Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

نحن نعترف بالدعم المقدم من منحة الأجهزة المشتركة في المعاهد القومية للصحة لنظام TripleTOF في معهد باك (1S10 OD016281). كما تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (R01 AI108255 إلى B.S.) والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R24 DK085610 إلى إريك فردين. R01 DK090242 إلى اريك جوتزمان). تم دعم X.X. بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (منحة المعاهد القومية للصحة T32GM8806 ، إلى جوديث كامبيسي وليزا إليربي) ، تم دعم N.B. من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة جلين للأبحاث الطبية.

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach.">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li><li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+level+of+complexity:+crosstalk+of+posttranslational+modifications.">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li><li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways.">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks.">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li><li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

يصف هذا البروتوكول تقنية جديدة لإثراء PTM متعددة في وقت واحد لفهم ptm عبر talk. الطرق البديلة للوصول إلى هذا الهدف تميل إلى أن تكون باهظة تستغرق وقتا طويلا ومكلفة، وأنها تتطلب كميات كبيرة من البروتين لتكون ناجحة11،13. يقدم هذا البروتوكول سير عمل تخصيب متعدد PTM يتضمن احتضان الخرز المترافق مع الأجسام المضادة لاثنتين من أجهزة منع الPTM في وقت واحد لتحسين الكفاءة الإجمالية للتجربة. تتضمن هذه الطريقة أيضًا استخدام DDA لتوليد المكتبة الطيفية ومقتنيات DIA MS للكشف عن الببتيدات الموجودة مع التداخل المخفض من الأيونات المجزأة22و23. وتستخدم برامج حاسوبية، مثل محركات البحث في قاعدة بيانات الماجستير لتحليل البيانات من عمليات الشراء DDA وقياسها، في حين أن برنامج البروتيوميات الكمي24 وبرنامج التحليل الكمي المحددة DIA25 ضروريان لتفسير الأطياف المعقدة التي تنتجها عمليات الاستحواذ على DIA.
هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول التي ينبغي اتباعها بعناية. وبما أن الهدف الرئيسي للبروتوكول هو الإثراء لـ PTMs متعددة في وقت واحد ، فإن خطوة تخصيب الأجسام المضادة (القسم 2) أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة. عند أداء غسل على الخرز، فمن الضروري لضمان أي من الخرز يتم استنشاقها بطريق الخطأ. ضمان تركيز اليوريا قد تم تخفيفها إلى 1 M قبل الهضم مع التربسين (الخطوة 1.8) هو ضروري أيضا. على الرغم من أن مطلوب 8 M اليوريا في وقت سابق في البروتوكول لذوبان البروتين, تركيزات اليوريا فوق 1 M سوف تمنع النشاط الأنزيمي التربسين. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم التحقق باستمرار من درجة الحموضة للعينة في جميع أنحاء البروتوكول. هذا مهم بشكل خاص قبل الهضم. إذا لم يتم تحييد درجة الحموضة للعينة ومحلول التربسين بشكل مناسب قبل الحضانة ، فقد يؤدي ذلك إلى عملية هضم غير فعالة حيث قد يتم تفويت العديد من مواقع الانقسام ، مما يؤدي إلى تحديد عدد أقل من الببتيد.
قد تكون بعض التعديلات على البروتوكول مفيدة عند إعداد العينات. للحصول على بروتين ليسات تم شراؤها من 1 ملغ من المواد الأولية ، يمكن استخدام ربع حبات الأجسام المضادة المتوفرة في كل أنبوب فحص PTM كبديل فعال من حيث التكلفة. يمكن استخدام كمية أكبر من مواد البدء للحصول على نتائج أفضل ، طالما يتم زيادة كمية حبات الأجسام المضادة المستخدمة بشكل متناسب. تعديل آخر يمكن أن تعزز سير العمل هو هضم عينات مع بروتياز آخر بالإضافة إلى التربسين. ومن شأن هذا التعديل أن يؤدي إلى مزيد من التباين في الببتيدات المتشبثة، مما يوفر تغطية متزايدة لمخلفات البروتين. على الرغم من أنه ليس من الضروري ، فمن المستحسن أن يكون التربسين أحد الإنزيمات المستخدمة لتحليل PTM بسبب خصوصيته العالية في الانقسام26.
ومن القيود المفروضة على هذا البروتوكول أن الآليات التي تجري دراستها تحتاج إلى كيمياء مماثلة لكي يتم إثراؤها في وقت واحد14. يجب أن تكون إجراءات الخرز المختلف للأجسام المضادة المترافقة متشابهة ، باستخدام مذيبات وحلول مماثلة ، بما في ذلك ظروف elution مماثلة ، ويفضل أن يكون من نفس البائع. لهذا السبب، تستخدم الطريقة الموضحة هنا باستمرار الأسيتيل والسكسينيل كمثال، وكلاهما يستخدم الخرز المتجانس بالأجسام المضادة (تكنولوجيا الإشارات الخلوية، وشركة). وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها نظرياً على أي عدد من آليات منع التجارة، فإن الأمر يحتاج إلى دراسات إضافية لتقييم القيد الدقيق للبروتوكول في هذا الصدد. وعلاوة على ذلك، وبما أن هذه طريقة تخصيب الأجسام المضادة، فإن هذه الطريقة لا يمكن أن توفر سوى تقدير كمي نسبي لمواقع الـ PTM.
