Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projektnummer 401540516, till GD) och National Institutes of Health bevilja R56 DC016880 (MTR).

Få godkännande från den lokala institutionella djurvårds- och användningskommittén (IACUC) och följ NIH:s riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. Alla förfaranden i detta protokoll godkändes av University of Michigan IACUC och var i enlighet med NIH riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.
1. Kirurgi Preparat
<ol><li>Utför operationer under aseptiska förhållanden. Autoklav/sterilisera alla operationsverktyg och material före operation. Använd kiru...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

Vi har funnit att CRACM är en kraftfull teknik för att identifiera och karakterisera långväga synaptiska ingångar till nervceller i musen IC. Efter protokollet som beskrivs här uppnådde vi robust transfection av nervceller i DCN och IC samt tillförlitlig axonal handel med Chronos och ChrimsonR till synaptiska terminaler i IC. Dessutom visade vi att denna teknik möjliggör mätning och analys av postsynaptiska händelser, inklusive PSP amplitud, halvbredd, förfall tid, och receptor farmakologi. Vår erfarenhet t...

Synaptiska anslutningar är kritiska till neural kretsfunktion, men den exakta topologi och fysiologi synapser inom neurala kretsar är ofta svåra att sondera experimentellt. Detta beror på att elektrisk stimulering, det traditionella verktyget för cellulär elektrofysiologi, urskillningslöst aktiverar axoner nära stimuleringsplatsen, och i de flesta hjärnregioner, axoner från olika källor (lokala, stigande och/eller fallande) intertwine. Men genom att använda channelrhodopsin assisterad krets kartläggning (CRACM)1,2, denna begränsning kan nu övervinnas3. Channelrhodopsin (ChR2) är en ljusaktiverad, katjon-selektiv jonkanal som ursprungligen hittades i den gröna alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveras med blått ljus av en våglängd runt 450-490 nm, depolarisera cellen genom katjontillströmningen. ChR2 beskrevs först och uttrycktes i Xenopus äggceller av Nagel och kollegor4. Kort därefter uttryckte Boyden och kollegor5 ChR2 i däggdjursnervceller och visade att de kunde använda ljuspulser för att på ett tillförlitligt sätt kontrollera spikning på en millisekundstidsskala, vilket inducerar åtgärdspotentialerna ~ 10 ms efter aktivering av ChR2 med blått ljus. Optogenetiska kanaler med ännu snabbare kinetik har hittats nyligen (t.ex. Chronos6).
Den grundläggande metoden för en CRACM experiment är att transfect en population av förmodade presynaptiska nervceller med en rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) som bär den genetiska informationen för en channelrhodopsin. Transfection av nervceller med rAAV leder till uttrycket av den kodade channelrhodopsin. Typiskt är channelrhodopsin märkt med ett fluorescerande protein som GFP (Green Fluorescerande protein) eller tdTomato (ett rött fluorescerande protein), så att transfection av nervceller i målregionen lätt kan bekräftas med fluorescens avbildning. Eftersom rAAVs är icke-patogena, har en låg inflammatorisk potential och långvariga genuttryck7,8, de har blivit en standard teknik för att leverera channelrhodopsins till nervceller. Om, efter transfection av en förmodade presynaptic befolkningen av nervceller, aktivering av en channelrhodopsin genom ljusblinkar framkallar postsynaptiska potentialer eller strömmar i målet nervceller, Detta är ett bevis på en axonal anslutning från den transfected kärnan till den inspelade cellen. Eftersom avhuggna axoner i hjärnan skiva experiment kan drivas att släppa signalsubstansen genom channelrhodopsin aktivering, nuclei som ligger utanför den akuta skiva men skicka axoner i postsynaptic hjärnan regionen kan identifieras med CRACM. Kraften i denna teknik är att anslutningen och fysiologiidentifierade långväga synaptiska ingångar kan undersökas direkt.
Förutom channelrhodopsins som är retliga av blått ljus, utredare har nyligen identifierat flera rödskiftade channelrhodopsins9,10, inklusive Chrimson och dess snabbare analoga ChrimsonR, som båda är glada med rött ljus på ~ 660 nm6. Rödskiftade opsins är av intresse eftersom rött ljus tränger in vävnad bättre än blått ljus, och rött ljus kan ha en lägre cytotoxicitet än blått ljus10,11,12. Rödskiftade channelrhodopsins öppnar också upp möjligheten till dubbla färg CRACM experiment, där konvergensen av axoner från olika kärnor på samma neuron kan testas i ett experiment6,13,14. Men nuvarande rödskiftade opsins uppvisar ofta oönskadkorsaktivering med blått ljus15,16,17, vilket gör två färgexperiment svåra. Dessutom har vissa rapporter visat att ChrimsonR genomgår begränsad axonal handel, vilket kan göra det svårt att använda ChrimsonR för CRACM experiment16,17.
Nästan alla stigande prognoser från den lägre auditiva hjärnstammen kärnor konvergerar i sämre colliculus (IC), midbrain navet i den centrala auditiva vägen. Detta inkluderar projektioner från cochlear kärnan (CN)18,19, de flesta av de överlägsna olivary komplex (SOC)20, och dorsala (DNLL) och ventral (VNLL) kärnor av laterala lemniscus21. Dessutom avslutas en stor fallande projektion från hörselbarken i IC18,19,20,21,22, och IC nervceller själva synapse i stort sett inom den lokala och kontralaterala lober ic ic23. Den sammanblandning av axoner från många källor har gjort det svårt att sondera IC kretsar med elektrisk stimulering24. Som ett resultat, även om nervceller i IC utföra utrop viktigt för ljudlokalisering och identifiering av tal och annan kommunikation ljud25,26, organisationen av neurala kretsar i IC är i stort sett okänd. Vi identifierade nyligen VIP-nervceller som den första molekylärt identifierbara neuron klassen i IC27. VIP nervceller är glutamaterga stellate nervceller som projektet till flera långväga mål, inklusive auditiva talamus och överlägsen colliculus. Vi kan nu bestämma källorna och funktionen hos lokala och långväga ingångar till VIP-nervceller och för att avgöra hur dessa kretsanslutningar bidrar till ljudbehandling.
Protokollet som presenteras här är skräddarsytt för att undersöka synaptiska ingångar till VIP-nervceller i IC av möss, särskilt från den kontralaterala IC och DCN(figur 1). Protokollet kan enkelt anpassas till olika källor till input, en annan neuron typ eller en annan hjärnregion helt och hållet. Vi visar också att ChrimsonR är en effektiv rödskiftad channelrhodopsin för långväga krets kartläggning i hörselhjärnstammen. Vi visar dock att ChrimsonR är starkt aktiverad av blått ljus, även vid låga intensiteter, och därmed för att kombinera ChrimsonR med Chronos i tvåfärgade CRACM-experiment, måste noggranna kontroller användas för att förhindra korsaktivering av ChrimsonR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

