Name: quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

تم دعم البحث المقدم في هذه المقالة من خلال المنح السابقة من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه القحفي (NIH / NIDCR) R01DE020884 إلى J.K.E. والمعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (NIH / NIAAA) F32AA021320 إلى C.B.L. وعن طريق المنحة الحالية من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول (NIH / NIAAA) R00AA023560 إلى C.B.L. نشكر روبن غونزاليس على تقديم ومساعدة في تحليل الكروماتوجراف الغاز. نشكر تياهنا أونتيفيروس والدكتورة جينا نوبلز على المساعدة في الكتابة.

تم رفع جميع أجنة حمار وحشي المستخدمة في هذا الإجراء وتربيتها بعد بروتوكولات IACUC الراسخة27. تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل جامعة تكساس في أوستن وجامعة لويزفيل.
ملاحظة: تم استخدام خط حمار وحشي Tg (fli1:EGFP)y1 في هذه الدراسة28. جميع الميا?...

<ol>
	<li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome:+a+prospective+national+surveillance+study.">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li><li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology.">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li><li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders.">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+(PAE):+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE.">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li><li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+Alcohol+Consumption:+Studies+with+Mutant+Mice.">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li><li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social,+cognitive+and+affective+behavioral+domains:+Insights+from+rodent+models.">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li><li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism.">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li><li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent.">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li><li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse:+a+minireview.">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li><li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure.">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li><li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure.">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li><li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice.">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).</li><li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly.">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li><li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li><li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother.">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li><li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II:+microencephaly+and+neuronal+losses.">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects:+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits.">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+(nNOS)+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice.">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li><li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice.">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li><li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders:+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis.">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li><li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish.">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li><li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol's+molecular+targets.">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos,+Brachydanio+rerio.">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li><li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay.">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li><li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+(HS-GC-FID).">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li><li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS.">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li><li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector.">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li><li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+methanol,+acetaldehyde,+acetone,+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection.">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li><li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography.">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).</li><li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain.">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li><li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats:+effects+of+dose+and+time.">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li><li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity.">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li><li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish.">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li><li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin,+Fgf,+and+sonic+hedgehog+function.">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li></ol>

وكنظام نموذجي تنموي، فإن سمك الحمار الوحشي مناسب بشكل مثالي لدراسة تأثير العوامل البيئية على التنمية. وهي تنتج أعدادا كبيرة من الأجنة المخصبة خارجيا، مما يسمح بمواعيد دقيقة وجرعات نموذجية في دراسات الإيثانول. هذا، جنبا إلى جنب مع قدرات التصوير الحي والحفاظ على الوراثية والتنموية مع البش...

تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) مجموعة واسعة من العاهات العصبية وخلل الشكل القحفي المرتبط بالتعرض للإيثانول الجنيني1. عوامل متعددة، بما في ذلك توقيت وجرعة التعرض للإيثانول والخلفية الوراثية، تسهم في الاختلاف من FASD2،3. في البشر ، والعلاقة المعقدة من هذه المتغيرات يجعل دراسة وفهم مسببات FASD تحديا. وقد أثبتت النماذج الحيوانية حاسمة في تطوير فهمنا للأساس الآلي لمسخة الإيثانول. وقد استخدمت مجموعة واسعة من أنظمة النماذج الحيوانية لدراسة جوانب متعددة من FASD وكانت النتائج متسقة بشكل ملحوظ مع ما هو موجود في التعرض في البشر4. وتستخدم أنظمة نموذج القوارض لدراسة العديد من جوانب FASD، مع الفئران كونها الأكثر شيوعا5،6،7. وقد ركزت غالبية هذا العمل على عيوب النمو إلى التعرض المبكر للإيثانول8، على الرغم من التعرض في وقت لاحق للإيثانول وقد ثبت أن يسبب الشذوذ التنموي ة وكذلك9. وعلاوة على ذلك، ساعدت القدرات الوراثية للفئران إلى حد كبير في قدرتنا على التحقيق في الأسس الوراثية لFASD10،11. هذه الدراسات في الفئران تشير بقوة إلى أن هناك تفاعلات الجينية الإيثانول مع مسار القنفذ الصوتية، إشارات حمض الريتينويك، ديسموتاز Superoxide، أكسيد النيتريك synthase الأول، Aldh2 وFancd28،10،11،12،13،14،15،16،18،18، 19،20،21. وتبين هذه الدراسات أن النماذج الحيوانية حاسمة لتعزيز فهمنا لFASD وآلياتها الأساسية.
وقد برز حمار وحشي كنظام نموذج قوي لدراسة العديد من جوانب الايثانول teratogenesis22،23. بسبب الإخصاب الخارجي ، والبراز العالي ، والقدرة الوراثية ، وقدرات التصوير الحي ، فإن سمك الحمار الوحشي مناسب بشكل مثالي لدراسة عوامل مثل التوقيت والجرعة وعلم الوراثة لتولد الإيثانول. يمكن إعطاء الإيثانول للأجنة المحددة بدقة ويمكن بعد ذلك صورة الأجنة لفحص التأثير المباشر للإيثانول أثناء عمليات النمو. هذا العمل يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة إلى البشر، وذلك لأن البرامج الوراثية للتنمية يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين حمار وحشي والبشر، وبالتالي يمكن أن تساعد في توجيه الدراسات الإنسانية FASD24. في حين تم استخدام سمك الحمار الوحشي لفحص تولد الإيثانول ، فإن عدم وجود توافق في الآراء في الإبلاغ عن تركيزات الإيثانول الجنينية يجعل المقارنة مع البشر صعبة25. في أنظمة الثدييات ، ترتبط مستويات الكحول في الدم مباشرة بمستويات الإيثانول الأنسجة26. العديد من دراسات حمار وحشي علاج الأجنة قبل تشكيل كامل من نظام الدورة الدموية. ومع عدم وجود عينة أمومية لفحصها، يلزم إجراء عملية لتقييم تركيزات الإيثانول لتحديد مستويات الإيثانول داخل الجنين. هنا نصف عملية لقياس تركيزات الإيثانول في جنين حمار وحشي النامية باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoSampler, CP-8400</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Gas Chromatograph Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>8010-0198</td>
			<td>Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatograph, CP-3800</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Innowax capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19095N-123I</td>
			<td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &#956;m film thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrdogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-7021</td>
			<td>Replacement caps/septa for gas chromatograph vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads .5 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads 1.0 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>57343-U</td>
			<td>Replacement fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Star Chromatography Workstation</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>23154</td>
			<td>Replacement inlet septa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography

تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) سلسلة متصلة متغيرة للغاية من عيوب النمو الناجمة عن الإيثانول، بما في ذلك خلل في الشكل وإعاقات عصبية. مع علم الأمراض المعقد ، يؤثر FASD على ما يقرب من 1 من كل 100 طفل يولدون في الولايات المتحدة كل عام. نظرًا للطبيعة المتغيرة للغاية لـ FASD ، أثبتت النماذج الحيوانية أهميتها الحاسمة في فهمنا الآلي الحالي لعيوب التنمية الناجمة عن الإيثانول. وقد ركز عدد متزايد من المختبرات على استخدام سمك الحمار الوحشي لفحص العيوب التنموية الناجمة عن الإيثانول. تنتج سمكة الحمار الوحشي أعدادًا كبيرة من الأجنة الملقحة خارجيًا والقابلة للنقل وراثيًا والشفافة. وهذا يسمح للباحثين بالتحكم الدقيق في توقيت وجرعة التعرض للإيثانول في سياقات وراثية متعددة وتحديد تأثير التعرض للإيثانول الجنيني من خلال تقنيات التصوير الحي. وقد ثبت أن هذا ، إلى جانب الدرجة العالية من الحفاظ على كل من علم الوراثة والتنمية مع البشر ، هو نموذج قوي لدراسة الأساس الآلي لمسخالإيثانول. ومع ذلك، فقد تنوعت نظم التعرض للإيثانول بين دراسات مختلفة لسمك الحمار الوحشي، مما أربك تفسير بيانات سمك الحمار الوحشي عبر هذه الدراسات. هنا هو بروتوكول لتحديد تركيزات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.

لا يمكن تحديد مستويات الإيثانول في الدم في وقت مبكر من سمك الحمار الوحشي الجنيني ، لأنها تفتقر إلى نظام الدورة الدموية بشكل كامل. لتحديد مستوى تركيز الإيثانول في أجنة حمار وحشي ، يتم قياس مستويات الإيثانول مباشرة من الأنسجة الجنينية المتجانسة. ولقياس تركيزات الإيثانول الجنينية بشكل صحيح?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

يصف هذا العمل بروتوكولًا لقياس مستويات الإيثانول في جنين حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس من طرق التعرض المناسبة لمعالجة الأجنة وتحليل الإيثانول.