وبالمقارنة مع أساليب الإثراء القائمة المتعددة الآليات، فإن سير العمل هذا هو بديل أكثر جدوى وفعالية من حيث التكلفة. من هذه التجربة، لوحظ أن فعالية هذه الطريقة تقارن بشكل جيد للغاية مع الأساليب البديلة، مثل الإثراء الفردي أو التسلسلي. ويبين الشكل 2باء أن السيرة الذاتية المتوسطة لمناطق ذروة الببتيد المعدلة قد انخفضت بالفعل في طريقة الوعاء الواحد بالمقارنة مع عمليات الإثراء أحادية الـ PTM والإثراءات المتسلسلة - PTM13. كما قمنا بتحليل النتائج التجريبية التي تقيّم التميّز الكمي على مستوى الموقع للتكيس أو السكّين. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل ارتباط سبيرمان(الشكل 2C,D)أن تخصيب PTM أحادي الوعاء كان يؤدي نفس الأداء لسير عمل الإثراء أحادي ة الـ PTM. وينطبق هذا أيضا على الارتباطات على مستوى الببتيد وشظية المستوى. ونفس الملاحظة التي أبديت بالنسبة لجميع الارتباطات الثلاثة عند مقارنة وعاء واحد مع الإثراء التسلسلي لـ PTM.
يسمح هذا البروتوكول للباحثين بإنشاء رؤى بيولوجية رائعة في الحديث المتبادل PTM بطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة. يسمح عنصر DIA في سير العمل للباحثين بفهم المزيد عن PTMs ، لأنه يوفر معلومات حول توطين الموقع ويتغلب على التحديات مثل انخفاض إشغال موقع PTMs. تميل الإصدارات السلائف إلى الاستبعاد مع DDA ، وهو أمر مهم بشكل خاص عند دراسة PTMs ، حيث أن إشغال الموقع غالبًا ما يكون منخفضًا لدرجة أن هذه الببتيدات لا يتم اختيارها لـ MS / MS ولكنها لا تزال تحتوي على معلومات حاسمة. ويمكن إجراء تجارب متابعة لتقييم الحد الأعلى لعدد الآليات التي يمكن إثراؤها في وقت واحد باستخدام هذه الطريقة. وقد يشمل التحسين المستقبلي لسير العمل هذا تطوير منصات برمجية أكثر تقدماً لزيادة أتمتة تحليل تعريب الموقع وإشغال موقع PTM.

عدد لا يحصى من التعديلات ما بعد الترجمة تنظيم البروتينات ومسارات حيوي من خلال آثار على النشاط1، مما يشيرإلى 2، ودوران3،4. على سبيل المثال ، يتم تنشيط kinases البروتين أو تعطيلها عن طريق إضافة مجموعات الفوسفات5، وخل الهستون وغيرها من التعديلات توفر آلية لتغيير بنية الكروماتين وبمثابةآلياتتنظيمية النسخ6،7. في السنوات الأخيرة ، وقد شنت الأدلة على أن PTMs متعددة تعمل في تناغم أو تتنافس لتنظيم وظيفة البروتين أو النشاط8،9،10،11. ولذلك ، فهم PTM الحديث المتبادل هو حاجة ناشئة في البحوث PTM. ومع ذلك ، فإن معظم سير العمل البروتوميكية المتاحة لتحديد وتحديد مواقع PTM تركز على تعديلات مفردة ، بدلاً من التفاعل مع تعديلات متعددة. يرتبط سير العمل الموصوف بتعديل بروتين محدد "النقاط الساخنة" وبقايا الليسين التي يتم تعديلها بواسطة العديد من PTMs المختلفة.
وهناك حاجة متزايدة في الأوساط العلمية إلى أساليب مجدية لدراسة آليات منع البتات المتعددة في وقت واحد12. معظم الأساليب لتحديد وتحديد المواقع على الصعيد العالمي من أنواع متعددة من PTMs هي صعبة بسبب ارتفاع التكاليف وكمية الأنسجة المطلوبة12،13. لا تقتصر تجارب الإثراء متعدد PTM على استهلاك الوقت من حيث إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليل البيانات ، ولكن هذه الدراسات تتطلب عادة كميات كبيرة وباهظة في كثير من الأحيان من البروتين11. وصف هنا هو بروتوكول للتخصيب في وقت واحد وتحليل PTMs متعددة، والذي يعالج أيضا العديد من هذه الحواجز وتمكن على نطاق واسع PTM التنميط وتقييم الكلام المتبادل بين مختلف PTMs14. هذا سير العمل وعاء واحد يحدد طريقة عملية للباحثين في الطب الحيوي لملفات PTMs متعددة على الصعيد العالمي ، وتحديد الببتيدات المعدلة ، ودراسة PTM crosstalk بطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة14،15.
