Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, prosjektnummer 401540516, til DG) og National Institutes of Health stipend R56 DC016880 (MTR).

Få godkjenning fra den lokale institusjonelle dyreverns- og brukskomiteen (IACUC) og følg NIH-retningslinjene for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Alle prosedyrer i denne protokollen ble godkjent av University of Michigan IACUC og var i samsvar med NIH retningslinjer for omsorg og bruk av laboratoriedyr.
1. Kirurgi Forberedelser
<ol><li>Utfør operasjoner under aseptiske forhold. Autoklav/steriliser alle kirurgi verktøy og materialer før operasjonen. Bruk kirurgi kjole og maske for oper...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

Vi har funnet ut at CRACM er en kraftig teknikk for å identifisere og karakterisere synaptiske innganger i lang rekkevidde til nevroner i musen IC. Etter protokollen som er beskrevet her, oppnådde vi robust transfection av nevroner i DCN og IC, samt pålitelig aksonal handel av Chronos og ChrimsonR til synaptiske terminaler i IC. I tillegg viste vi at denne teknikken muliggjør måling og analyse av postsynaptiske hendelser, inkludert PSP amplitude, halfwidth, forfalltid og reseptorfarmakologi. Vår erfaring tyder på ...

Synaptiske forbindelser er avgjørende for neural kretsfunksjon, men den nøyaktige topologien og fysiologien til synapser innenfor nevrale kretser er ofte vanskelige å sondere eksperimentelt. Dette skyldes at elektrisk stimulering, det tradisjonelle verktøyet for cellulær elektrofysiologi, ukritisk aktiverer aksoner i nærheten av stimuleringsstedet, og i de fleste hjerneregioner henger aksoner fra forskjellige kilder (lokalt, stigende og/eller synkende). Men ved hjelp av channelrhodopsin assistert kretskartlegging (CRACM)1,2, kan denne begrensningen nåovervinnes 3. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktivert, kation-selektiv ion kanal opprinnelig funnet i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres av blått lys av en bølgelengde rundt 450-490 nm, depolarisere cellen gjennom kation tilstrømning. ChR2 ble først beskrevet og uttrykt i Xenopus oocytes av Nagel og kolleger4. Kort tid etter det uttrykte Boyden og kolleger5 ChR2 i pattedyrnevroner og viste at de kunne bruke lyspulser til pålitelig kontroll på en millisekund tidsskala, induserehandlingspotensialer ~ 10 ms etter aktivering av ChR2 med blått lys. Optogenetiske kanaler med enda raskere kinetikk har blitt funnet nylig (f.eks. Chronos6).
Den grunnleggende tilnærmingen til et CRACM-eksperiment er å transfect en populasjon av antatte presynaptiske nevroner med en rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) som bærer genetisk informasjon for en channelrhodopsin. Transfection av nevroner med rAAV fører til uttrykk for kodet channelrhodopsin. Vanligvis er channelrhodopsin merket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescent Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), slik at transfection av nevroner i målområdet lett kan bekreftes med fluorescensavbildning. Fordi rAAVs er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potensial og langvarig genuttrykk7,8, har de blitt en standard teknikk for å levere channelrhodopsins til nevroner. Hvis aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysblinker, etter transfeksjon av en antatt presynaptisk populasjon av nevroner, fremkaller aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysglimt postsynaptiske potensialer eller strømmer i målnevronene, dette er bevis på en aksonal forbindelse fra den transinfiserte kjernen til den registrerte cellen. Fordi avskårne aksoner i hjerneskiveeksperimenter kan bli drevet til å frigjøre nevrotransmitter gjennom channelrhodopsin aktivering, kjerner som ligger utenfor den akutte skive, men sende aksoner inn i postsynaptic hjerneregionen kan identifiseres med CRACM. Kraften i denne teknikken er at tilkobling og fysiologi av identifiserte langrekkevidde synaptiske innganger kan undersøkes direkte.
I tillegg til channelrhodopsins som er spennende av blått lys, etterforskere har nylig identifisert flere rød-shifted channelrhodopsins9,10, inkludert Chrimson og dens raskere analogchrimsonR, som begge er begeistret med rødt lys av ~ 660 nm6. Rød-forskjøvet opsiner er av interesse fordi rødt lys trenger vev bedre enn blått lys, og rødt lys kan ha en lavere cytotoksisitet enn blått lys10,11,12. Rød-forskjøvet channelrhodopsins også åpne opp muligheten for dual farge CRACM eksperimenter, hvor konvergens av aksoner fra forskjellige kjerner på samme nevron kan testes i ett eksperiment6,13,14. Imidlertid viser dagens rød-forskjøvet opsins ofte uønsket kryssaktivering med blått lys15,16,17, noe som gjør to fargeeksperimenter vanskelig. I tillegg har noen rapporter indikert at ChrimsonR gjennomgår begrenset aksonal handel, noe som kan gjøre det utfordrende å bruke ChrimsonR for CRACM eksperimenter16,17.
Nesten alle stigende projeksjoner fra de lavere auditive hjernestammene konvergerer i den dårligere colliculus (IC), midbrain-knutepunktet til den sentrale auditive veien. Dette inkluderer projeksjoner fra cochleakjernen (CN)18,19, det meste av det overlegne olivary-komplekset (SOC)20,og dorsal (DNLL) og ventrale (VNLL) kjerner av lateral lemniscus21. I tillegg avsluttes en stor synkende projeksjon fra den hørbare cortex i IC18,19,20,21,22, og IC nevroner selv synapse bredt innenfor de lokale og kontralaterale fliker av IC23. Innheking av aksoner fra mange kilder har gjort det vanskelig å sondere IC-kretser ved hjelp av elektrisk stimulering24. Som et resultat, selv om nevroner i IC utføre beregninger viktig for god lokalisering og identifisering av tale og andre kommunikasjonslyder25,26, organiseringen av nevrale kretser i IC er i stor grad ukjent. Vi har nylig identifisert VIP nevroner som den første molekylært identifiserbare nevron klassen i IC27. VIP nevroner er glutamatergic stellate nevroner som projiserer til flere langdistanse mål, inkludert auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nå i stand til å bestemme kildene og funksjonen til lokale og langdistanse innganger til VIP-nevroner og for å finne ut hvordan disse kretsforbindelsene bidrar til lydbehandling.
Protokollen som presenteres her er skreddersydd for å undersøke synaptiske innganger til VIP-nevroner i IC av mus, spesielt fra kontralateral IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan enkelt tilpasses ulike inngangskilder, en annen nevrontype eller en annen hjerneregion helt. Vi viser også at ChrimsonR er en effektiv rød-shifted channelrhodopsin for lang rekkevidde krets kartlegging i den auditive hjernestammen. Vi viser imidlertid at ChrimsonR er sterkt aktivert av blått lys, selv ved lave intensiteter, og dermed å kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farge CRACM eksperimenter, må forsiktige kontroller brukes for å hindre kryssaktivering av ChrimsonR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

