Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
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我们感谢 NIH 对巴克研究所 （1S10 OD016281） 的 TripleTOF 系统共享仪器支持。这项工作还得到了国家过敏和传染病研究所（R01 AI108255 至 B.S.）和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（R24 DK0085610 至 Eric Verdin）的支持;R01 DK090242 给埃里克·戈茨曼）。X.X.得到国家卫生研究院（NIH赠款T32GM8806，给朱迪思·坎皮西和丽莎·埃勒比）的资助，N.B.得到了格伦医学研究基金会的博士后奖学金的支持。

协议中描述的所有实验都遵循巴克研究所机构动物研究委员会的指导方针。
1. 从均质组织中提取蛋白质，用蛋白酶消化
<ol><li>用HPLC级水将溶酶缓冲液制备至最终浓度为8M尿素、50mM三乙酸碳化合物（TEAB）、1μM三氯苯甲酸酯A（TSA）、20mM烟酰胺、75 mM氯化钠（NaCl）、1x蛋白酶/磷酸酯抑制剂（PIC）等。</li>
	<li>将一个无菌钢珠添加到与珠磨均质器兼容的 2 mL 管中，然后将组织件（豌豆大小）放入管中。加入莱沙缓冲液（500 μL）和涡旋，以确保缓冲液覆盖组织片（如有必要，添加更多的莱沙缓冲液）。将管放在预冷却适配器组上，确保管在均质器的两个适配器之间平衡。</li>
	<li>在 25 Hz 下对样本进行均质化，在 4°C 下各进行 3 分钟。如果组织未完全均质，则短暂旋转管并将均质液化转移到新标记的 1.5 mL 管中。然后，向剩余的组织片中添加额外的分解缓冲液，并在25 Hz处重复均质2x，每次3分钟。两轮同质化通常足以分解组织。</li>
	<li>用钳子拆下金属珠。在每个样品之间，再次用HPLC级水、HPLC级甲醇和HPLC级水冲洗钳子。</li>
	<li>如果应用两轮均质化，将均质分解物与超声波样品结合，在30s开/30度关闭时使用超声波，在高功率下进行4°C。</li>
	<li>在4°C下在14，000 x g下将均质化的莱萨为10分钟，以清除莱沙。将上清液（清除的落乳液）转移到新的 1.5 mL 微离心管中，避免任何可能位于上清液顶部的脂肪层和管底部的任何碎屑。</li>
	<li>执行双辛辛酸 （BCA） 测定，以适当稀释（例如，1：20 和/或 1：200）测量已清除的莱沙溶液的蛋白质浓度。根据BCA结果，每个样品中的蛋白质分量为1毫克。</li>
	<li>在37°C下减少4.5 mM二硫二醇（DTT）中的蛋白质30分钟，在1，400rpm时搅拌。随后，在室温（RT）下在黑暗中（放在抽屉或柜子里）孵育10m碘乙酰胺（IAA）中的烷基蛋白。" 注： 可使用替代试剂，如 N-乙酰胺 （NEM），而不是 IAA。</li>
	<li>在样品中加入50 mM TEAB，将尿素浓度稀释至2 M以下。以1：50（胰蛋白酶与蛋白质，wt/wt）的比例将胰蛋白酶加入每个样品中，并在37°C（约14-16小时）内通过搅拌消化蛋白质。</li>
	<li>用10%的甲酸淬火消化液，第二天达到1%的甲酸。涡旋和旋转短暂。将样品的1μL点到pH条上，以确保文摘为pH = 2-3。在 RT 下以 1，800 x g的离心样品 15 分钟，以颗粒任何不溶性材料。</li>
</ol>2. 通过大规模固相萃取对非富集蛋白解酶肽进行脱盐
<ol><li>获得含有C18树脂的墨盒，可结合多达10毫克的蛋白质。将这些墨盒安装到真空设备中，以便使用真空吸气器，在以下步骤中将液体拉入墨盒。为每个肽样品指定一个墨盒。</li>