هنا ، يتم عرض هذه الطريقة من خلال فحص الميتوكوندريا بروتين acylation ، الذي درس لأول مرة منذ أكثر من 50 عاما16. وهو يركز على وجه التحديد على أسيتيل الليسين17 والسكسينيل18، بما في ذلك المشاركة في حدوث هذه التعديلات على البروتينات وحتى التعديل المشترك على مستوى الببتيد. وبما أن الدراسة تستخدم نموذج فأرة خروج المغلوب سيرتوين 5 (SIRT5)، فقد تم اختيارها للتركيز على إثراء مواقع الأسيتيل والسكشن. وقد اتخذ هذا القرار لأن مواقع السكسينيل هي أهداف لـ SIRT5 desuccinylase ومن المتوقع بالتالي أن تظهر زيادة كبيرة في فئران KO ، مما يجعلها أكثر PTMs ذات صلة في هذه الحالة. وكلا الأمرين وثيقا الصلة بيولوجياً على النحو الذي لخصه مؤخراً شركة كاريكو وآخرون19. بشكل عام ، يظهر الأسيتيل تأثيرات مهمة على التعبير الجيني والتمثيل الغذائي ، وقد تم الإبلاغ عن السكسينيل لتنظيم استقلاب القلب والوظيفة20.
يمكن تنفيذ البروتوكول الموصوف بكمية منخفضة من مواد مدخلات البروتين (على سبيل المثال، 1 ملغ من البروتين) ويقلل من المدة الإجمالية للتجربة عن طريق تقليل الوقت المستغرق في معالجة العينات، واكتساب التصلب المتعدد، وتحليل البيانات. يتم توفير مخطط سير العمل في الشكل 1. كما استخدمنا كميات أقل من المواد الأولية (وصولاً إلى 100 ميكروغرام من البروتين، مما يقلل من كميات الخرز المستخدمة وفقاً لذلك)، وهو ما يقلل، كما هو متوقع، من الغلة الإجمالية للببتيدات المنجلة المحددة؛ ومع ذلك، فإنه لا يزال يوفر نتائج قيمة للغاية والببتيدات القابلة للقياس الكمي.
في حين أن ما يسمى سير العمل من أعلى إلى أسفل أو من منتصف إلى أسفل عادة لا تستخدم نهج الهضم البروتيني (وبالتالي الحفاظ على اتصال PTMs متعددة داخل بروتين واحد)، وهذا البروتوكول يركز على نهج التخصيب تقارب الببتيد القائم على اكتساب عمق إضافي وحساسية لتحديد PTM والقياس الكمي(الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم سير العمل هذا الببتيد المتمحور حول أساليب قياس الطيف الكتلي الحديثة ، بما في ذلك 1) مزيج من الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) لإنشاء مكتبات طيفية ، و 2) اكتساب مستقل عن البيانات (DIA) للقياس الكمي الدقيق لـ PTM في سير عمل خالٍ من التسمية.
تعمل مهام سير عمل DIA على التغلب على أخذ العينات من مخططات المسح الضوئي النموذجية DDA عن طريق تجزئة جميع إشارات الببتيد بشكل شامل داخل نطاق m/z العينات21. هذه الميزة مفيدة للغاية أيضًا من حيث تعريب الموقع ، لأنه من الأسهل الحصول على معلومات حول أي أي من الأجزاء المحددة يتم تعديلها داخل الببتيد. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح سير عمل DIA بتحديد وقياس كمية أشكال ISOforms PTM-peptide البسيطة مع الأيونات السلائف متطابقة. يمكن لأساليب DIA أيضًا تحديد توطين موقع PTM محدد داخل الببتيد استنادًا إلى أيونات جزء محددة مناظرة يتم قياسها بشكل شامل في جميع الأوقات. ومع ذلك، غالباً ما تستخدم نهج DDA ميزات "الاستبعاد الديناميكي" التي تستبعد أخذ عينات متعددة من MS/MS لنفس الأيون السلائف، وبالتالي فهي تفتقد أشكال الـ PTM الثانوية.
إن استراتيجية الإثراء المتزامن الموصوفة هنا مناسبة بشكل مثالي للدراسات التي ستستفيد من التنميط العالمي والقياس الكمي لـ PTMs متعددة ، وفحص المحادثات المتقاطعة PTM ، وفهم التفاعلات الديناميكية للتعديلات ما بعد الانتقالية. وقد تم وصف تحديد PTMs المخصب متعددة في سير عمل واحد مجتمعة من قبل: الإثراء العالمي أو المسلسل أو الموازي PTM التي تحتوي على الببتيدات البروتينية، أو بدلا من ذلك عن طريق تحليل البروتينات سليمة. في مقارنة مباشرة مع الإثراء التسلسلي للأسيتيل والسكسينيل ، تم تحديد كفاءة منهجية وعاء واحد على أنها مشابهة للغاية14. وتتطلب هذه البروتوكولات البديلة كميات كبيرة من المواد والوقت الأوليين ويمكن أن تكون باهظة التكلفة. وعلى النقيض من ذلك، يوفر بروتوكول الوعاء الواحد طريقة غير مكلفة وفعالة لإثراء أكثر من آلية واحدة للإدارة المؤقتة مع التحليل والتحديد اللاحقين.