القياس الكمي لمستويات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الرأس الفضائية

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

وهذا البروتوكول هام لأنه يساعد في فهم المستحضرات الدوائية من الإيثانول في تطوير أجنة حمار وحشي وهذا سيساعد على توحيد أنظمة التعرض الإيثانول في دراسات حمار وحشي. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها تسمح للباحثين بقياس مستويات الإيثانول بسرعة وتكاثر خلال النمو الجنيني ، خاصة في الأجنة التي لا تتوفر فيها إمدادات الدم. ويمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على أنظمة نماذج أخرى، فضلا عن العوامل البيئية الأخرى بافتراض التقنية المناسبة وإعداد المعدات.أتوقع من الأفراد الذين يؤدون هذا البروتوكول للمرة الأولى أن يكافحوا بالسرعة اللازمة لمنع تبخر الإيثانول أثناء معالجة الأجنة. تبدأ من خلال نقل 10 أجنة مع السوائل الجنينية اضافية في 1.5 ملليلتر microcentuge أنابيب ملحوظ مع خط في حجم 250 ميكرولترات. إضافة الماء إلى خط التعبئة.إعداد أنابيب إضافية microcentrifuge لعينات مفكك. لإزالة المشيم، احتضان الأجنة في طبق بيتري 100 ملليمتر مع ملليغرامين لكل ملليلتر من كوكتيل البروتياز في وسائل الإعلام الجنين لمدة 10 دقائق. دوامة بلطف الطبق كل بضع دقائق لكسر المشيمة.مرة واحدة كل الأجنة خالية من المشيمة، وإزالتها من كوكتيل البروتيز وغسلها مرتين مع وسائل الإعلام الطازجة. ثم نقل الأجنة إلى طبق جديد 100 ملليمتر. عندما تكون جميع العينات جاهزة لقياس الحجم، استخدم p200 micropipette مع أصغر طرف ممكن لإزالة جميع السوائل بعناية من جميع أنحاء الأجنة.وزن الماء مع مقياس مع أقل من 0.1 مليغرام الدقة، ثم تحديد حجم الأجنة 10 عن طريق طرح وزن المياه إزالتها من 250 ميكرولترات. لتحديد حجم جنين واحد، قم بتقسيم الفرق على 10. جمع الأجنة من خزانات التزاوج ووضعها في طبق بيتري معيار 100 ملليمتر ثم احتضان الطبق في 28.5 درجة مئوية.في ست ساعات بعد الإخصاب، نقل ما يصل إلى 100 جنين إلى طبق جديد مع وسائل الإعلام الجنين و 1٪ الإيثانول أو وسائل الإعلام وحدها. تغطية ولكن لا لختم أطباق بيتري ووضعها في حاضنة درجة 28.5 درجة مئوية لمدة 18 ساعة أو حتى تصل إلى 24 ساعة بعد الإخصاب. استخدام اثنين من micropipettes P200 تعيين إلى 50 ميكروليتر وpireate حل كوكتيل protease في واحد والماء في الثانية.ثم ضع بسرعة 10 أجنة في أنبوب ميكروسنتروج 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة زجاجية وإغلاق الغطاء. كرر هذه العملية لجميع العينات التي سيتم اختبارها، والضوابط والايثانول المعالجة الأجنة. العمل مع عينة واحدة في وقت واحد، وفتح بسرعة الغطاء وpirate جميع وسائل الإعلام الجنين المتبقية مع p200 micropipette تعيين إلى 200 ميكرولترات.بسرعة ولكن بلطف إضافة وإزالة 50 ميكرولترers من الماء، ثم إضافة 50 ميكرولترers من كوكتيل البروتياز وإغلاق غطاء أنبوب. السماح للعينة الجلوس لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم إضافة بسرعة 450 ميكرولتردات من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس وإغلاق غطاء أنبوب. التجانس العينة عن طريق دوامة لمدة 10 دقائق ونقل اثنين من ميكرولترات من عظمى إلى قارورة الكروماتوغرافيا الغاز.ختم القارورة مع غطاء متعددtetrafluoroethylene. بعد إكمال أسلوب بدء التشغيل تحميل 436 الإيثانول SPME الحالي تشغيل RG 2 إلى خمس دقائق. الميث من القائمة أساليب في برنامج تحليل لكل عينة في قائمة العينة.