Name: long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, proje numarası 401540516, DG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R56 DC016880 (MTR) tarafından desteklenmiştir.

Yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden (IACUC) onay alın ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı yla ilgili NIH yönergelerine uyun. Bu protokoldeki tüm prosedürler Michigan IACUC Üniversitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Cerrahi Preparatlar
<ol><li>Aseptik koşullarda ameliyatlar yapın. Ameliyat öncesi tüm cerrahi araç ve gereçleri otoklav/ste...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping.">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Progress+and+Prospects:+Recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors.">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li><li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vector+production.">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li><li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics.">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations.">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li><li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience.">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li><li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation.">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat:+A+light+and+electron+microscopic+study.">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li><li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat:+Possible+substrates+for+binaural+interaction.">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li><li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+chiasm:+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive.">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus.">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li><li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus.">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li><li>Salda&#241;a, E., Mercha&#324;, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus.">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain.">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li><li>Felix, R. A., Gour&#233;vitch, B., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+pathways:+Towards+a+better+understanding+of+auditory+disorders.">Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders.</a> Hearing Research. 362, 48-60 (2018).</li><li>Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).</li><li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice.">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770 (2019).</li></ol>

Cracm'nin fare IC'deki nöronlara uzun menzilli sinaptik girdileri tanımlamak ve karakterize etmek için güçlü bir teknik olduğunu bulduk. Burada ayrıntılı olarak yapılan protokolü takiben, DCN ve IC'deki nöronların sağlam transfeksiyonunun yanı sıra Chronos ve ChrimsonR'ın IC'deki sinaptik terminallere güvenilir aksonal ticareti sağladık. Ayrıca, bu tekniğin PSP genliği, yarıgenişlik, çürüme süresi ve reseptör farmakolojisi de dahil olmak üzere postsinaptik olayların ölçülmesini ve anal...

