Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Ringraziamo Vincent Schram del nucleo di microscopia e imaging NICHD per aver aiutato nell'acquisizione di immagini confocali, e Tsg-Hui Chang per un aiuto inestimabile con la gestione delle cozioni e la cura dei topi. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S. A.B. è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, e da una Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship del programma di ricerca intramurale del NIDCD.

Le procedure di cura e sperimentazione degli animali sono state eseguite seguendo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, che sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto nazionale di disturbi neurologici e ictus (protocollo animale #1336 a KJS).
1. Topi
<ol><li>Impostare un paio di coppie riproduttive di tipo C57BL/6J per riprodursi nella struttura animale per controllare la data di nascita delle cucciolate e tenere traccia dell'...

Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti di assorbimento nell'organo murno degli esoti di Corti con 3 kDa dextran Texas Red. L'obiettivo di questo metodo è quello di verificare se le molecole più grandi di altre precedentemente testate sono state anche in grado di etichettare specificamente le cellule ciliate uditive e permeare attraverso il canale MET. Protocolli sperimentali simili sono stati precedentemente utilizzati per valutare la permeabilità delle cellule ciliate ad altri coloranti fluorescenti com...

Le cellule ciliate dell'orecchio interno sono le cellule sensoriali che rilevano il suono e coprono gli stimoli meccanici nei segnali elettrici, che alla fine vengono interpretati dal nostro cervello. Queste celle hanno un fascio a forma di scala di tre file di filamenti a base di actina, noto come stereocilia, che sporgono dalla loro regione apicale1,2. Gli stimoli meccanici deviano i filamenti di stereocilia verso la fila più lunga e innescano l'apertura della meccanotransduzione (MET) canali3. L'apertura dei canali MET porta ad un afflusso di cations che depolarizza la cellula e di conseguenza segnala il rilascio di vescicoli sinapsi nella regione basale della cellula ciliata.
Le proprietà biofisiche del canale MET essenziali per l'udito sono state ampiamente caratterizzate. Tra le altre proprietà, questi canali sono cationic selettivo e hanno una conduttanza relativamente grande (150-300 pS in basso Ca2 ,)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandi molecole fluorescenti come FM1-43 e Texas Red-etichettato aminoglycosides sono permeant bloccanti del canale MET, con conseguente loro accumulo nel corpo delle cellule dei capelli che può essere visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza11,12,13,14. Al contrario, l'identità molecolare e la struttura del canale MET e il suo percorso di permeazione sono rimasti sfuggentemente. Sempre più prove sperimentali indicano che la proteina del canale transmembrana 1 (TMC1) è un componente del canale MET nelle cellule ciliate mature15,16,17,18,19. Le mutazioni nel canale 1 (TMC1) simile alla transmembrana alterano le proprietà del canale MET19,20,21,22 e causano sordità. Inoltre, TMC1 localizza al sito del canale MET18,23 e interagisce con il tip-link responsabile della trasmissione della forza meccanica al canale MET24,25. Inoltre, una recente analisi bioinformatica ha identificato le proteine TMC come evolutive relative ai canali meccanosensibili tMEM63/OSCA e alle proteine TMEM16, una famiglia di canali di cloruro attivati dal calcio e scramblases lipidici26,27,28. Un modello strutturale di TMC1 basato sulla relazione tra queste proteine ha rivelato la presenza di una grande cavità all'interfaccia proteina-lipidico27. Questa cavità ospita le due mutazioni di TMC1 