Når du undersøker nevrale kretser, er en standard begrensning av in vitro patch clamp tilnærming at aksoner fra flere kilder er ofte blandet, noe som gjør det vanskelig å isolere innganger fra individuelle kilder med elektrisk stimulering. Men ved hjelp av channelrhodopsin assistert kretskartlegging (CRACM), kan denne begrensningen nå overvinnes. Her rapporterer vi en metode for å bruke CRACM til å kartlegge stigende innganger fra nedre auditive hjernestammekjerner og kommissærinnganger til en identifisert klasse av nevroner i den dårligere colliculus (IC), midthjernen kjernen i hørselssystemet. I IC, lokale, commissural, stigende, og synkende aksoner er tungt sammenvevd og derfor umulig å skille med elektrisk stimulering. Ved å injisere en viral konstruksjon for å drive uttrykk for en channelrhodopsin i en presynaptisk kjerne, etterfulgt av patch clamp opptak for å karakterisere tilstedeværelse og fysiologi av channelrhodopsin-uttrykkende synaptiske innganger, projeksjoner fra en bestemt kilde til en bestemt populasjon av IC-nevroner kan kartlegges med celletypespesifikk nøyaktighet. Vi viser at denne tilnærmingen fungerer med både Chronos, en blå lysaktivert channelrhodopsin og ChrimsonR, en rød-shifted channelrhodopsin. I motsetning til tidligere rapporter fra forhjernen, finner vi at ChrimsonR er robust smuglet ned aksonene av dorsal cochleakjerne kjerne hovednevroner, noe som indikerer at ChrimsonR kan være et nyttig verktøy for CRACM eksperimenter i hjernestammen. Protokollen som presenteres her inneholder detaljerte beskrivelser av intrakraniell virusinjeksjonskirurgi, inkludert stereotaxic koordinater for målretting av injeksjoner til dorsal cochleakjerne og IC av mus, og hvordan du kombinerer hele celle patch clamp opptak med channelrhodopsin aktivering for å undersøke langsiktige projeksjoner til IC nevroner. Selv om denne protokollen er skreddersydd for å karakterisere auditive innganger til IC, kan den enkelt tilpasses for å undersøke andre langdistanseprojeksjoner i den hørbare hjernestammen og utover.