Sinaptik bağlantılar nöral devre fonksiyonu için çok önemlidir, ancak nöral devreler içindeki sinapsların hassas topolojisi ve fizyolojisini deneysel olarak araştırmak genellikle zordur. Bunun nedeni, hücresel elektrofizyolojinin geleneksel aracı olan elektriksel stimülasyonun, stimülasyon bölgesine yakın aksonların gelişigüzel aktive edilmesidir ve çoğu beyin bölgesinde, farklı kaynaklardan (lokal, yükselen ve/veya azalan) aksonların iç içe geçmiş olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM)1,2kullanarak, bu sınırlama şimdi3aşılabilir . Channelrhodopsin (ChR2) bir ışık aktive, katyon seçici iyon kanalı aslında yeşil yosun Chlamydomonas reinhardtiibulundu. ChR2 450-490 nm civarında bir dalga boyu mavi ışık ile aktive edilebilir, katyon akını ile hücre depolarize. ChR2 ilk açıklanan ve Nagel ve meslektaşları tarafından Xenopus oositler ifade4. Bundan kısa bir süre sonra, Boyden ve meslektaşları5 memeli nöronlarda ChR2 ifade ve güvenilir bir milisaniye zaman ölçeğinde spiking kontrol etmek için ışık darbeleri kullanabilirsiniz gösterdi, mavi ışık ile ChR2 aktivasyonu ndan sonra eylem potansiyelleri ~ 10 ms indükleyen. Son zamanlarda daha hızlı kinetik içeren optogenetik kanallar bulunmuştur (örneğin, Chronos6).
Bir CRACM deneyiçin temel yaklaşım bir konfotik adeno-ilişkili virüs (rAAV) bir channelrhodopsin için genetik bilgi taşıyan putatif presinaptik nöronlar bir nüfus transfect etmektir. RAAV ile nöronların transfeksiyon kodlanmış channelrhodopsin ekspresyonuna yol açar. Tipik olarak, channelrhodopsin GFP gibi bir floresan protein ile etiketlenir (Yeşil Floresan Protein) veya tdTomato (kırmızı floresan protein), böylece hedef bölgede nöronların transfeksiyon kolayca floresan görüntüleme ile teyit edilebilir. RAAVs non-patojenik olduğundan, düşük inflamatuar potansiyeli ve uzun ömürlü gen ekspresyonuvar 7,8, onlar nöronlara channelrhodopsins sunmak için standart bir teknik haline gelmiştir. Eğer, nöronların putatif presinaptik popülasyontransfeksiyon sonra, ışık yanıp söner yoluyla bir channelrhodopsin aktivasyonu mesaj yofetik potansiyelleri veya hedef nöronlarda akımlar ortaya çıkarır, Bu transfected çekirdekten kaydedilmiş hücreye aksonal bağlantı kanıtıdır. Beyin dilimi deneylerinde kopmuş aksonları channelrhodopsin aktivasyonu yoluyla nörotransmitter serbest bırakmak için tahrik edilebilir çünkü, akut dilim dışında yalan ama postsinaptik beyin bölgesine akson göndermek çekirdekleri CRACM ile tespit edilebilir. Bu tekniğin gücü, tanımlanan uzun menzilli sinaptik girdilerin bağlantısı ve fizyolojisinin doğrudan araştırılabildiğidir.
Mavi ışık tarafından heyecanlı olan kanaloidofinler ek olarak, araştırmacılar son zamanlarda birkaç kırmızı kaydırılmış channelrhodopsins tespit var9,10, Chrimson ve daha hızlı analog ChrimsonR dahil, her ikisi de ~ 660 nm6kırmızı ışık ile heyecanlıyız . Kırmızı ışık mavi ışık daha iyi doku nüfuz çünkü kırmızı kaydırılmış opsins ilgi vardır, ve kırmızı ışık mavi ışık10daha düşük bir sitotoksisite olabilir10 ,11,12. Kırmızı-shifted channelrhodopsins da aynı nöron üzerinde farklı çekirdeklerden aksonların yakınsama bir deneydetest edilebilir çift renkli CRACM deneyleri, olasılığını açmak 6,13,14. Ancak, mevcut kırmızı-shifted opsins genellikle mavi ışık 15 ile istenmeyen çapraz aktivasyonsergilemek 15,16,17, iki renk deneyleri zor hale. Buna ek olarak, bazı raporlar ChrimsonR sınırlı aksonal ticareti uğrar göstermiştir, hangi CRACM deneyleri için ChrimsonR kullanmak zor yapabilirsiniz16,17.
Alt işitsel beyin sapı çekirdeklerinden gelen neredeyse tüm yükselen projeksiyonlar, merkezi işitsel yolun orta beyin merkezi olan alt koliulusta (IC) yakınlaşır. Bu koklear çekirdeğin projeksiyonları içerir (CN)18,19, üstün olilik kompleksi en (SOC)20, ve dorsal (DNLL) ve ventral (VNLL) lateral lemniscus çekirdekleri21. Ayrıca, işitsel korteksten büyük bir azalan projeksiyon IC sona erer18,19,20,21,22, ve IC nöronlar kendilerini ic yerel ve kontralateral loblar içinde geniş sinaps23. Birçok kaynaktan aksonların içiçe olması, ic devrelerinin elektriksel stimülasyon kullanılarak sondalanmasını zorlaştırmıştır24. Sonuç olarak, IC nöronlar ses lokalizasyonu ve konuşma ve diğer iletişim sesleri nin belirlenmesi için önemli hesaplamalar gerçekleştirmek rağmen25,26, IC nöral devrelerin organizasyonu büyük ölçüde bilinmemektedir. Yakın zamanda IC27'dekiilk moleküler olarak tanımlanabilir nöron sınıfı olarak VIP nöronları tanımladık. VIP nöronlar, işitsel talamus ve üstün kolikulus da dahil olmak üzere birçok uzun menzilli hedefe proje glutamaterjik stellat nöronlardır. Artık VIP nöronlara yerel ve uzun menzilli girdilerin kaynaklarını ve işlevini ve bu devre bağlantılarının ses işlemeye nasıl katkıda bulunduğunu belirleyebiliyoruz.
Burada sunulan protokol, özellikle kontralateral IC ve DCN'den(Şekil 1)farelerin IC'sindeki VIP nöronlara sinaptik girdilerin araştırılması için uyarlanmıştır . Protokol kolayca giriş farklı kaynaklara adapte edilebilir, farklı bir nöron tipi veya tamamen farklı bir beyin bölgesi. Ayrıca ChrimsonR'ın işitsel beyin sapında uzun menzilli devre haritalaması için etkili bir kırmızı kaydırmalı kanalrhodopsin olduğunu da gösteriyoruz. Ancak, ChrimsonR güçlü mavi ışık tarafından aktive olduğunu göstermektedir, düşük yoğunluklarda bile, ve böylece, iki renkli CRACM deneylerde Chronos ile ChrimsonR birleştirmek için, dikkatli kontroller ChrimsonR çapraz aktivasyonu önlemek için kullanılmalıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59171-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59170-AAV1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber (590nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-A8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue (470nm) LUXEON Rebel LED</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>SP-01-B4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carproject (carprofen)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>59149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond glas capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject 3</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-300-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode beveler</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FG-BV10-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed stage microscope</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia head holder</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>933-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General surgery tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden A5 pet clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078005-010-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hooded induction chamber w/ vacuum system</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78917760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Inotech</td>
			<td>IS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution 10%</td>
			<td>MedChoice</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8703592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocain topical jelly 2%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill 1050</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>7094351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro motor drill bits 0.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment Artificial Tears</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>local pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier incl data acquisition software</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable anethesia machine</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>07-8914724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal steroetaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>930-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard chemicals</td>
			<td>local vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard imaging solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Custom build</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock #010908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>any</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-range channelrhodopsin-assisted circuit mapping of inferior colliculus neurons with blue and red-shifted channelrhodopsins