يتم الحصول على أنسجة كبد الماوس من الفئران SIRT5 خروج المغلوب وتستخدم هنا كمادة البداية. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول لlysates البروتين من مختلف الأنسجة أو تجارب زراعة الخلايا. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على البروتين اتلاف التي تم الحصول عليها من الأنسجة أو خلايا الكريات الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

دراسة تعديلات متعددة بعد الترجمة (PTMs) من البروتينات هو خطوة حاسمة لفهم PTM الحديث المتبادل والحصول على رؤى أكثر شمولية في وظيفة البروتين. على الرغم من أهمية دراسات الإثراء متعددة PTM، إلا أن القليل من الدراسات تحقق في أكثر من عملية PTM واحدة في وقت واحد، ويرجع ذلك جزئيًا إلى النفقات والوقت وكميات البروتين الكبيرة المطلوبة لإجراء تحليل بروتيوميكي عالمي متعدد لـ PTMs. و "وعاء واحد" التخصيب تقارب مفصلة في هذا البروتوكول يتغلب على هذه الحواجز من خلال السماح في وقت واحد تحديد والقياس الكمي من الببتيدات مع بقايا الليسين التي تحتوي على أسيتيل وPTMs succinylation مع كميات منخفضة من العينة الادخال. البروتوكول ينطوي على إعداد البروتين lysate من أكباد الماوس من الفئران SIRT5 خروج المغلوب، وأداء الهضم التربسين، وإثراء لPTMs، وأداء تحليل الطيف الكتلي باستخدام عملية اقتناء مستقلة عن البيانات (DIA) سير العمل. لأن هذا سير العمل يسمح لإثراء اثنين من PTMs من نفس العينة في وقت واحد، فإنه يوفر أداة عملية لدراسة PTM الحديث المتبادل دون الحاجة إلى كميات كبيرة من العينات، ويقلل كثيرا من الوقت اللازم لإعداد العينة، والبيانات الاستحواذ والتحليل. يوفر مكون DIA لسير العمل معلومات شاملة خاصة بـ PTM. هذا مهم بشكل خاص عند دراسة تعريب موقع PTM ، حيث توفر DIA مجموعات شاملة من الأيونات المجزأة التي يمكن فك تشفيرها حسابيًا للتمييز بين أشكال تعريب PTM المختلفة.

ويبين الشكل 1 رسم تخطيطي عام لسير العمل، بما في ذلك حصاد الأنسجة من كبد الفأرة، واستخدام 1 ملغ من البروتين لهضم البروتين مع التربسين، واحتضان الببتيدات مع الخرز المتجانس للأجسام المضادة، والحصول على العينات على مرض التصلب العصبي المتعدد، وأخيرا ً إجراء تحليل DIA/SWATH للبيانات باستخدام مختلف حزم برامج البروتيوميات الكمية (الأكاديمية والتجارية).
ويبين الشكل 2ألف كيف أن الجدول الزمني لسير العمل وكميات العينة والبروتين المطلوبة، مقارنة بالأساليب البديلة المستخدمة حالياً في دراسات الإثراء المتعددة الآليات والآليات. يمكن تنفيذ طريقة وعاء واحد في نصف الوقت ومع نصف عدد العينات مثل هذه الطرق البديلة. بالمقارنة مع اثنين من طريقة إثراء PTM واحد، بروتوكول وعاء واحد يتطلب أيضا نصف كمية البروتين.
وقد تبين أن هذا البروتوكول بديل عملي وفعال من حيث التكلفة. ويبين الشكل 2باء أن معامل التباين المتوسط (CV) لمناطق الببتيد المعدلة كان أقل في طريقة الوعاء الواحد منه في عمليات التخصيب أحادية التكلفة وسلسلة PTM. ويبين الشكل 2جيم،دال أنه عند مقارنة أساليب التخصيب PTM ذات الوعاء الواحد ووحيدة التخصيب، لم تكن هناك اختلافات ملحوظة بين الارتباطات بين التحديدات الكمية على مستوى الموقع للتعديلات. وينطبق هذا أيضا على الارتباطات على مستوى الببتيد ومستوى الشظايا. ونفس الملاحظة التي أبديت بالنسبة لجميع الارتباطات الثلاثة عند مقارنة التخصيب أحادي الوعاء والمسلسل. تتوفر جميع البيانات الخام الأساسية لـ MS وصحائف نتائج Excel المعالجة المرتبطة بتقرير حديث من قبل Basisty et al.14 ويمكن تنزيلها من MassIVE (MSV00081906) وProteomeXchange (PXD008640).
بشكل عام ، في حين أن استراتيجيات تخصيب الأجسام المضادة قد تظهر بعض القيود ، مثل انسداد الإيتوب المحتمل أو التحديد المحدود ، فإن الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة هي خليط من المستنسخين الذين تم إنشاؤهم بشكل مستقل وبالتالي توفير نطاقات أوسع من الخصائص.