	<li>在 19.8% 水的墨盒中加入 800 μL 的 80% 醋酸 （ACN） 中，并使用真空吸液将液体拉过。重复此步骤 1x，避免墨盒完全干燥。</li>
	<li>通过在水中加入 800 μL 的 0.2% 的甲酸，通过真空吸力来平衡滤芯，从而将整个体积拉过过滤器。重复此 2 次。通过真空吸气将肽加载到墨盒上。在真空吸水下用800μL的0.2%的甲酸在水中清洗肽2x。</li>
	<li>在每个墨盒下方排列 1.5 mL 微离心管，在最后一步收集肽脱脂。在真空吸空的盒内肽下，先用800μL的80%ACN在0.2%的甲酸和19.8%的水中，然后用400μL的相同溶液。在真空集中器（2-3 小时）中完全干燥脱盐肽样品。</li>
</ol>3. 与免疫亲和力珠同时富集K-乙酰化和K-琥珀化肽
<ol><li>在1.4 mL的冷1x免疫亲和纯化（IAP）缓冲液中重新悬浮干肽。涡旋混合，并确保pH为+7。在4°C下，在10，000 x g下进行10分钟的离心样品。可能会出现小颗粒。</li>
	<li>在准备抗体珠时，将肽放在冰上。在K-乙酰管和K-uccinyl抗体珠浆管（体积：每管浆料100μL）中，加入1 mL的冷1x磷酸盐缓冲盐水（PBS），并通过移液混合。将整个溶液转移到新的1.5 mL管中，在微型离心机中旋转30s在RT。</li>
	<li>吸气，小心避免吸走任何珠子。重复洗涤3次，再次洗涤1 mL的冷1xPBS，离心30s在RT和吸气PBS。</li>
	<li>在约 440 μL 的 PBS 中重新悬浮珠子。每个 PTM 管中的珠数的四分之一（制造商提供的 100 μL）用于一罐浓缩（K-乙酰和 K-uccinyl 抗体珠的每个固定抗体约 62.5 μg）。将珠子移入几次，以混合良好。去除100 μL的乙酰-流氨酸抗体珠，并转移到一个管与200μL预切尖端，确保主混合物保持一致良好混合。</li>
	<li>对uccinyl-lysine抗体珠同样，将100 μL的苏锡林酸抗体珠到管中，达到乙酰-利氨酸抗体的相等部分，并在每个管中加入羟基-利氨酸抗体。在微型离心机中旋转 30 s，用凝胶装载机尖端吸出介质（珠子将变为白色）。 注：每个管子的底部应该有一个类似的珠子颗粒。</li>
	<li>将重新悬浮的肽直接移至洗涤的珠子上。小心避免任何颗粒（快速添加以避免珠子干燥）。在4°C处用珠子在4°C过夜，搅拌。</li>
</ol>4. 与抗体珠结合的肽的洗脱
<ol><li>在4°C下以2，000 x g旋转肽样品30s。取出含有未结合肽的上清液，并保存以供将来进行实验（ 如果需要）。将 1 mL 的冷 1x IAP 缓冲液添加到珠子中，通过反转 5 倍进行洗涤和混合。在 4 °C 下以 2，000 x g旋转 30 s。吸出 IAP 解决方案，重复 IAP 洗涤步骤 1x，共两次洗涤。</li>
	<li>将 1 mL 的冷 HPLC 水加入珠子中，然后倒置 5 倍进行混合。在 4 °C 下以 2，000 x g旋转 30 s。吸出水面。重复洗水步骤两次，共洗三次。在 2，000 x g下，在 4°C 下额外旋转 30 秒，以收集管底中剩余的水。吸出任何可能用平尖凝胶装载技巧收集的额外的水。小心避免吸气珠子。</li>
	<li>在水中加入55μL的0.15%三氟乙酸到珠子中。在 RT 孵育珠子 10 分钟，偶尔敲击管底进行混合。在微型离心机中旋转 RT 的珠子 30 s。取出洗脱的肽，并使用平尖凝胶加载尖端放在一边。</li>
	<li>在水中向珠子中加入45μL的0.15%三氟乙酸。在 RT 孵育 10 分钟，同时偶尔敲击管的底部进行混合。在微型离心机中旋转 RT 的珠子 30 s。使用平尖凝胶加载尖端去除第二个洗脱液，并与第一个洗脱结合。</li>
