러 소스의 축슨이 종종 혼합되어 전기 자극을 가진 개별 소스로부터 입력을 분리하는 것을 어렵게 만드는 것입니다. 그러나, channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)을 사용하여, 이러한 한계는 이제 극복 할 수있다. 여기에서, 우리는 낮은 청각 뇌간 핵및 commissural 입력에서 청각 시스템의 중간 뇌 핵인 열등한 콜리큘러스 (IC)에 있는 신경의 확인된 부류에 오름차순 입력을 지도로 하기 위하여 CRACM를 이용하는 방법을 보고합니다. IC에서, 로컬, 커미션, 오름차순 및 내림차순 축색은 무겁게 얽혀 있고 따라서 전기 자극과 구별할 수 없습니다. 시냅스 핵에서 채널로덕신의 발현을 유도하기 위해 바이러스 성 구조를 주입하고, 패치 클램프 기록을 이어서 채널로도셉신 발현 시냅스 입력, 특정 소스로부터의 프로젝션의 존재 및 생리학을 특성화한다. IC 뉴런의 특정 집단에 세포 유형별 정확도로 매핑될 수 있다. 이 접근법은 청색 광 활성화 채널러도셉신인 크로노스와 적색 채널로도이프신인 ChrimsonR과 함께 작동한다는 것을 보여줍니다. 전뇌의 이전 보고서와는 달리, 우리는 ChrimsonR이 등지 달팽이관 핵 주요 뉴런의 축축을 강력하게 인신 매매하고 있음을 발견하며, 이는 ChrimsonR이 뇌간 CRACM 실험에 유용한 도구가 될 수 있음을 나타냅니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 쥐의 등쪽 달팽이관 핵 및 IC에 주사를 표적으로 하는 입체 좌표를 포함하여 두개내 바이러스 주사 수술에 대한 자세한 설명과 전체 세포 패치 클램프 기록을 결합하는 방법 등이 포함되어 있습니다. IC 뉴런에 대한 장거리 프로젝션을 조사하기 위해 채널로도셉신 활성화를 통해 이 프로토콜은 IC에 청각 입력을 특성화하는 데 맞춤화되어 있지만, 청각 뇌간 및 그 너머의 다른 장거리 예측을 조사하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

우리는 VIP-IRES-Cre 마우스(VIPtm1 (cre)Zjh/J)와 Ai14 Cre-리포터 마우스 (B6)를 교차했습니다. CG-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)는VIP 뉴런이 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 F1 자손을 생성한다. 어느 성별의 F1 자손이 사용되었고, 산후일(P) 21 에서 P70으로 사용되었다. 이 연구에서는 총 22마리의 동물이 사용되었습니다.
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Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)은 해부학 및 / 또는 유전적으로 식별 된 뉴런 그룹 사이의 장거리 신경 투영의 기능 적 매핑을위한 정밀 기술입니다. 여기에서는 CRACM을 사용하여 적색 이동 옵신, ChrimsonR의 사용을 포함하여 청각 뇌간 연결을 매핑하는 방법을 설명합니다.