Nöral devreleri araştırırken, in vitro yama kıskaç yaklaşımının standart bir sınırlaması, birden fazla kaynaktan gelen aksonlar genellikle birbirine karışmak, elektrikstimülasyon ile bireysel kaynaklardan girişleri izole etmek zor hale olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) kullanılarak, bu sınırlama artık aşılabilir. Burada, düşük işitsel beyin sapı çekirdekleri ve komiser girişleri artan girdileri alt kolikulus (IC), işitsel sistemin orta beyin çekirdeği nöronların tanımlanmış bir sınıfa haritalamak için CRACM kullanmak için bir yöntem rapor. IC'de, lokal, komiser, yükselen ve azalan aksonlar yoğun bir şekilde iç içe geçmiştir ve bu nedenle elektriksel uyarılma ile ayırt edilemez. Bir presinaptik çekirdekte bir kanaloidofin ekspresyonu sürücü için viral bir yapı enjekte ederek, kanalrhodopsin ifade sinaptik girdilerin varlığı ve fizyolojisi karakterize etmek için yama kıskaç kaydı takip, belirli bir kaynaktan projeksiyonlar IC nöronların belirli bir nüfusa hücre tipine özgü doğruluk ile eşlenebilir. Bu yaklaşımın hem Mavi ışıkla aktive edilmiş channelrhodopsin chronos, hem de kırmızı vitesli bir channelrhodopsin olan ChrimsonR ile çalıştığını gösteriyoruz. Ön beyin önceki raporların aksine, biz ChrimsonR sağlam dorsal koklear çekirdek çekirdek nöronlar aksonları aşağı ticareti olduğunu bulmak, ChrimsonR beyin sapı CRACM deneyler için yararlı bir araç olabileceğini gösteren. Burada sunulan protokol, dorsal koklear çekirdeğive farelerin IC enjeksiyonlarını hedeflemek için stereotaksik koordinatlar da dahil olmak üzere intrakranial virüs enjeksiyon cerrahisinin ayrıntılı açıklamalarını ve tüm hücre yama kıskaç kaydının nasıl birleştirileceğini içerir. IC nöronlar için uzun menzilli projeksiyonlar araştırmak için channelrhodopsin aktivasyonu ile. Bu protokol, işitsel girdileri IC'ye göre karakterize etmek için tasarlanmış olsa da, işitsel beyin sapı ve ötesindeki diğer uzun menzilli projeksiyonları araştırmak için kolayca uyarlanabilir.

Biz VIP-IRES-Cre fareler geçti(Viptm1(cre)Zjh/ J) ve Ai14 Cre-muhabir fareler (B6). Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) hangi VIP nöronlar floresan protein tdTomato ifade F1 yavruları oluşturmak için. Her iki cinsiyetin F1 yavruları, doğum sonrası gün (P) 21-P70 yaş olarak kullanıldı. Bu çalışmada toplam 22 hayvan kullanılmıştır.
AAV1 stereotaksik enjeksiyon. Syn.Ch...