	<li>在 RT 处将组合的洗脱肽在 12，000 x g下旋转 5 分钟，以颗粒携带的任何珠子。将肽样品溶液转移到新的500μL管中。 注： 可以在此处暂停该协议。</li>
</ol>5. 富集肽的脱盐
注： 样品的pH值应小于4，以便与含有C18树脂的尖端进行最佳结合。使用含有 0.6 μL C18 树脂的 10 μL 移液器尖端和 10 μL 移液器来控制吸头。
<ol><li>通过将 10 μL 的醋酸酯移入尖端，预湿 C18 尖端。将醋酸酯放入废物中。重复此步骤两次。</li>
	<li>在水中用10μL的0.2%的甲酸洗涤3次，使尖端平衡。每次平衡后，将溶液放入废物中。</li>
	<li>通过连续移液和用尖端分配浓缩肽样品，将样品中的肽加载到尖端上。上下反复移液至少20次，从尖端中分配剩余的溶液。</li>
	<li>用水中含有10μL0.2%的甲酸清洗含有结合肽的尖端。将溶液分配成废物。重复此步骤 9 倍。</li>
	<li>使用含有0.2%甲酸、50%醋酸和49.8%水的洗脱缓冲液将埃卢特肽放入新管中。在新管15倍内反复移液和分配10μL溶液。使用额外的 10 μL 洗脱缓冲液重复此步骤，重复移液到与前一个洗脱相同的管中。</li>
	<li>完全在真空浓缩器中干燥肽（约 20 分钟）。将干肽重新悬浮在水中0.2%的甲酸适量中。 注： 可以在此处暂停该协议。</li>
</ol>6. 使用 DDA 和 DIA 进行数据采集
注：使用 DDA 和 DIA LC-MS/MS 方法分析样品，可根据可用的质谱仪器进行调整。在这里，使用纳米LC 2D HPLC系统与高分辨率质谱仪耦合对样品进行分析。
<ol><li>使用 HPLC 系统与直接连接到质谱仪的基于芯片的平台 HPLC 系统结合使用（也可以使用许多 LC-MS 配置和系统）。</li>
	<li>使用反向相HPLC-ESI-MS/MS分析样品<ol>
<li>注射后，将肽混合物转移到C18预列芯片上，用移动相A以2μL/min洗涤，10分钟脱盐。然后，使用移动相A和B，将肽转移到分析柱中，以300 nL/min的流速以2-3小时梯度排空。 具体来说，在80分钟内使用从5%移动阶段B到35%移动阶段B的线性梯度。</li>
		<li>随后，在 5 分钟内将移动阶段 B 提升到 80%，然后在 80% B 保持 8 分钟，然后返回到 5% B 进行 25 分钟的重新平衡。</li>
	</ol>
</li>
	<li>为DDA构建MS仪器方法，并定义以下仪器扫描实验<ol>
<li>实验1：MS1前体ionion扫描从m/z 400-1，500（积累时间为250ms）。设置强度阈值以触发电荷状态离子 2-5 到 200 计数的 MS/MS 扫描。将前体离子的动态排除设置为 60 s。</li>
		<li>实验2：MS/MS产品ion扫描，MS2扫描范围从m/z 100-1，500（每30个产品ion扫描每周期100ms的累积时间）。将碰撞能量分布设置为 CES = 5，然后选择"高灵敏度产品电流传模式"。 注：DDA 方法将在每个周期的 MS1 扫描后为 30 个最丰富的前体离子获取 MS/MS 光谱，总周期时间为 ±3.3s。</li>
	</ol>
</li>
	<li>为DIA构建MS仪器方法，并定义以下仪器扫描实验。<ol>
<li>实验1：从m/z 400-1，250执行MS1前体ion扫描（累积时间为250ms）。</li>
		<li>实验2：对64个可变SWATH段进行MS/MS产品ion扫描，MS2扫描范围从m/z 100-1，500（每64个产品每周期扫描45ms）。将碰撞能量分布设置为 CES = 10，然后选择"高灵敏度产品电流传扫描模式"。</li>
