Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft научно-исследовательской стипендии (GO 3060/1-1, проект номер 401540516, в ГД) и Национальные институты здравоохранения грант R56 DC016880 (MTR).

Получить одобрение от местного Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и придерживаться руководящих принципов NIH для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры в этом протоколе были одобрены IACUC Мичиганского университета и были в соответств...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

Мы обнаружили, что CRACM является мощным методом для выявления и характеристики синаптических входов дальнего радиуса действия в нейроны мыши IC. Следуя описанному здесь протоколу, мы добились надежной трансфекции нейронов в DCN и IC, а также надежной аксональной торговли Chronos и ChrimsonR синапт?...

Синаптические связи имеют решающее значение для нейронной цепи функции, но точная топология и физиология синапсов в нейронных цепей часто трудно зондировать экспериментально. Это потому, что электрическая стимуляция, традиционный инструмент клеточной электрофизиологии, без разбора активирует аксоны вблизи места стимуляции, и в большинстве областей мозга, аксоны из различных источников (местные, восходящие, и / или нисходящие) переплетаются. Однако, с помощью channelrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM)1,2, это ограничение теперь можно преодолеть3. Channelrhodopsin (ChR2) является свет активирован, катиционно-селективный ионный канал, первоначально найденный в зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 может быть активирован синим светом длины волны около 450-490 нм, деполяризовать клетку через приток катиона. ChR2 был впервые описан и выражен в ооцитах Xenopus Нагелем и коллегами4. Вскоре после этого, Бойден и его коллеги5 выразили ChR2 в нейронах млекопитающих и показали, что они могут использовать световые импульсы, чтобы надежно контролировать пики на миллисекундный тайм-масштаб, вызывая потенциалдействия 10 мс после активации ChR2 с синим светом. Оптогенетические каналы с еще более быстрой кинетикой были найдены в последнее время (например, Chronos6).
Основной подход к эксперименту CRACM заключается в том, чтобы трансфектировать популяцию пресинаптических нейронов с рекомбинантным адено-ассоциированным вирусом (RAAV), который несет генетическую информацию для канала. Трансфекция нейронов с РААВ приводит к выражению закодированного каналародопсин. Как правило, channelrhodopsin помечены флуоресцентным белком, как GFP (Зеленый флуоресцентный белок) или tdTomato (красный флуоресцентный белок), так что трансфекция нейронов в целевой области может быть легко подтверждена с флуоресценции изображений. Поскольку RAAVs не патогенные, имеют низкий воспалительный потенциал и длительное выражениегена7,8, они стали стандартной техникой для доставки channelrhodopsins к нейронам. Если после трансфекции пресинаптической популяции нейронов активация канала через вспышки света вызывает постсинаптические потенциалы или токи в целевых нейронах, это свидетельствует о аксональной связи от трансинфицированного ядра к записанной клетке. Потому что разорванные аксоны в экспериментах ломтик мозга могут быть обусловлены выпустить нейромедиатор через активации channelrhodopsin, ядра, которые лежат за пределами острого ломтика, но отправить аксоны в постсинаптической области мозга могут быть определены с CRACM. Сила этого метода заключается в том, что связь и физиология выявленных синаптических входов дальнего радиуса действия могут быть непосредственно исследованы.
В дополнение к channelrhodopsins, которые возбудимы синим светом, следователи недавно определили несколько красных сдвига channelrhodopsins9,10, в том числе Chrimson и его быстрее аналог ChrimsonR, оба из которых возбуждены с красным светом 6. Красный сдвиг opsins представляют интерес, потому что красный свет проникает ткани лучше, чем синий свет, и красный свет может иметь более низкую цитотоксичность, чем синий свет10,11,12. Красно-сдвигаемые каналродопсины также открывают возможность двухцветных экспериментов CRACM, где сближение аксонов из разных ядер на одном и том же нейроне может быть проверено в одном эксперименте6,13,14. Тем не менее, текущие красно-сдвигаемые опсины часто демонстрируют нежелательные перекрестные активации с синим светом15,16,17, что затрудняет два цветных эксперимента. Кроме того, некоторые сообщения показали, что ChrimsonR подвергается ограниченной аксональной торговли, что может сделать его сложным использовать ChrimsonR для экспериментов CRACM16,17.
Почти все восходящие проекции из нижних слуховых ядер ствола сходятся в нижнем колликуле (IC), центре среднего мозга центрального слухового пути. Это включает в себя прогнозы из кохлеарного ядра (CN)18,19, большинство из превосходного оливари комплекса (SOC)20, и дорсальный (DNLL) и вентрал (VNLL) ядра бокового лемниска21. Кроме того, большая нисходящая проекция от слуховой коры заканчивается в IC18,19,20,21,22,и IC нейроны сами синапсы широко в пределах местных и контралатеральных долей IC23. Смешение аксонов из многих источников затрудняет зондирование IC схем с помощью электрической стимуляции24. В результате, даже несмотря на то, что нейроны в IC выполняют вычисления, важные для локализации звука и идентификации речевых и других коммуникационных звуков25,26,организация нейронных цепей в ИК в значительной степени неизвестна. Недавно мы определили VIP нейронов в качестве первого молекулярно идентифицируемого класса нейронов в IC27. VIP нейроны являются глутаматергических нейронов стеллата, которые проектируют на несколько дальних целей, в том числе слуховой таламус и превосходный колликул. Теперь мы можем определить источники и функции локальных и дальних входов в VIP-нейроны и определить, как эти соединения цепи способствуют обработке звука.
Протокол, представленный здесь, с учетом расследования синаптических входов в VIP-нейронов в IC мышей, в частности, от контралатерального IC и DCN (Рисунок 1). Протокол может быть легко адаптирован к различным источникам ввода, другой тип нейронов или другой области мозга в целом. Мы также показываем, что ChrimsonR является эффективным красным сдвигом channelrhodopsin для дальнего диапазона отображения в слуховом стволе мозга. Тем не менее, мы демонстрируем, что ChrimsonR сильно активируется синим светом, даже при низкой интенсивности, и, таким образом, чтобы объединить ChrimsonR с Chronos в двухцветных экспериментах CRACM, тщательный контроль должен быть использован для предотвращения перекрестной активации ChrimsonR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