che causano la perdita dell'udito autosomica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e la modifica selettiva dei mutanti di cisteina per i residui nelle proprietà del canale MET della cavità28, indicando che potrebbe funzionare come percorso di permeazione del canale MET. Le grandi dimensioni di questa cavità prevista nelle proteine TMC potrebbero spiegare la capacità di molecole di grandi dimensioni di permeare il canale MET. Per testare la previsione che il canale MET contenga un percorso di permeazione insolitamente grande e per spingere i limiti delle dimensioni della cavità osservata in TMC1, abbiamo sviluppato un protocollo per eseguire esperimenti di assorbimento nell'organo di Antipiante di Corti con una molecola più grande, 3 kDa dextran fluorescente etichettata con Texas Red.
Dextran è un complesso polisaccaride ramificato composto da molte molecole di D-glucosio legate da collegamenti alfa-1,6 glicosidici. La sua elevata solubilità nell'acqua, la bassa tossicità cellulare e la bioinertità lo rendono uno strumento versatile per studiare diversi processi cellulari. Inoltre, dextran è disponibile in una vasta gamma di dimensioni e fluorescente etichettato con fluorofori di diversi colori. Fluorescently etichettato dextrans sono comunemente utilizzati nella ricerca di permeabilità cellulare e tessuto33,34, per studiare l'endocitosi in più sistemi cellulari35,36, e per la traccia neurale37,38. Nel campo uditivo, le molecole di dextran sono state utilizzate anche per valutare la rottura della giunzione cellulare-cellula e la perdita dell'integrità dell'epitelio sensoriale uditivo dopo l'esposizione a rumore intenso nell'organo cincillà di Corti39,40.
In questo lavoro, abbiamo sfruttato le proprietà di alcuni dei più piccoli (3 e 10 kDa) dextrans fluorescenti per eseguire esperimenti di assorbimento nelle cellule ciliate dell'orecchio interno murine ed esplorare le dimensioni del percorso di permeazione del canale MET della cellula capelli interna. Inoltre, abbiamo utilizzato un microscopio confocale a scansione laser (LSM) 880 dotato di un rilevatore Airyscan per visualizzare e localizzare dextran fluorescente in stereocilia e nel corpo cellulare delle cellule ciliate uditive.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Il canale mechanotransduzione delle cellule ciliate (MET) svolge un ruolo importante nell'udito. Tuttavia, l'identità molecolare e le informazioni strutturali del MET rimangono sconosciute. Studi elettrofisiologici sulle cellule ciliate hanno rivelato che il canale MET ha una grande conduttanza ed è permeabile a molecole cazionali fluorescenti relativamente grandi, tra cui alcuni coloranti di stiryl e antibiotici aminoglycoside etichettati con marchio rosso texas. In questo protocollo, descriviamo un metodo per visualizzare e valutare l'assorbimento di dextrans fluorescente nelle cellule ciliate dell'organo di espianti Corti che può essere utilizzato per testare i canali MET funzionali. Abbiamo scoperto che 3 kDa Texas Red-labeld è etichettato specificamente sulle cellule ciliate uditive funzionali dopo l'incubazione di 1-2 h. In particolare, 3 kDa dextran etichetta le due file stereocilia più corte e si accumula nel corpo cellulare in un modello diffuso quando sono presenti canali MET funzionali. Un ulteriore modello vescino-come di etichettatura è stato osservato nel corpo cellulare delle cellule ciliate e circostante le cellule di supporto. I nostri dati suggeriscono che 3 kDa Texas-Red dextran può essere utilizzato per visualizzare e studiare due percorsi per l'assorbimento del coloranti cellulare; un percorso di ingresso specifico per le cellule di capelli attraverso canali MET funzionali e l'endocitosi, un modello disponibile anche per dextran più grandi.