		<li>使用 Schilling 等人22所述的 64 个可变窗口 DIA/SWATH 采集策略获得无标签量化，总周期时间为 ±3.2 s。 简单地说，在此采集中，Q1 四极杆将窄质量范围传输到碰撞单元，而是以增量步骤在全质量范围内（m/z 400 -1，250，64 SWATH 段）以增量步骤传递可变窗口宽度（5-90 m/z），每个段的累积时间为 45 ms，周期时间为 3.2 s，其中包括一个 MS1 扫描250 ms 累积时间）。 注： 可变窗口宽度根据使用可变窗口计算器算法22在特定 m/z 范围内观察到的典型 MS1 离子电流的复杂性进行调整（在"忙"m/z 范围内选择更窄的窗口，在 m/z 范围内选择宽窗口，很少去向前体离子。在其他 MS 仪器平台上，可以实施其他 DIA 窗口策略。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 数据分析
注： 某些数据分析设置应更改并针对特定实验进行定制。例如，选择的蛋白质数据库（FASTA 文件）取决于制备样品的物种（此处为Musmusculus）。下面介绍了浓缩为乙酰亚比和琥珀化物肽的小鼠样品的数据分析。
<ol><li>使用 MS 数据库搜索引擎分析 DDA 采集。创建数据库搜索引擎方法，如下所示：<ol>
<li>对于样本描述参数：选择"在样本类型下识别"，在"半胱氨酸醇酸"下选择"碘化酸"，在"消化"下选择"胰蛋白酶"（假设裂解和精氨酸的C端裂解），在仪器下选择"三重TOF 6600"，在特殊因素下，检查乙酰化强调和苏奇尼化富化，并在"物种"下选择肌肉。</li>
		<li>对于特定处理参数：在 ID 焦点下选择"生物修改"，在数据库下选择"SwissProt"，在搜索努力下选中"彻底 ID"，在"检测到的蛋白质阈值"下选择"0.05 （10%）"，并在"结果质量"下选中"运行错误发现率分析"。保存搜索引擎方法，并提交质谱原始文件，供数据库搜索引擎使用生成的方法处理。 注： 在迭代过程中，搜索引擎会根据初始注释和结果自动重新校准所有 MS 和 MS/MS 扫描。</li>
	</ol></li>
	<li>在完成搜索后，点击"导出肽摘要"，在电子表格软件中按 99 的"置信阈值"筛选所有肽识别结果（例如 Excel;错误发现率 [FDR] 1%）。</li>
	<li>在"肽摘要"电子表格文件中，过滤在修改栏中包含PTM注释"乙酰化"和"渗化"的所有肽，以生成结果报告，专门呈现青化肽及其相应的蛋白质。</li>
	<li>要构建 MS/MS 光谱库，以便进一步处理 DIA 原始文件和进一步的相对定量，打开 DIA 定量分析软件。选择"库"选项卡，然后（在页面底部）单击"数据库搜索引擎"中的"生成光谱库"，然后打开数据库搜索引擎FDR 报告（#FDR.xlsx 文件），该报表作为 DDA 原始数据库搜索过程的一部分自动生成。然后，单击"下一个"并选择"库设置架构"和"下一个"。选择"Uniprot_mouse_proteome"作为数据库，然后单击"下一个"和"goa_mouse"作为基因注释（本体）文件。最后，单击"完成"，将生成光谱库。 注：有关DDA原始数据文件中的乙酰化肽和琥珀化肽的信息、MS1的前体扫描以及MS2的片段子扫描将包含在光谱库中（包括保留时间、MS/MS碎片模式等）。</li>
	<li>使用DIA定量蛋白质组分析软件对乙酰化水平和渗出水平进行相对定量，并创建可用于进一步数据分析的候选PTM肽的电子表格。<ol>
<li>要分析和量化含有 PTM 的肽，请打开 DIA 定量分析软件，使用模板分析架构。通过选择"设置透视"选项，软件中提供了模板架构 |"DIA分析" |"BGS PTM"（显著或稀疏，取决于实验）。 注：无需在 DIA 定量分析软件中使用 BGS PTM 分析模板，还可以按照以下说明手动设置所有 PTM 特定设置：1）在"识别"下，选择"PTM 本地化"（概率截止 = 0.75）;2）在"量化"中，选择"小肽分组" |"修改顺序";3）在"后分析"下，选择"差异丰度分组" |"次要组"（量化设置）。这些设置将激活 PTM 定位功能，以便修改后的肽作为单个条目列出，并在肽级别执行差分分析。</li>