При исследовании нейронных цепей, стандартное ограничение подхода зажима зажима in vitro что аксоны от множественных источников часто смешаны, делая его трудным изолировать входы от индивидуальных источников с электрической стимуляцией. Однако, с помощью каналаrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM), это ограничение теперь может быть преодолено. Здесь мы сообщаем о методе использования CRACM для картирования восходящих входов от нижних слуховых ядер ствола мозга и коммистуральных входов к идентифицированному классу нейронов в нижнем колликуле (IC), ядре среднего мозга слуховой системы. В IC, местные, комиссионерские, восходящие и нисходящие аксоны сильно переплетены и поэтому неотличимы с электрической стимуляцией. Путем впрыскивания вирусной конструкции для того чтобы управлять выражением channelrhodopsin в presynaptic ядре, последовано заработка зажима зажима для того чтобы охарактеризовать присутсвие и физиологию channelrhodopsin-выражая синаптические входы, прогнозы от специфического источника к определенной популяции нейронов IC можно отображать с точностью типа клетки. Мы показываем, что этот подход работает как с Chronos, синий свет активированный каналrhodopsin, и ChrimsonR, красный сдвиг channelrhodopsin. В отличие от предыдущих докладов с передних мозгов, мы находим, что ChrimsonR надежно проданы вниз аксоны дорсального кохлеарного ядра основных нейронов, указывая, что ChrimsonR может быть полезным инструментом для экспериментов CRACM в стволе мозга. Представленный здесь протокол включает в себя подробные описания хирургии инъекций внутричерепного вируса, включая стереотаксические координаты для таргетинга инъекций в рстное кохлеарное ядро и IC мышей, а также как комбинировать запись зажима цельного клеточного зажима с активацией channelrhodopsin для исследования дальних проекций на IC нейронов. Хотя этот протокол адаптирован для характеристики слуховых входов в IC, он может быть легко адаптирован для изучения других долгосрочных прогнозов в слуховом стволе мозга и за его пределами.