Abbiamo osservato un'etichettatura robusta e specifica delle cellule ciliate dopo l'incubazione di 2h di organi di espianti Corti da topi postnatali-giorno-6 (P6) di tipo selvaggio con 3 kDa dextran fluorescente etichettati con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). L'etichettatura Dextran è stata osservata nelle cellule ciliate interne ed esterne (IHC e OHC) nelle regioni basale, centrale e apicale dell'organo di Corti(Figura 2B).</stro...

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Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Qui, presentiamo un metodo per visualizzare l'assorbimento di 3 kDa Texas Red-etichetta tono in cellule ciliate uditive con canali di meccanotrazione funzionali. Inoltre, dextrans di 3-10 kDa può essere utilizzato per studiare l'endocitosi nei capelli e le cellule di supporto dell'organo di Corti.

Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare l'assorbimento del dextran regolare etichettato fluorescentmente con Texas Red nelle cellule ciliate vive con canali meccanotraduzione funzionali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i tre kilodalton Texas Red dextran possono essere utilizzati per valutare la funzione del canale di meccanotrasduzione nelle cellule ciliate vive. Per raccogliere la coclea, posizionare il cranio di un topo postnatale di sei giorni in un piatto di coltura di 60 millimetri contenente il mezzo L-15 di Leibovitz e utilizzare forbici chirurgiche per fare un taglio superficiale dall'estremità anteriore all'estremità posteriore del cranio e attraverso i canali uditivi esterni.Piegare la pelle verso il naso per esporre il cranio e fare un'incisione dalla parte posteriore alla parte anteriore del cranio e attraverso la linea degli occhi. Separare il cranio in due metà e usare una piccola spatola per rimuovere il cervello. Quando le ossa temporali possono essere osservate, utilizzare piccole forbici per tagliare intorno a queste ossa per asportare il tessuto.Immergere le ossa temporali nel piatto da 35 millimetri contenente mezzo fresco L-15 e posizionare il piatto sotto un microscopio stereo dotato di un ampio oculare di campo e di una sorgente luminosa alogene a corrente alternata esterna. Utilizzare le forcelle per rimuovere il tessuto cocleare circostante, i canali semicircolari e gli organi vestibolari. Una volta che la coclea è stata sezionata e posta in un nuovo piatto con mezzi L-15 freschi, utilizzare pini chirurgici per fare una ferita da puntura sulla finestra rotonda e una foratura nella regione cocleare apicale.Una volta raccolte tutte le cocle, posizionare il tessuto in un pozzo di una lastra di depressione in vetro a nove porri contenente 200 microlitri di mezzo L-15 fresco. Per l'etichettatura dextran dei tessuti isolati, sostituire bene il mezzo di ciascun campione con 200 microlitri di mezzo L-15 fresco integrato con due milligrammi per millilitro del dextran coniugato a fluorescenza di interesse. Incubare i campioni per due ore a temperatura ambiente e 25 rotazioni al minuto in uno shaker tridimensionale con un angolo inclinato di 25 gradi protetto dalla luce.Alla fine dell'incubazione, lavare i tessuti una volta con mezzo e una volta con HBSS per due minuti per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, fissare i campioni in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi rapidi e delicati in HBSS. Dopo il secondo lavaggio, utilizzare le forcep a punta fine per rimuovere l'osso cocleare, il legamento a spirale e la membrana tectoriale e lavare l'organo isolato di Corti in HBSS.Prestare particolare attenzione quando si rimuove la membrana tectoriale trasparente poiché il tessuto sulle cellule ciliate può essere facilmente danneggiato durante questo passaggio. Per etichettare l'F-actin, permeabilizzare i campioni in 0,5%Triton X-100 in PBS integrati con 100-200 diluizione di phalloidin etichettata fluorescentmente per 30 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i tessuti da due a tre volte in HBSS fresco per lavaggio, come dimostrato da un singolo lavaggio in PBS.Utilizzare un mezzo di montaggio appropriato per montare l'organo dei tessuti Corti su un microscopio in vetro che fa scivolare i lati stereocilia dei capelli verso l'alto e immagini i campioni su un microscopio confocale fluorescente utilizzando l'obiettivo di immersione dell'olio 63X. Dopo un'incubazione di due ore con tre kilodalton dextran coniugati fluorescentmente con Texas Red, l'organo di Corti espianta dal giorno postnatale di tipo selvaggio sei topi dimostrano un'etichettatura robusta e specifica delle cellule ciliate sia interne che esterne. L'imaging della stereocilia dei capelli e dei corpi cellulari rivela che solo quelle cellule che hanno incorporato tre kilodalton dextran Texas Red nel loro corpo cellulare hanno anche dimostrato l'etichettatura fluorescente della loro stereocilia.È importante sottolineare che un segnale fluorescente uniforme si osserva lungo la stereocilia con arricchimento alle punte delle file stereocilia più corte in cui si trova il canale di meccanotraduzione. Si osservano anche strutture simili a vesciche nel corpo cellulare delle cellule ciliate e delle cellule di supporto vicine che suggeriscono che il dextran Texas Red può anche essere assunto dall'endocitosi. Il più grande dextrans da 10 kilodalton ha anche prodotto un modello simile a una vescicola nel corpo cellulare delle cellule ciliate e delle cellule di supporto.In particolare, la presenza di un chelatore di calcio o di bloccanti del canale meccanotrasduzione impedisce l'etichettatura stereocilia e l'assorbimento di tre kilodalton dextran Texas Red nelle cellule ciliate. Il modello simile a una vescicola è ancora osservato in presenza di blocco del canale meccanotrasciduzione, tuttavia, indicando che questo modello di assorbimento è indipendente dai canali MET funzionali. È molto importante sezionare attentamente l'organo del tessuto Corti e confermare il corretto orientamento delle cellule ciliate prima di montare il tessuto per l'imaging.Dopo l'etichettatura dextran delle cellule ciliate vive e funzionali, l'immunostaining del tessuto fisso può essere eseguito per identificare specifici tipi cellulari di proteine di interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

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