Vi krysset VIP-IRES-Cre mus(Viptm1 (cre) Zjh/ J) og Ai14 Cre-reporter mus (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) for å generere F1 avkom der VIP-nevroner uttrykker fluorescerende protein tdTomato. F1 avkom av begge kjønn ble brukt, alderen postnatal dag (P) 21 til P70. Totalt 22 dyr ble brukt i denne studien.
Stereotaxic injeksjon av AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH inn i høyre IC ...

Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Channelrhodopsin-assistert kretskartlegging (CRACM) er en presisjonsteknikk for funksjonell kartlegging av langtrekkende nevronale projeksjoner mellom anatomisk og/ eller genetisk identifiserte grupper av nevroner. Her beskriver vi hvordan du bruker CRACM til å kartlegge auditive hjernestammeforbindelser, inkludert bruk av en rød-shifted opsin, ChrimsonR.

Langdistanse Channelrhodopsin-assistert kretskartlegging av dårligere colliculus nevroner med blå og rød-forskjøvet channelrhodopsins

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

Channelrhodopsin-assistert kretskartlegging er en presisjonsteknikk for funksjonell kartlegging av langtrekkende nevrale projeksjoner. Her viser vi hvordan du bruker denne tilnærmingen til å undersøke kretser i den hørbare hjernestammen. I hjerneskiver er aksoner fra flere kilder ofte blandet sammen, noe som gjør det vanskelig å isolere individuelle innganger ved hjelp av elektrisk stimulering.Ved å bruke CRACM kan denne begrensningen overvinnes. Å finne lambda og konsekvent definere stereotoksisk koordinatsystem er utfordrende som holder varigheten av prosedyren kort. Å ha alle trinnene nøye kartlagt vil øke suksessraten.Begynn med å sprøyte operasjonsområdet med 70% etanol for å rense og plassere sterile håndklegardiner for å dekke operasjonsområdet. Fjern bur sengetøy for å begrense risikoen for kvelning fra utvinning buret. Deretter legger du en varmepute under buret og gir en mat- og vannkilde.Deretter overfører du dyret til en stereotoksisk ramme og fortsetter anestesi. Sett inn en rektal temperatursonde og slå på den homeostatiske temperaturregulatoren. Deretter påfør oftalmisk salve for å hindre at øynene tørker ut.Administrer forebyggende smertestillende. Til slutt barberer du hodebunnen med elektriske klippere. Desinfiser hodebunnen med tre vekslende vattpinner av povidonjod og 70% etanol.Begynn operasjonen ved å gjøre et snitt i hodebunnen langs midtlinjen, starter mellom ørene og fortsetter rostral til øynene, utsette lambda og bregma suturer. Skyv huden til siden og fjern periosteum fra det eksponerte beinet om nødvendig. Deretter markerer lambda sutur med en kirurgisk markør, plasser spissen av nanoinjektoren slik at den bare berører lambda og null mikromanipulatorkoordinatene.Bruk nanoinjektorspissen og mikromanipulatoren til å måle forskjellen i høyde mellom lambda og bregma suturer. Juster palettbarhøyden for å bringe lambda og bregma til innenfor pluss eller minus 100 mikrometer høydeforskjell. Kartinjeksjonsstedet ved hjelp av nanoinjektorspissen og mikromanipulatorkoordinatsystemet og merk stedet med en kirurgisk markør.Deretter bruker du en mikromotorbor med en 0,5 millimeter drillgrad for å utføre en kraniotomi over injeksjonsstedet. For å sikre bred transfection av nevroner i målkjernen, bruk en nanoinjektor for å gjøre injeksjoner på ulike dybder i vevet og i tilfelle av større hjerneregioner, som den dårligere colliculus, gjør injeksjoner i løpet av to eller flere penetrasjoner ved forskjellige X- og Y-koordinater. For å injisere den dårligere colliculus, avse 20 nanoliter virus i intervaller på 250 mikrometer langs Z-aksen mellom 2, 250 mikrometer og 1, 750 mikrometer dybde.For injeksjoner i den dorsale cochleakjernen, avsug 20 nanoliter virus på henholdsvis 4, 750 mikrometer og 4550 mikrometer. Etter injeksjon ved hver Z-koordinat, vent to til tre minutter før du flytter injektoren til neste Z-koordinat for å gi