Vid undersökning av neurala kretsar, en standard begränsning av in vitro patch klämma strategi är att axoner från flera källor ofta blandas, vilket gör det svårt att isolera ingångar från enskilda källor med elektrisk stimulering. Men genom att använda channelrhodopsin assisterad krets kartläggning (CRACM), denna begränsning kan nu övervinnas. Här rapporterar vi en metod för att använda CRACM för att kartlägga stigande ingångar från lägre auditiva hjärnstammen kärnor och commissural ingångar till en identifierad klass av nervceller i sämre colliculus (IC), midbrain kärnan i hörselsystemet. I IC, lokala, commissural, stigande och fallande axons är starkt sammanflätade och därför omöjlig att skilja med elektrisk stimulering. Genom att injicera en viral konstruktion för att driva uttryck för en channelrhodopsin i en presynaptisk kärna, följt av patch klämma inspelning för att karakterisera närvaro och fysiologi channelrhodopsin-uttrycker synaptiska ingångar, prognoser från en viss källa till en specifik population av IC nervceller kan mappas med cell typ-specifik noggrannhet. Vi visar att detta tillvägagångssätt fungerar med både Chronos, en blå ljusaktiverad channelrhodopsin, och ChrimsonR, en rödskiftad channelrhodopsin. I motsats till tidigare rapporter från förhjärnan, finner vi att ChrimsonR är robust smugglas ner axons av dorsal cochlear kärnan huvudsakliga nervceller, vilket tyder på att ChrimsonR kan vara ett användbart verktyg för CRACM experiment i hjärnstammen. Protokollet som presenteras här innehåller detaljerade beskrivningar av intrakraniell virusinjektionskirurgi, inklusive stereotaxic koordinater för inriktning injektioner till dorsala cochlear kärnan och IC av möss, och hur man kombinerar hela cell patch klämma inspelning med channelrhodopsin aktivering för att undersöka långväga prognoser till IC nervceller. Även om detta protokoll är skräddarsytt för att karakterisera auditiva ingångar till IC, kan det enkelt anpassas för att undersöka andra långväga prognoser i hörselhjärnstammen och därefter.