توثق النتائج التجريبية إمكانية اكتشاف وتقييم الكلام المتبادل PTM. يعرض الشكل 3 بيانات من إثراء ناجح ويوضح مثالًا لببتيد يحتوي على تعديلات acyl متعددة ومختلفة تصور PTM crosstalk. الشكل 3A يظهر الببتيد الذي هو أسيتيل على بقايا الليسين واحد وsuccinylated على الآخر، والشكل 3B يظهر نفس الببتيد succinylated في كل من ليسين. وهذا يدل على أنه يمكن تعديل نفس بقايا الليسين مع كل من مجموعات acylation ، وهناك إمكانية للتحدث المتبادل التي تحدث في هذا الموقع. يعرض الشكل 4 عدد مخلفات الليسين التي تم تحديدها كما هو موضح في الأقسام 7.1-7.3 لتنفيذ كلا التعديلين، مشيراً أيضاً إلى احتمال التحدث المتبادل مع PTM.
كما يوضح الشكل 5 ، فإن معالجة مجموعات بيانات DIA PTM مع برنامج البروتيوميات الكمي يسمح لنا بتحديد أي بقايا الليسين محددة يتم تعديلها. هذا هو مفهوم يعرف باسم موقع التعريب ، وهو خطوة أساسية لأي تحليل لتحديد PTM ممكن. ويعرض الشكل 5 شكلين محتملين من أشكال الايزوما جنبا إلى جنب مع الإيونات المؤكدة والفندية لكل منها التي يمكن تصورها وتقييمها على النحو المبين في الفرعين 8-1-8-3 (الخطوتان 8-3-2 و8-3-3 على وجه التحديد). وبناء على هذه المعلومات، تمكنا من تحديد أي من الايزوالأشكال كان موجودا ً في العينة الأصلية بثقة. يوضح طيف MS/MS من KQYGEAFEKacR المؤكد أن الأيونات y (y2-y5)التي تحتوي على بقايا الأسيتيل ليسين ، والتي تحولت بمقدار 42 م / ز (كتلة الزيادة لمجموعة أسيتيل) ، أكدت بقايا الليسين المحددة في الببتيد الذي تم تعديله.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> الشكل 1: سير العمل النموذجي لإثراء وعاء واحد من PTMs. يتم حصاد الأنسجة (هنا ، الكبد) من SIRT5 KO والفئران البرية من النوع (WT) ، ويتم تحليل البروتينات ، وهضم التربسين إلى الببتيدات ، وإزالة الملح. ثم يتم إثراء الببتيدات عن طريق التقارب المناعي مع مجموعات من حبات السوتشينيل والأسيتيل الأجسام المضادة. يقيس سير العمل المتوازي MS كلاً من 1) aliquots الصغيرة من التغيرات في التعبير البروتيني الكامل (لتطبيع البروتين) و2) الببتيدات المحتوية على الأسيل لتحديد موقع acylation (DDA-MS) وتوطين الموقع، تليها القياس الكمي (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> الشكل 2: مقارنة سير العمل ذو الوعاء الواحد مع الأساليب البديلة. (أ)مقارنة الوقت والتكاليف والمواد اللازمة لسير العمل ذي الوعاء الواحد، والإثراء التسلسلي لـ PTM، واثنين من عمليات التخصيب أحادية التكلفة. (ب)مقارنة السير الذاتية بين سير العمل واحد وعاء، واحد أسيتيل ليسين PTM الإثراء، وواحد succinyl-lysine PTM الإثراء. تحليل ارتباط سبيرمان مقارنة المناطق ذروة الببتيد acyl التي تم الحصول عليها من سير العمل وعاء واحد، وإثراء PTM واحد: المؤامرات المقابلة لنتائج منطقة الذروة log2 لمواقع(C)أسيتيل و(D)مواقع succinylation. ويشار إلى منحدرات الانحدار وعوامل الارتباط في الألواح الفردية14. وتمت معالجة اثنين من اليكررات البيولوجية المستقلة لكل من الشروط. وقد تم تعديل هذا الرقم من Basisty وآخرون14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> الشكل 3: التحادث المتبادل بين التعديلات الاسيتلاب والسكسينيل من بقايا الليسين. أطياف MS / MS من الببتيدات التربيك من الميتوكوندريا 3-ketoacyl-CoA thiolase التي تظهر نفس تسلسل الأحماض الأمينية ولكن تم تعديلها في اثنين من بقايا الليسين مع PTMs مختلفة. (A)MS / MS من الببتيد AANAGyfNEEMAPيفKsuccT KacK و (B)MS / MS من الببتيد AANAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. وقد تم تعديل هذا الرقم من Basisty وآخرون14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> الشكل 4: التداخل والكلام المتبادل بين بقايا الليسين الأسيتيل وsuccinylated - أمثلة محددة في مجمعات البروتين. (A)مخطط فين عرض التداخل بين 2,235 أسيتيل و 2,173 مواقع succinylation. ومن بين هذه المواقع، كان هناك 943 موقعا ً مُسِلة ومُستشِفة على حد سواء. تم تحليل الكبد من SIRT5 (دي succinylase) الماوس بالضربة القاضية، وتم تحديد العديد من مواقع الستشينيليشن. في الواقع ، كانت