Мы пересекли VIP-IRES-Cre мышей(Viptm1 (cre) JH/J) и Ai14 Cre-репортер мышей (B6. Cg-Gt (ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) для генерации потомства F1, в котором VIP нейроны выражают флуоресцентный белок tdTomato. F1 потомство обоих полов были использованы, в возрасте послеродового дня (P) 21 до ...

Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) является точным методом для функционального картирования проекций нейронов дальнего радиуса действия между анатомически и/или генетически идентифицированными группами нейронов. Здесь мы описываем, как использовать CRACM для картирования слуховых соединений ствола мозга, включая использование красного сдвига опсина, ChrimsonR.

Долгосрочный Channelrhodopsin-помощь цепи Картирование Нижнего Колликулнейроннейроны с синим и красным сдвинутым Channelrhodopsins

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

Картирование цепи с помощью Channelrhodopsin является высокоточным методом функционального картирования нейронных проекций дальнего радиуса действия. Здесь мы покажем, как использовать этот подход для исследования схем в слуховой ствол мозга. В ломтиках мозга аксоны из нескольких источников часто перемешиваются, что затрудняет изоляцию отдельных входов с помощью электрической стимуляции.С помощью CRACM это ограничение может быть преодолено. Поиск lambda и последовательное определение стереотаксисной системы координат является сложной задачей, как и сохранение продолжительности процедуры короткий. Имея все шаги тщательно наметили увеличит ваш успех.Начните с распыления области хирургии с 70% этанола для дезинфекции и место стерильных штор полотенце для покрытия области хирургии. Удалите постельные принадлежности клетки, чтобы ограничить риск удушья из клетки восстановления. Затем положите грелку под клетку и предоставьте источник пищи и воды.Затем перенесите животное в стереотаксис и продолжайте анестезию. Вставьте зонд прямой температуры и включите гомеостатический контроллер температуры. Затем нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз.Администрирование упреждающего анальгетики. Наконец, побрить кожу головы с электрическими клиперами. Дезинфицировать кожу головы тремя чередующимися мазки йода повидоне и 70% этанола.Начните операцию, сделав разрез на коже головы вдоль средней линии, начиная между ушами и продолжая ростральный глаза, подвергая швов лямбды и брегмы. Нажмите кожу в сторону и удалить periosteum из открытой кости, если это необходимо. Затем отметь шов ламбды хирургическим маркером, распоисти кончик нано-инжектора так, чтобы он просто касался ламбды и обнулял координаты микроманипулятора.Используйте наконечник нано-инжектора и микроманипулятор для измерения разницы в высоте между швами лямбды и брегмы. Отрегулируйте высоту палитры бар довести lambda и bregma в пределах плюс-минус 100 микрометров разница в высоте. Наметите место инъекций с помощью наконечника нано-инжектора и системы координат микроманипулятора и отметйте участок хирургическим маркером.Затем используйте микромоторную дрель с 0,5-миллиметровым буровым заусенцем для выполнения краниотомии над местом инъекции. Для обеспечения широкой трансфекции нейронов в ядре цели, используйте нано-инжектор, чтобы сделать инъекции на различных глубинах в ткани и в случае больших областей мозга, как нижний колликул, делать инъекции в течение двух или более проникновений в различных X и Y координат. Для введения низкого колликула, депозит 20 нанолитров вируса в интервалах 250 микрометров вдоль оси й между 2, 250 микрометров и 1, 750 микрометров глубины.Для инъекций в спинное кохлеарное ядро откладывают 20 нанолитров вируса на глубине 4, 750 микрометров и 4, 550 микрометров соответственно. После введения в каждом координате, подождите две-три минуты, прежде чем переместить инжектор к следующей координате, чтобы позволить вирусу рассеяться от места инъекции, уменьшая вероятность того, что вирус будет всасывается в инъекционный тракт, когда нано-инжектор перемещается. Затем, после последней инъекции, подождите три-пять минут, прежде чем вывести нано-инжектор из мозга.