Watch this Scientific Journal Video about Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins at JoVE.com

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

Channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) anatomik ve / veya genetik olarak tanımlanan nöron grupları arasında uzun menzilli nöronal projeksiyonlar fonksiyonel haritalama için hassas bir tekniktir. Burada, işitsel beyin sapı bağlantılarını haritalamak için CRACM'nin nasıl kullanılacağını anlatıyoruz, buna kırmızı-shifted opsin, ChrimsonR'ın kullanımı da dahil.

Mavi ve Kırmızı-shifted Channelrhodopsins ile Inferior Colliculus Nöronların Uzun menzilli Channelrhodopsin destekli Devre Haritalama

When investigating neural circuits, a standard limitation of the in vitro patch clamp approach is that axons from multiple sources are often intermixed, ...

Channelrhodopsin destekli devre haritalama uzun menzilli nöral projeksiyonların fonksiyonel haritalama için hassas bir tekniktir. Burada, işitsel beyin sapındaki devreleri araştırmak için bu yaklaşımın nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Beyin dilimlerinde, birden fazla kaynaktan aksonlar genellikle birbirine karıştırılır, bu da elektriksel stimülasyon kullanarak bireysel girdileri izole etmeyi zorlaştırır.CRACM kullanılarak, bu sınırlama aşılabilir. Lambda'yı bulmak ve stereotaksik koordinat sistemini sürekli olarak tanımlamak, prosedürün süresini kısa tutmak gibi zordur. Tüm adımları dikkatle eşlenen olması başarı oranını artıracaktır.Dezenfekte etmek ve ameliyat alanını kapsayacak şekilde steril havlu perdeleri yerleştirmek için ameliyat alanını %70 etanol ile püskürterek başlayın. Kurtarma kafesinden boğulma riskini sınırlamak için kafes yataklarını çıkarın. Sonra, kafes altında bir ısıtma yastığı koymak ve bir gıda ve su kaynağı sağlar.Daha sonra, bir stereotaksik çerçeve için hayvan transfer ve anestezi devam edin. Bir rektal sıcaklık probu takın ve homeostatik sıcaklık kontrol cihazını açın. Daha sonra, göz kurumasını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.Preemptive analjezik uygulayın. Son olarak, elektrikli makas ile kafa derisi tıraş. Povison iyot ve% 70 etanol üç alternatif bezleri ile kafa derisi dezenfekte.Kulaklar arasında başlayan ve gözlere devam rostral, lambda ve bregma dikişleri açığa, orta hat boyunca kafa derisi bir kesi yaparak cerrahi başlar. Cildi yana doğru itin ve gerekirse açıktaki kemikten periostteumu çıkarın. Daha sonra lambda sütüne cerrahi bir belirteç le işaretleyin, nano-enjektörün ucunu sadece lambda'ya dokunup mikromanipülatör koordinatlarını sıfırlayabilsin diye yerleştirin.Lambda ve bregma dikişleri arasındaki yükseklik farkını ölçmek için nano-enjektör ucu ve mikromanipülatör kullanın. Lambda ve bregma'yı artı veya eksi 100 mikrometre yükseklik farkının içine getirmek için palet çubuğu yüksekliğini ayarlayın. Nano-enjektör ucu ve mikromanipülatör koordinat sistemini kullanarak enjeksiyon bölgesini haritalayın ve bölgeyi bir cerrahi belirteçle işaretleyin.Daha sonra, enjeksiyon yeri üzerinde kraniyotomi yapmak için 0,5 milimetrelik matkap çapaklı bir mikromotor matkap kullanın. Hedef çekirdekteki nöronların geniş transfeksiyonunu sağlamak için, dokudaki çeşitli derinliklerde enjeksiyonlar yapmak için nano-enjektör kullanın ve inferior kolikulus gibi daha büyük beyin bölgelerinde, farklı X ve Y koordinatlarında iki veya daha fazla penetrasyon sırasında enjeksiyonlar yapın. Inferior kolikulus enjekte etmek için, 2, 250 mikrometre ve 1, 750 mikrometre derinliği arasında Z ekseni boyunca 250 mikrometre aralıklarla virüs 20 nanolitre mevduat.Dorsal koklear çekirdeğin enjeksiyonları için, sırasıyla 4, 