청색 및 적색 이동 채널로도프신을 가진 열등한 콜리큘러스 뉴런의 장거리 채널로돕신 보조 회로 매핑

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

채널로독신 지원 회로 매핑은 장거리 신경 프로젝션의 기능적 매핑을 위한 정밀 기술입니다. 여기에서, 우리는 청각 두뇌 줄기에 있는 회로를 조사하기 위하여 이 접근을 사용하는 방법을 보여줍니다. 뇌 슬라이스에서 여러 소스의 축축이 혼합되어 전기 자극을 사용하여 개별 입력을 분리하기가 어렵습니다.CRACM을 사용하면 이러한 제한을 극복할 수 있습니다. lambda를 찾고 지속적으로 스테레오탁스 좌표 시스템을 정의하는 것은 절차의 지속 시간을 짧게 유지하는 것처럼 어렵습니다. 모든 단계를 신중하게 매핑하면 성공률이 높아집니다.먼저 수술 부위를 70%에탄올로 분사하여 살균 할 수 있도록 수건 커튼을 배치하여 수술 부위를 덮습니다. 케이지 침구를 제거하여 복구 케이지에서 질식의 위험을 제한합니다. 다음으로, 케이지 아래에 난방 패드를 넣고 음식과 수원을 제공합니다.다음으로, 동물을 스테레오테틱 프레임으로 옮기고 마취를 계속합니다. 직장 온도 프로브를 삽입하고 동종 온도 컨트롤러를 켭타코전환합니다. 그런 다음 안과 연고를 적용하여 눈이 건조되는 것을 방지하십시오.선제적 진통제를 투여합니다. 마지막으로, 전기 클리퍼와 두피를 면도. 포비도네 요오드3개와 70%에탄올로 두피를 소독합니다.중간선을 따라 두피에 절개를 하고, 귀사이를 시작하고 눈에 장밋빛을 계속시켜 람다와 브레그마 봉합사를 노출시켜 수술을 시작합니다. 피부에 옆으로 밀어 내고 필요한 경우 노출된 뼈에서 골라기질을 제거합니다. 다음으로, 램다 봉합사를 외과 마커로 표시하고, 나노 인젝터의 끝을 배치하여 람다만 만지고 마이크로 조작기 좌표를 0으로 설정합니다.나노 인젝터 팁과 미세 조작기를 사용하여 람다와 브레그마 봉합사 사이의 표고 차이를 측정합니다. 팔레트 바 높이를 조정하여 람다와 브레그마를 플러스 또는 마이너스 100 마이크로미터 높이 차이로 가져옵니다. 나노 인젝터 팁 및 미세 조작기 좌표 시스템을 사용하여 사출 부위를 매핑하고 수술 마커로 사이트를 표시합니다.그런 다음 0.5밀리미터 드릴 버가 있는 마이크로모터 드릴을 사용하여 주사 부위에 두개골 절제술을 수행합니다. 표적 핵에서 뉴런의 광범위한 침투를 보장하기 위해 나노 인젝터를 사용하여 조직의 다양한 깊이에서 주사를 만들고 열등한 콜리큘러스와 같은 더 큰 뇌 영역의 경우 다른 X 및 Y 좌표에서 두 개 이상의 침투를 통해 주사를 만듭니다. 열등한 콜리큘러스를 주입하려면 2, 250 마이크로미터 와 1, 750 마이크로미터 깊이 사이의 Z 축을 따라 250 마이크로미터의 간격으로 20 나노리터의 바이러스를 증착하십시오.등쪽 달팽이관 핵에 주사를 대 한, 예금 20 나노 리터의 깊이4, 750 마이크로 미터 와 4, 550 마이크로 미터 각각. 각 Z 좌표에 주입 한 후, 바이러스가 주입 부위에서 확산 될 수있는 시간을 허용하기 위해 다음 Z 좌표로 인젝터를 이동하기 전에 2 ~ 3 분 기다린 후, 나노 인젝터가 재배치 될 때 바이러스가 주사 기관을 빨아 질 확률을 감소. 그런 다음 마지막 주사 후 뇌에서 나노 인젝터를 철회하기 전에 3 ~5 분 정도 기다립니다.나노 인젝터가 침투와 동물 사이의 뇌에서 제거되면 팁이 막히지 않은지 확인하기 위해 팁에서 소량의 바이러스를 배출합니다. 주사 후 멸균 PBS를 사용하여 두피의 절단 된 가장자리를 적신 다음 피부를 미드 라인쪽으로 부드럽게 움직입니다. 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 상처를 닫습니다.그런 다음 상처에 2 %리도카인 젤리의 1 밀리리터에 0.5를 적용하십시오. 이어 바 및 온도 프로브를 제거하고 이소플루란을 돌리고 팔레트 바에서 동물을 제거하고 복구 케이지로 옮습니다. 마지막으로 복구를 면밀히 모니터링합니다.동물이 완전히 깨어 나고, 움직이고, 고통이나 고통의 흔적을 보이지 않고, 케이지로 다시 옮기고 케이지를 비바리움으로 되돌리십시오. 표준 패치 클램프 메서드를 사용하여 레코딩을 만듭니다. 먼저 고정 된 단계 직립 현미경 의 밑에 기록 챔버에 슬라이스를 배치하고 분당 2 밀리리터에서 인공 뇌척수액으로 지속적으로 교감하십시오.다음으로, 적절한 패치 클램프 증폭기사용으로 시각적 제어 하에 뉴런을 패치한다. 마지막으로, 도매 녹음 중에 시판되는 LED를 통해 580나노미터 광의 짧은 펄스로 470나노미터 광 또는 ChrimsonR의 짧은 펄스를 제공함으로써 크로노를 활성화합니다. 결과는 ChrimsonR 주입이 세포와 섬유에서 보이는 tdTomato 형광을 가진 DCN에 있는 강한 발현으로 이끌어 낸다는 것을 표시했습니다.반대로 ICC에서는, tdTomato로 강하게 표지된 섬유는 청각 두뇌 줄기 핵에 주입될 때 ChrimsonR-tdTomato 구조물의 장거리 인신 매매 능력을 보여주는 3 주 후에 명확하게 보였습니다. ChrimsonR의 광학 활성화는 IC VIP 뉴런에서 EPSP를 유도하여, 실험 파라미터가 청색광 대신 적색광사용을 요구할 때 ChrimsonR이 장거리 CRACM 실험을 위한 유용한 도구임을 나타냅니다. 그러나 ChrimsonR이 블루 라이트로 쉽게 활성화되어 크로노스와 동일한 청색광 활성화임계값을 표시하는 것으로 나타났습니다.이 프로토콜의 경우 입체 좌표가 올바른지 확인하고 바이러스가 대상 뇌 영역에서만 표현되었는지 확인하는 것이 가장 중요합니다. 크로노스 ChrimsonR viroconstruct을 다른 바이러스와 교환함으로써, 예를 들어, 세포 특정 플렉스 바이러스, 수술 프로토콜을 변경하지 않고 여러 해부학적 또는 생리적 질문에 대답할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

동시 MEG와 EEG와 기능 매핑

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

연구

신경과학

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

세포 내 기록, 감각이 필드를 매핑하고, 거머리의 배양 확인 된 뉴런, Hirudo의 medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

피사체 이미지 순열을 이용한 종자 기반 d 매핑을 사용한 복셀 기반 신경 이미징 연구의 메타 분석(SDM-PSI)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...