Когда нано-инжектор удаляется из мозга между проникновением и между животными, извлечь небольшой объем вируса из кончика, чтобы проверить, что кончик не засоряется. После инъекций используйте стерильный PBS, чтобы промокнуть края кожи головы, а затем осторожно переместить кожу обратно к средней линии. Закройте рану простыми прерванные швы с помощью 6-0 нейлоновых швов.Затем нанесите на рану желе от 0,5 до одного миллилитра 2%лидокаина. Удалите ушные батончики и температурный зонд, поверните изофлюран, и удалите животное из палитры бар и передать его в клетку восстановления. Наконец, внимательно следите за восстановлением.После того, как животное полностью проснулся, двигаясь вокруг, и не проявляя никаких признаков боли или бедствия, передать его обратно в клетку и вернуть клетку в вивариум. Используйте стандартные методы зажима патча, чтобы сделать записи. Начните с размещения ломтика в камере записи под фиксированной стадии вертикально микроскопа и постоянно обильные с искусственной спинномозговой жидкости на два миллилитров в минуту.Далее, патч нейронов под визуальным контролем с помощью подходящего усилителя патч зажима. Наконец, во время оптовых записей, активировать Chronos путем доставки кратких импульсов 470 нанометров света или ChrimsonR краткими импульсами 580 нанометров света через коммерчески доступные светодиоды. Результаты показали, что инъекция ChrimsonR привела к сильному выражению в DCN с флуоресценцией tdTomato, видимой в клетках и волокнах.В контралатеральной МЦК волокна, сильно помеченные tdTomato, были хорошо видны через три недели, демонстрируя возможности долгосрочной торговли конструкцией ChrimsonR-tdTomato при введении в слуховые ядра ствола мозга. Оптическая активация ChrimsonR elicted EPSPs в IC VIP нейронов, указывая, что ChrimsonR является полезным инструментом для дальних экспериментов CRACM, когда экспериментальные параметры требуют использования красного света вместо синего света. Тем не менее, мы обнаружили, что ChrimsonR был легко активирован с синим светом, показывая тот же порог для активации синего света, как Chronos.Для этого протокола наиболее важно убедиться, что стереотаксис координаты являются правильными и подтвердить, что вирус был выражен только в вашей целевой области мозга. Обменявшись вирусоконструкцией Chronos ChrimsonR с другим вирусом, например, клеточным вирусом Flex, вы можете ответить на несколько анатомических или физиологических вопросов, не изменив протокол операции.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Функциональные карты с одновременным МЭГ и ЭЭГ

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Внутриклеточной регистрации, Сенсорная поле карт, а также культивирование Выявленные Нейроны в Лича, Hirudo MEDICINALIS</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Всего Гора иммунного обонятельных рецепторов нейронов в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Антенны

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D изображений и анализ нейронов Infected<em&gt; В Vivo</em&gt; С<em&gt; Токсоплазма</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Регистрация цельноклеточных патч-фиксаторов для электрофизиологического определения селективности ионов в канале-каналодопсинах

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

В Vivo интрацеребральные стереотаксические инъекции для оптогенетической стимуляции дальнобойных входов в mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Широкоугольной однофотонной оптической записи в мозговых фрагментах с использованием чувствительных к напряжению красителя

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

Мета-анализ Voxel основе нейровизуализации исследований с использованием семян на основе d Картирование с перестановкой субъектов изображения (SDM-PSI)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Оптогенетический опрос дальней синаптической передачи и пластичности от медиальной префронтальной коры к латеральной энторинальной коре

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...