أكثر وفرة مما لوحظ عادة في كبد الماوس (تمت تصفية الببتيدات المعدلة بقيمة Q قدرها < 0.05). (ب)مجمعات البروتين التي تبين النسبة المئوية لوحداتها الفرعية التي تحتوي على مواقع الأسيتيل والمستهين (الخط الأحمر الجريء يمثل الأهمية كما يحددها اختبار فيشر الدقيق). (C)رسم تخطيطي لمجمع ATP synthase: وحدات البروتين الفرعية باللون الأحمر تصور الوحدات الفرعية التي تحتوي على كل من المواقع الأسيتيلة والمستوفية. وقد تم تعديل هذا الرقم من Basisty وآخرون14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> الشكل 5: برنامج البروتيوميات الكمي يفك شفرة توطين موقع الببتيد من PTMs. بناءعلى MS / MS تجزئة الببتيد، فمن الممكن لتوفير معلومات حول بقايا الليسين محددة مجموعة أسيتيل هو تعديل. هذا يعرض قدرة البرنامج على تقديم معلومات قيمة عن موقع توطين PTMs.(A)احتمالين لتعديل بقايا الليسين وتوطين موقع PTM: KQYGEAFEKacR (يسار) وKacQYGEAFEKR (يمين). يتم عرض "تأكيد" و "دحض" الأيونات جزء لكل من isoforms موقع التعريب المحتملة من الببتيد. وبناء على هذه المعلومات، يتم تعيين تأكيد الدرجات ودحض الدرجات، مما يؤكد وجود شهادة KQYGEAFEKacR في العينة. (ب)طيف MS/MS المطابق لمعيار الايزوفورم المؤكد KQYGEAFEKacR الذي يشير إلى أن جميع الأيونات y بما في ذلك بقايا الأسيتيل ليسين (y2 وأعلى) تحمل كتلة زيادة قدرها +42 م/ز، وهو ما يتوافق مع تعديل الأسيتيل. لا تحتوي الأيونات الملاحظة ب على التعديل. (C)استخراج الكروماتوغرام أيون (XIC) مع مناطق الذروة وفيرة الناتجة عن y2 و y3 الأيونات، وكلاهما تشكل موقع أسيتيل في وأكد isoform KQYGEAFEKacR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

يصف سير العمل هذا أداء الإثراء الفعال للوقت والتكلفة للتعديلات المتعددة للبروتين بعد الترجمة (PTMs) في وقت واحد للتحليل الكمي العالمي للبروتيوميات. يستخدم البروتوكول تخصيب PTM على مستوى الببتيد مع أجسام مضادة مترافقة متعددة ، يليه تحليل قياس الطيف الكتلي للاستحواذ المستقل عن البيانات للحصول على رؤى بيولوجية في الكلام المتبادل PTM.

إثراء التقارب المتزامن لتعديلات ما بعد الترجمة للقياس الكمي وتوطين الموقع

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

يصف هذا البروتوكول تقنية جديدة للإثراء المتزامن لـ PTMs متعددة مع الأجسام المضادة متبوعة بتحليل مستقل لقياس الطيف الكتلي للاكتساب للحصول على رؤية بيولوجية في توطين الموقع والتحدّث المتبادل. هذا هو الوقت وتقنية فعالة من حيث التكلفة التي تمكن من تحديد في وقت واحد والكمية من الببتيدات مع تشريح تحتوي على أسيتيل وPTMS succinylation مع كميات صغيرة فقط من مدخلات العينة. يعد تتبع التعديلات اللاحقة للترجمة خطوة مهمة في وصف ومكافحة حالات الأمراض المختلفة.نحن ندرك بالفعل أن بعض أنواع السرطان والسكري تخضع لتنظيمات عالية من خلال هذه التعديلات البروتينية. يمكن أن تنطبق هذه الطريقة نظريًا على أي PTMs مع الأجسام المضادة للإثراء مثل في كل مكان والفوسفور وغيرها. ويمكن أن تنطبق أيضا على أنواع الأنسجة الأخرى أو نماذج ثقافة الخلية.مفتاح الحصول على بيانات قيمة باستخدام هذه التقنية هو إعادة التكرار. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ضمان تنفيذ جميع الخطوات بعناية فائقة وخاصة الخطوات التي تنطوي على حبات الأجسام المضادة. للبدء، والحصول على خراطيش تحتوي على الراتنج C18 التي تجمع ما يصل إلى 10 ملليغرام من البروتين.تناسب هذه الخراطيش في جهاز فراغ. إضافة 800 ميكرولترات من 80٪ الأسيتونتريل و 0.2٪ حمض فليك إلى خراطيش مع 19.8٪ الماء وبدء شفط فراغ لسحب السائل من خلال. كرر هذه الخطوة مرة واحدة تجنب تجفيف الخراطيش تماما.اكويبيل الخراطيش بإضافة 800 ميكرولترات من حمض 0.2٪ في الماء مع شفط الفراغ. كرر هذا مرتين. تحميل واحد ملغم الببتيدات في حوالي 1، 000 ميكرولتر حل على الخراطيش مع شفط الفراغ.غسل الببتيدات مرتين مع 800 ميكرولترات من 0.2٪ حمض ففورميك في الماء تحت شفط فراغ. ثم ترتيب 1.5 ملليلتر أنابيب microcentuge تحت كل خرطوشة لجمع الببتيد. تحت شفط فراغ, الببتيدات من الخراطيش أولا مع 800 ميكرولتر من 80٪ الأسيتونتريل و 0.2٪ حمض ففورميك في 19.8٪ الماء ثم مع 400 ميكرولترات من نفس الحل.