		<li>要启动量化分析，请选择"管道"选项卡，然后单击"从文件中设置 DIA 分析"，打开感兴趣的 MS DIA 原始文件进行相对量化。选择"分配光谱库"并选择上面构建的库，单击"加载" |"下一个"。选择"BGS PTM"分析架构，然后单击"下一步"。选择适当的数据库 FASTA 文件"Uniprot_mouse_proteome"|"下一个"。定义条件设置，为示例分配不同的条件，然后单击"下一步"。选择"goa_mouse"作为基因注释（本体）文件，然后单击"下一个"。查看分析概述（实验设置摘要）并选择"输出目录" |"完成"。最后，单击"运行管道"执行无标签定量分析。 注：DIA定量分析软件中的统计模块自动执行 FDR 分析，生成热图和火山图，比较不同条件，生成已识别和定量的肽和蛋白质列表，并提供Q 值以及比较不同条件的相对折叠变化。</li>
	</ol></li>
	<li>作为替代方案，在导出乙酰化位和渗化位点提取的峰值区域后，使用软件去除DIA数据集的干扰，以处理数据并执行统计分析。</li>
</ol>8. 修改肽的数据可视化和PTM站点本地化评估
<ol><li>要打开生成的 DIA 定量分析，请选择"分析"选项卡，然后"加载定量分析软件实验"（从保存的实验打开 *。SNE 文件）。导航到 *SNE 结果文件并选择"打开"。</li>
	<li>在左侧面板中，单击第三个原始数据左侧的箭头 *.wiff 文件，从顶部展开和可视化所有 64 个 SWATH 段。单击段左侧的箭头 [428.7-437.3] 以展开特定段并显示为此质量范围标识的改良肽。单击三联肽 KQYGEAFEK[乙酰]R。 注： 默认情况下，右上面板通常显示 MS2 XIC，下面板显示 MS1 同位素包络 XIC<ol>
<li>在上部面板中，选择"PTM 本地化图"。在下面板中，选择"PTM 本地化图"。</li>
		<li>在 PTM 本地化图中，选择顶部肽序列"KQYGEAFEK_乙酰+R"，总 PTM 本地化分数为 18.32。单击左侧的箭头以展开视图并可视化确认和反驳离子。单击"确认离子"旁边的箭头，然后选择离子"y3 [42]"以突出显示该特定离子，这确认乙酰化位点位于肽序列的 K2 上。</li>
		<li>在 PTM 本地化图中选择第二个肽序列"K_乙酰_QYGEAFEKR"，总（非常低）PTM 本地化分数为 1。单击左侧的箭头以展开视图并可视化确认和反驳离子。单击"确认离子"旁边的箭头，然后在"反驳离子"旁边的箭头上，然后选择一些片段离子来可视化和评估提取的离子色谱图和 MS/MS 光谱（图 5）。 注： 分配的 PTM 定位分数和目视检查表明，正确的 PTM 等体是 KQYGEAFEK_乙酰+R，而其他可能的 PTM 等分体 K_乙酰_QYGEAFEKR 没有或最小证据。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. 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W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

该协议描述了一种同时进行多个 PTM 扩充的新技术，以更有效地理解 PTM 串扰。实现这个目标的替代方法往往非常耗时和昂贵，它们需要大量的蛋白质才能成功。该协议提出了一种多PTM浓缩工作流程，涉及同时为两个PTM的抗体结合珠进行孵育，以提高实验的整体效率。该方法还涉及使用DDA进行光谱库生成和DIA MS采集，以检测和量化存在的肽，同时减少片段离子22、23的干扰。软件程序，如MS数据库搜索引擎用于分析和量化来自DDA收购的数据，而定量蛋白质组学软件24和特定的DIA定量分析软件25是解释DIA收购产生的复杂光谱所必需的。