Vi korsade VIP-IRES-Cre möss(Viptm1 (cre)Zjh/J) och Ai14 Cre-reporter möss (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) för att generera F1 avkommor där VIP-nervceller uttrycker fluorescerande protein tdTomato. F1 avkommor av något kön användes, åldrades postnatal dag (P) 21 till P70. Sammanlagt 22 djur användes i denna studie.
Stereotaxic injektion av AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE...

Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Channelrhodopsin-assisterad krets kartläggning (CRACM) är en precisionsteknik för funktionell kartläggning av långväga neuronala prognoser mellan anatomiskt och / eller genetiskt identifierade grupper av nervceller. Här beskriver vi hur man använder CRACM för att kartlägga auditiva hjärnstammen anslutningar, inklusive användning av en rödskiftad opsin, ChrimsonR.

Långväga Channelrhodopsin-assisterad Krets Kartläggning av sämre colliculus nervceller med blå och röd-skiftade Channelrhodopsins

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

Channelrhodopsin-assisterad kretsmappning är en precisionsteknik för funktionell kartläggning av långväga neurala projektioner. Här visar vi hur man använder detta tillvägagångssätt för att undersöka kretsar i hörselhjärnstammen. I hjärnan skivor, axoner från flera källor är ofta blandas, vilket gör det svårt att isolera enskilda ingångar med hjälp av elektrisk stimulering.Genom att använda CRACM kan denna begränsning övervinnas. Att hitta lambda och konsekvent definiera stereotaxic koordinatsystem är utmanande som är att hålla varaktigheten av förfarandet kort. Med alla steg noggrant kartlagt kommer att öka din framgång.Börja med att spraya kirurgi området med 70%etanol för att sanera och placera sterila handduk draperier för att täcka operationsområdet. Avlägsna bursängkläder för att begränsa risken för kvävning från återhämtningsburen. Därefter sätter en värmedyna under buren och ge en mat och vattenkälla.Därefter överför djuret till en stereotaxisk ram och fortsätt anestesi. Sätt i en rektal temperaturproben och slå på den homeostatiska temperaturregulatorn. Applicera sedan oftalmisk salva för att förhindra att ögonen torkar ut.Administrera förebyggande smärtstillande medel. Slutligen raka hårbotten med elektriska clippers. Desinficera hårbotten med tre växlande svabbprover av povidon jod och 70%etanol.Börja operationen genom att göra ett snitt i hårbotten längs mittlinjen, börjar mellan öronen och fortsätter rostral till ögonen, utsätta lambda och bregma suturer. Tryck huden åt sidan och ta bort benhinna från det exponerade benet om det behövs. Markera därefter lambda suturen med en kirurgisk markör, placera spetsen på nano-injektorn så att den bara rör lambda och noll mikromanipulatorkoordinaterna.Använd nano-injektorspetsen och mikromanipulatorn för att mäta skillnaden i höjd mellan lambda- och bregmasuturerna. Justera palett bar höjd för att få lambda och bregma till inom plus eller minus 100 mikrometer höjdskillnad. Kartlägg injektionsstället med hjälp av nano-injektorspetsen och mikromanipulatorkoordinatsystemet och markera platsen med en kirurgisk markör.Använd sedan en mikromotorborr med en 0,5 millimeters borrburr för att utföra en craniotomy över injektionsstället. För att säkerställa bred transfektion av nervceller i målkärnan, använd en nano-injektor för att göra injektioner på olika djup i vävnaden och när det gäller större hjärnregioner, som de sämre colliculus, göra injektioner under loppet av två eller flera penetrationer på olika X och Y koordinater. För att injicera de sämre colliculus, deponera 20 nanoliter av virus i intervallen 250 mikrometer längs Z-axeln mellan 2, 250 mikrometer och 1, 750 mikrometer djup.För injektioner i dorsala cochlear kärnan, deponera 20 nanoliter av virus på ett djup av 4, 750 mikrometer och 4, 550 mikrometer respektive. Efter injicering vid varje Z-koordinat, vänta två till tre minuter innan du flyttar injektorn till nästa Z-koordinat för att