جفف عينات الببتيد المزيلة تمامًا في مكثفة فراغ لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. الآن، resuspend الببتيدات المجففة في 1.4 ملليلتر من الباردة 1X من 1X من الناحية المناعية تنقية العازلة. دوامة لخلط وضمان وجود ما يقرب من 7أجهزة الطرد المركزي العينات في 10،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بيليه صغيرة تظهر. وضع الببتيدات جانبا على الجليد أثناء إعداد حبات الأجسام المضادة.إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني 1X الباردة إلى أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من K-أسيتيل الطين الخرز الجسم المضاد وأنبوب يحتوي على 100 ميكرولترات من K-succinyl حبة الجسم الضد الطين ومزيج عن طريق pipetting. نقل الحل بأكمله إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر وتدور في جهاز طرد مركزي مصغرة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. التعرق برنامج تلفزيوني مع الحرص على تجنب الطامح قبالة أي حبات.كرر غسل ثلاث مرات إضافية. المقبل ، resuspend الخرز في حوالي 440 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني. الماصات الخرز عدة مرات لخلط جيدا.مع 200 نصائح قبل قص ميكرولتر، نقل 100 ميكرولترات من كل حبات الأجسام المضادة أسيتيليسين وحبات الأجسام المضادة succinyllysine في أنبوب جديد. تدور لأسفل لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي مصغر وpirate قبالة وسائل الإعلام مع تلميح محمل هلام. الخرز الآن تتحول إلى اللون الأبيض.Pipette الببتيد resuspended مباشرة على الخرز غسلها واحتضان الببتيدات مع الخرز في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الانفعالات. في الصباح، تدور عينات الببتيد في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية. قم بإزالة الببتيدات غير المنضمة فائقة وحفظها للتجارب المستقبلية إذا رغبت في ذلك.إضافة ملليلتر واحد من الباردة 1X من 1X مناعي تنقية العازلة إلى الخرز لغسل وخلط عن طريق عكس خمس مرات. تدور في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية. التبخر قبالة محلول تنقية المناعة اللانهاية وتكرار تطهير المناعة خطوة واحدة أكثر مرة أخرى.ثم إضافة ملليلتر واحد من المياه الباردة HPLC إلى الخرز ومزيج عن طريق عكس خمس مرات. تدور في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية. التعرق قبالة الماء وتكرار المياه غسل الخطوة مرتين إضافية.تدور مرة إضافية في 2،000 مرات ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية لجمع أي ماء المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب. مع نصائح تحميل هلام مسطحة يميل، الطامح قبالة أي المياه الإضافية التي جمعت. كن حذرا لتجنب التعرق الخرز.إضافة 55 ميكرولترات من 0.15٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك في الماء إلى الخرز. احتضان الخرز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في حين التنصت في بعض الأحيان الجزء السفلي من الأنبوب لخلط. تدور الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي مصغر.استخدام رأس مسطحة يميل تحميل تلميح لنقل الببتيدات eluted في أنبوب جديد. إضافة 45 ميكرولترات من 0.15٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك في الماء إلى الخرز. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء النقر على الجزء السفلي من الأنبوب في بعض الأحيان لخلط.تدور الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية في جهاز الطرد المركزي مصغرة. إزالة elution الثاني باستخدام مسطحة يميل هلام تحميل تلميح والجمع بين ذلك مع elution الأول. تدور الببتيدات المائل مجتمعة في 12، 000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى بيليه أي الخرز التي تحمل أكثر.نقل حل عينة الببتيد إلى أنبوب 500 ميكرولتر جديد. بناء طريقة التحميل لتحميل خليط الببتيد المخصب على رقاقة C18 قبل العمود وseded والببتيدات مرة أخرى عن طريق غسل مع المرحلة المتنقلة A في اثنين microliters في الدقيقة لمدة 10 دقيقة. بناء أسلوب الكروماتوغرافيا بحيث يتم نقل الببتيدات إلى عمود تحليلي و elute بمعدل تدفق 300 نانولتر في الدقيقة مع تدرج من ساعتين إلى ثلاث ساعات باستخدام مراحل المحمول A و B.