viruset tid til å spre seg bort fra injeksjonsstedet, noe som reduserer sannsynligheten for at viruset vil bli sugd opp i injeksjonskanalen når nanoinjektoren flyttes. Deretter, etter den siste injeksjonen, vent tre til fem minutter før du trekker nanoinjektoren ut av hjernen.Når nanoinjektoren fjernes fra hjernen mellom penetrasjoner og mellom dyr, løs ut et lite virusvolum fra spissen for å kontrollere at spissen ikke er tilstoppet. Etter injeksjoner, bruk steril PBS for å riste de kuttede kantene av hodebunnen og deretter forsiktig flytte huden tilbake mot midtlinjen. Lukk såret med enkle avbrutte suturer ved hjelp av 6-0 nylonsuturer.Deretter påfør 0,5 til en milliliter 2% lidokaingelé på såret. Fjern ørestangene og temperatursonden, vri isofluran, og fjern dyret fra palettstangen og overfør det til gjenopprettingsburet. Til slutt, overvåke utvinning nøye.Når dyret er helt våken, beveger seg rundt, og viser ingen tegn på smerte eller nød, overføre den tilbake til buret og returnere buret til vivarium. Bruk standard patch clamp metoder for å gjøre opptak. Begynn med å plassere skiven i et opptakskammer under et fast stadium oppreist mikroskop og kontinuerlig rikelig med kunstig cerebrospinalvæske ved to milliliter per minutt.Deretter lappe nevroner under visuell kontroll ved hjelp av en passende patch klemme forsterker. Til slutt, under engrosopptak, aktivere Chronos ved å levere korte pulser på 470 nanometer lys eller ChrimsonR ved korte pulser på 580 nanometer lys gjennom kommersielt tilgjengelige lysdioder. Resultatene indikerte at ChrimsonR injeksjon førte til sterkt uttrykk i DCN med tdTomato fluorescens synlig i celler og fibre.I den kontralaterale ICC var fibrene som var sterkt merket med tdTomato godt synlige etter tre uker, noe som viste den langsiktige smuglingsevnen til ChrimsonR-tdTomato-konstruksjonen når de injiseres i auditive hjernestammekjerner. Optisk aktivering av ChrimsonR elicted EPSPs i IC VIP nevroner, noe som indikerer at ChrimsonR er et nyttig verktøy for langdistanse CRACM eksperimenter når eksperimentelle parametere krever bruk av rødt lys i stedet for blått lys. Vi fant imidlertid ut at ChrimsonR ble lett aktivert med blått lys, og viste samme terskel for aktivering av blått lys som Chronos.For denne protokollen er det viktigst å sørge for at stereotoksiske koordinater er riktige og for å bekrefte at viruset ble uttrykt bare i din målrettede hjerneregion. Ved å utveksle Chronos ChrimsonR virokonstruksjon med et annet virus, for eksempel et cellespesifikt Flex-virus, kan du svare på flere anatomiske eller fysiologiske spørsmål uten å endre operasjonsprotokollen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med dyrkede Voksen røttene ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellulær opptak, Sensory felttilordningen, og Dyrknings Identifiserte Nerveceller i Leech, Hirudo medicin</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling av olfactory Receptor nevroner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging og analyse av nevroner Infected<em&gt; I Vivo</em&gt; Med<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Hele-celle Patch-klemmeopptak for elektrofysiologisk bestemmelse av ion selektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo Intracerebrale Stereotaxic injeksjoner for Optogenetic stimulering av langtrekkende innganger i mus Brain skiver

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Bred-åker enkelt-Foton optisk innspillingen inne hjerne skive benytter Voltage-følsom Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

Meta-analyse av Voxel-baserte neuroimaging studier ved hjelp Seed-basert d kartlegging med Permutasjon av bilder (SDM-PSI)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetisk forhør av langdistanse synaptisk overføring og plastisitet fra medial prefrontal cortex til lateral entorhinal cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...