ge viruset tid att sprida sig bort från injektionsstället, vilket minskar sannolikheten för att virus kommer att sugas upp i injektionskanalen när nano-spridaren flyttas. Sedan, efter den sista injektionen, vänta tre till fem minuter innan du drar tillbaka nano-injektor från hjärnan.När nano-injektorn avlägsnas från hjärnan mellan inträngningar och mellan djur, mata ut en liten volym av virus från spetsen för att kontrollera att spetsen inte har igensatt. Efter injektioner, använd steril PBS för att blöta de skurna kanterna i hårbotten och sedan försiktigt flytta huden tillbaka mot mittlinjen. Stäng såret med enkla avbrutna suturer med hjälp av 6-0 suturer i nylon.Applicera sedan 0,5 till en milliliter av 2%lidokain gelé till såret. Ta bort öronstängerna och temperatursonden, sväng av isofluran, och ta bort djuret från palettstången och överför det till återhämtningsburen. Slutligen övervaka återställning noga.När djuret är helt vaken, flytta runt, och visar inga tecken på smärta eller ångest, överföra den tillbaka till sin bur och returnera buren till vivarium. Använd standard patch clamp metoder för att göra inspelningar. Börja med att placera skivan i en inspelningskammare under ett fast steg upprätt mikroskop och kontinuerligt ymnig med konstgjord cerebrospinalvätska på två milliliter per minut.Därefter patch nervceller under visuell kontroll med hjälp av en lämplig patch clamp förstärkare. Slutligen, under grossistinspelningar, aktivera Chronos genom att leverera korta pulser på 470 nanometer ljus eller ChrimsonR av korta pulser på 580 nanometer ljus genom kommersiellt tillgängliga lysdioder. Resultaten anges att ChrimsonR injektion ledde till starka uttryck i DCN med tdTomato fluorescens synlig i celler och fibrer.I den kontralaterala ICC, fibrer starkt märkta med tdTomato var tydligt synliga efter tre veckor, visar långväga människohandel förmåga ChrimsonR-tdTomato konstruera när injiceras i auditiva hjärnstammen kärnor. Optisk aktivering av ChrimsonR elicted EPSPs i IC VIP nervceller, vilket indikerar att ChrimsonR är ett användbart verktyg för långväga CRACM experiment när de experimentella parametrarna kräver användning av rött ljus i stället för blått ljus. Vi fann dock att ChrimsonR var lätt aktiveras med blått ljus, visar samma tröskel för blått ljus aktivering som Chronos.För detta protokoll är det viktigast att se till att de stereotaxiska koordinaterna är korrekta och att bekräfta att viruset uttrycktes endast i din riktade hjärnregion. Genom att utbyta Chronos ChrimsonR virokonstruct med ett annat virus, till exempel, en cell specifika Flex virus, kan du svara på flera anatomiska eller fysiologiska frågor utan att ändra kirurgi protokollet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Funktionell kartläggning med samtidig MEG och EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med odlade Vuxna Mjukstrålar neuroner rotganglion

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellulär inspelning, Sensorisk Field Mapping, och odling identifierade nervceller i Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging och analys av nervceller Infekterade<em&gt; In Vivo</em&gt; Med<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp inspelningar för elektrofysiologisk bestämning av jonselektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebral Stereotaxic injektioner för Optogenetisk stimulering av långväga ingångar i mushjärna skivor

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-fält Single-Photon optisk inspelning i hjärn skivor använda spännings känsliga Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

Meta-analys av Voxel-baserade neuroimaging studier med hjälp av utsäde-baserade d kartläggning med permutation av motiv bilder (SDM-PSI)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetisk förhör av långväga synaptisk överföring och plasticitet från medial prefrontal cortex till lateral entorhinal cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...