على وجه التحديد، واستخدام التدرج الخطي من 5٪ المتنقلة المرحلة باء إلى 35٪ المرحلة المتنقلة B أكثر من 80 دقيقة.في وقت لاحق، المنحدر المرحلة باء المحمول إلى 80٪ على مدى خمس دقائق ثم عقد في 80٪ B لمدة ثماني دقائق قبل العودة إلى 5٪ B لإعادة التوازن لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك، قم بإنشاء طريقة أداة MS للحصول على بيانات تعتمد على. لتجربة واحدة، قم بإعداد فحص أيونات السلائف MS1 من M/Z 400 إلى 1,500.تعيين المدة إلى 120 دقيقة. إنشاء تجربة IDA وانقر فوق موافق. تحت علامة التبويب معايير التبديل، تعيين عتبة كثافة لتشغيل MS / MS بمسح أيونات من الحالات المشحونة بين اثنين إلى خمسة إلى 200 العد في الثانية. تعيين استبعاد دينامية من الأيونات السلائف إلى 60 ثانية.لتجربة اثنين، تعيين فحص أيون المنتج MS/MS مع نطاق تفحص MS2 من M/Z 100 إلى 1، 500. انقر فوق تعديل المعلمات وتعيين انتشار الطاقة الاصطدام إلى خمسة وحدد وضع المسح الضوئي للمنتج حساسية عالية أيون. وأخيراً، ضع العينة في الاختزال التلقائي.إرسال قائمة الانتظار عينة وبدء LC-MS / MS أساليب الاستحواذ بناء أسلوب أداة MS للحصول على البيانات المستقلة وتحديد تجربتين مسح الصك. إجراء المسح الضوئي السلائف إم اس 1 ايون من 400 إلى 1، 250 كتلة لتوجيه الاتهام وتعيين المدة إلى 120 دقيقة. تعيين الطاقة الاصطدام انتشار إلى 10 وتراكم الوقت إلى 45 مللي ثانية ثم حدد وضع المسح الضوئي للمنتج حساسية عالية.بعد ذلك، استيراد ملف نصي يحتوي على 64 متغير إطار نظام الحصول على DIA برقة لملء إطاري الاستحواذ على مساحة في الأسلوب. في مخطط الاستحواذ هذا، يتم تمرير النوافذ المتغيرة التي تتراوح بين خمسة إلى 90 كتلة إلى تهمة وعرض في خطوات تدريجية على نطاق كتلة كاملة من 400 إلى 1، 250 كتلة لتوجيه الاتهام مع ما مجموعه 64 قطعة رقعة كل مع 45 مللي ثانية وقت التراكم. ضبط الوقت تراكم MS1 إلى 0.25 ثانية.معا، وتفحص MS1 و 64 MS2 المسح الضوئي يجب أن تسفر الآن عن دورة الوقت الكلي من 3.2 ثانية. في هذه الدراسة، وثقت النتائج التجريبية إمكانية الكشف عن وتقييم PTM عبر الحديث. يوضح هذا الجدول كيفية الجدول الزمني لسير العمل وكميات العينة والبروتين المطلوبة.يمكن تنفيذ طريقة وعاء واحد في نصف الوقت مع نصف عدد العينات مثل هذه الطرق البديلة. وكان متوسط معامل التغير في مناطق الببتيد المعدلة أقل في طريقة الوعاء الواحد منه في إثراء PTM والمسلسل. وفي حين أن المقارنة بين الأساليب الوحيدة لإثراء الـ PTM ذات الوعاء الواحد وطرق إثراء PTM الوحيدة، لم تكن هناك اختلافات ملحوظة بين الارتباطات بين القياس الكمي على مستوى الموقع بالنسبة للتعديلين.يعرض هذا الرقم بيانات من إثراء ناجح ويوضح مثالاً للببتيد الذي يحتوي على تعديلات acyl متعددة ومختلفة تصور PTM عبر الكلام. الببتيد كان أسيتيلات على بقايا ليسين واحدة وsuccilynated على الآخر بينما هنا كان نفس الببتيد succilynated في كل من ليسين. وهذا يدل على أن نفس بقايا ليسين يمكن تعديلها مع كل من مجموعات acylation وهناك إمكانية للتحدث المتبادل التي تحدث في هذا الموقع.من الضروري التأكد من أن كل عينة تحتوي على نفس الكمية من الخرز وتأكد من أن أيا من الخرز يستنشق بطريق الخطأ عند غسل الخرز السندات الببتيد. يتم تنفيذ التحليل القائم على القياس الطيفي الشامل وتحليل البيانات في أدوات البرامج مثل Spectronaut بعد هذا الإجراء لتحديد وتحديد وتنفيذ توطين الموقع لـ PTMs. هذا العمل اكتساب مستقلة عن البيانات في تركيبة مع إثراء PTM المتزامنة ستفتح السبل لتقييم أكثر كفاءة PTM عبر الحديث وتقديم رؤى أفضل في أهمية PTM الإشارات.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

مبادئ في مواقع محددة التكنولوجيا (SSR) Recombinase

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

متغايرة النوى وتقنيات لتحليل نوع من الترجمة الخاصة الخليوي

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...