750 mikrometre ve 4, 550 mikrometre derinlikte 20 nanolitre virüs yatırın. Her Z koordinatına enjekte ettikten sonra, virüsün enjeksiyon bölgesinden uzaklaşması için zaman tanımak için enjektörü bir sonraki Z koordinatına taşımadan önce 2-3 dakika bekleyin ve nano-enjektör yeniden konumlandırıldığında virüsün enjeksiyon yoluna çekilme olasılığını azaltın. Sonra, son enjeksiyondan sonra, nano-enjektörü beyinden çekmeden önce 3-5 dakika bekleyin.Nano-enjektör penetrasyonlar arasında ve hayvanlar arasında beyinden çıkarıldığında, ucun tıkanıp tıkanmadığını kontrol etmek için uçtan küçük bir miktarda virüs çıkar. Enjeksiyonlardan sonra, kafa derisinin kesilmiş kenarlarını ısladıktan sonra cildi yavaşça orta hatta doğru hareket ettirmek için steril PBS kullanın. 6-0 naylon dikişler kullanarak basit kesilmiş dikişler ile yara kapatın.Daha sonra, yaraya %2 lidokain jölesi 0,5 ila bir mililitre uygulayın. Kulak çubuklarını ve sıcaklık sondasını çıkarın, izofluran'ı çevirin ve hayvanı palet çubuğundan çıkarın ve kurtarma kafesine aktarın. Son olarak, kurtarmayı yakından izleyin.Bir kez hayvan tamamen uyanık, hareket, ve ağrı veya sıkıntı hiçbir belirti gösteren, onun kafes içine geri aktarın ve vivarium kafes dönmek. Kayıtları yapmak için standart yama kelepçesi yöntemlerini kullanın. Sabit bir sahne dik mikroskop altında bir kayıt odasına dilim yerleştirerek başlayın ve sürekli dakikada iki mililitre yapay beyin omurilik sıvısı ile bol.Sonra, uygun bir yama kelepçe amplifikatör kullanarak görsel kontrol altında yama nöronlar. Son olarak, toptan kayıtlar sırasında, ticari led'ler aracılığıyla 580 nanometre ışık kısa darbeler ile 470 nanometre ışık veya ChrimsonR kısa darbeler sunarak Chronos etkinleştirin. Sonuçlar, ChrimsonR enjeksiyonu hücre ve liflerde görülen tdTomato floresan ile DCN güçlü bir ifade yol gösterdi.Kontralateral ICC'de, tdTomato ile güçlü bir şekilde etiketlenmiş lifler üç hafta sonra açıkça görülebiliyordu ve işitsel beyin kök çekirdeklerine enjekte edildiğinde ChrimsonR-tdTomato yapısının uzun menzilli insan ticareti yeteneğini gösteriyordu. ChrimsonR optik aktivasyonu IC VIP nöronlarda epsPs ortaya, ChrimsonR uzun menzilli CRACM deneyleri için yararlı bir araç olduğunu gösteren deneysel parametreler mavi ışık yerine kırmızı ışık kullanımını talep. Ancak, ChrimsonR kolayca mavi ışık ile aktive olduğunu bulundu, Chronos olarak mavi ışık aktivasyonu için aynı eşik gösteren.Bu protokol için stereotaksik koordinatların doğru olduğundan emin olmak ve virüsün yalnızca hedeflenenizdeki beyin bölgesinde ifade edildiğini doğrulamak en önemlidir. Chronos ChrimsonR viroyapısını farklı bir virüsle, örneğin hücreye özgü Flex virüsüyle değiştirerek, ameliyat protokolünü değiştirmeden birkaç anatomik veya fizyolojik soruyu yanıtlayabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Eşzamanlı MEG ve EEG Fonksiyonel Haritalama

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Nörobilim

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Hücre içi Kaydı, Duyu Alan Haritalama ve Sülük de Kültüre Belirlenen Nöronlar Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ile<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI)

Meta-analysis of Voxel-Based Neuroimaging Studies using Seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images SDM-PSI

Konu Görüntülerinin Permütasyonu ile Tohum Bazlı d Haritalama Kullanılarak Voxel Tabanlı Nörogörüntüleme Çalışmalarının Meta-analizi (SDM-PSI)

Most methods for conducting meta-analysis of voxel-based neuroimaging studies do not assess whether effects are not null, but whether there is a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...