ملء قائمة العينة بدءا من الهواء والماء، وخمسة الصوديوم كلوريد الصوديوم الخلآيات كوكتيل. ثم أدخل في معايير الإيثانول في النظام من 0.3125 إلى 40 ملليمولار. اتبع المعايير مع الجولة الثانية من الفراغات.أدخل جميع عينات الأجنة المتجانسة الفائقة ليتم اختبارها من أدنى إلى أعلى تركيز الإيثانول المتوقع والانتهاء من خلال إدخال جولة ثالثة من الفراغات. إضافة قوارير الكروماتوغرافيا الغاز إلى autosampler في الترتيب الذي تم إدخال العينات والسماح لهم لتدفئة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم بدء تشغيل نموذج باستخدام البرنامج.بعد اكتمال كافة عمليات التشغيل، قم بتنشيط أسلوب إيقاف التشغيل عن طريق إضافة عينة نهائية في قائمة العينات وتشغيل standby.meth. النسخ احتياطي لكافة البيانات التي تم الحصول عليها أثناء تشغيل نموذج. بمجرد اكتمال طريقة إيقاف التشغيل، انقر فوق الكروماتوغرام المفتوحة وفتح المجلد مع النتائج.يتم دمج العينات تلقائيا في هذا البرنامج. في النتائج، تأكد من أن القمم الصحيحة قد تم دمجها. بمجرد تأكيد جميع العينات، طباعة أو تصدير النتائج.رسم ذروة ارتفاع معايير الإيثانول على الرسم البياني، ثم حساب قيم الميل، تقاطع y، و r تربيع القيم. الحصول على قيمة الإيثانول لكل عينة عن طريق طرح ذروة ارتفاع العينة من تقاطع y للمعايير وتقسيم هذه القيمة على ميل المعايير. لحساب تركيز الإيثانول في الأجنة، حساب عامل التخفيف لكل عينة وضرب قيمة الإيثانول العينة بواسطة عامل التخفيف هذا.وأخيراً، حساب عينات مراجع الوسائط بضرب قيمة الإيثانول الإعلامي بعامل تخفيف قدره 10. لحساب تركيزات الإيثانول الجنينية بشكل صحيح، تم قياس كميات الأجنة في المشيمية الخاصة بها وإزالتها من الكورال الخاصة بها. في هذا التحليل، شكل الجنين 56٪ من الحجم الإجمالي داخل المشيمية.واستناداً إلى العمل المنشور سابقاً، تم استخدام 73.6٪ كمحتوى مائي جنيني لجميع التحليلات المقدمة. وأدى ذلك إلى أن يكون الماء 0.82 ميكرولترات من 1.1 ميكرولترات من حجم الجنين. من إجمالي حجم المياه، 49٪ موجود في الجنين و 51٪ في السائل خارج الجسم.وبالنسبة لتحليل الكروماتوغرافيا الغازية، تم تحليل مجموعتين من 15 عينة ووسائط الإعلام التي عولجت بها قياسها خمس مرات لكل مجموعة. وكانت مستويات الإيثانول الإعلامي 143.6 ملليمولار للمجموعة الأولى و133.6 ملليمولار للمجموعة الثانية. وبلغ متوسط تركيزات الإيثانول في الأجنة 63.5 ملليمولار و 53.1 ملليمولار للمجموعتين الأولى والأخرى على التوالي.تم حساب نسبة تركيز الإيثانول الجنيني إلى مستويات الإيثانول في كل عينة من وسائل الإعلام. المجموعة الأولى كان لديها 44٪ من مستويات الإيثانول الإعلامي بينما كان لدى المجموعة 40٪ من مستويات الإيثانول الإعلامي. تم قياس الأجنة التحكم غير المعالجة في تركيز الإيثانول وسائل الإعلام صفر ميليمولر.أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو أن معالجة الأجنة لتحليل GC بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية لأن الإيثانول متطاير وسوف يتبخر بسرعة. يتم وصف أفضل طريقة لتنفيذ هذه الخطوة، ولكن يجب أن تمارس لتطوير الذاكرة العضلية المناسبة. وسيساعد هذا الإجراء على توحيد نظم معالجة الإيثانول في أسماك الحمار الوحشي والسماح للعمل في المستقبل بتشريح الآليات الوراثية والخلوية لتهيّر الإيثانول.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)-على أساس جميع

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...