在此协议中，应谨慎执行几个关键步骤。由于该协议的主要目标是同时为多个PTM进行扩充，抗体亲性浓缩步骤（第2节）对实验的成功至关重要。在珠子上进行分部时，必须确保没有珠子意外吸气。在用胰蛋白酶消化之前，确保尿素浓度已稀释至1M（步骤1.8）也是必要的。虽然在蛋白质溶解协议早期需要8M尿素，但尿素浓度超过1M会抑制胰蛋白酶的酶活性。此外，在整个协议中始终如一地检查样品的pH值也是很重要的。这在消化之前尤其重要。如果样品的pH值和胰蛋白酶溶液在孵育前未适当中和，则可能导致消化效率低下，其中可能错过许多裂解位点，导致肽识别较少。
在准备示例时，对协议进行一些修改可能会有所帮助。对于从 1 mg 起始材料中采购的蛋白质解结物，每个 PTM 扫描管中提供的四分之一的抗体珠可用作经济高效的替代物。只要使用的抗体珠量按比例增加，就可以使用更多的起始材料来取得更好的效果。另一个可以增强工作流程的修改是，除了胰蛋白酶之外，还可以用另一种蛋白酶来消化样品。这种修饰将导致被裂化的肽更具变异性，从而增加蛋白质残留物的覆盖率。虽然没有必要，但建议胰蛋白酶是PTM分析的酶之一，因为它的裂解特异性高26。
该协议的一个局限性是，正在研究的PTM需要有类似的化学成分，以便同时丰富14。不同抗体结合珠子的程序必须相似，使用类似的溶剂和溶液，包括类似的洗脱条件，最好来自同一供应商。因此，本文概述的方法始终以乙酰化化和渗化为例，两者都使用抗体结合的珠子（细胞信号技术，Inc）。虽然这种方法理论上可以适用于任意数量的PTM，但还需要进行更多的研究，以评估议定书在这方面的确切限制。此外，由于这是一种基于抗体的扩充方法，该方法只能提供PTM位点的相对定量。
与现有的多PTM浓缩方法相比，该工作流是一种更可行、更经济的替代方案。通过实验，观察到这种方法的功效与替代方法（如单一或串行浓缩）相比非常好。图2B显示，与单PTM浓缩和串行PTM富集13相比，单锅法中修饰肽峰区的中值CV实际上有所下降。进一步分析了评价乙酰化或渗化的位位定量的实验结果。此外，Spearman 相关性分析（图 2C，D） 表明单罐 PTM 富集与单 PTM 浓缩工作流类似。肽和片段级相关性也是如此。在比较单罐与串行-PTM富集时，所有三个相关性都持有相同的观察。
该协议允许研究人员快速、经济高效地对 PTM 串扰进行引人入胜的生物学见解。工作流程的DIA组件使研究人员能够更多地了解PTM，因为它提供有关站点本地化的信息，并克服了诸如PTM网站占用率低等挑战。 前体离子往往被DDA排除，这在研究PTM时尤其重要，因为站点占用率通常很低，无法为MS/MS选择，但仍包含重要信息。可以进行后续实验，以评估使用此方法可以同时丰富多少 PTM 的上限。此工作流的未来改进可能包括开发更高级的软件平台，以进一步自动化站点本地化和 PTM 站点占用的分析。

无数的翻译后修饰通过对活性1、信号2和周转率3、4的影响，动态调节蛋白质和通路。例如，蛋白质激酶通过加入磷酸盐组5激活或停用，而组蛋白乙酰化和其他修饰提供了改变染色质结构的机制，并用作转录调节机制6，7。近年来，越来越多的证据表明，多个PTM协同工作或竞争调节蛋白质功能或活动8，9，10，11。因此，理解PTM串扰是PTM研究的一个新兴需求。但是，大多数用于识别和量化 PTM 站点的蛋白组工作流侧重于单个修改，而不是多个修改的相互作用。所述工作流程将特定蛋白质修饰"热点"和经多个不同 PTM 修饰的流因为素残留物相关联。
科学界越来越需要可行的方法，同时研究多个PTM。大多数全球识别和量化多种类型的PTM的部位的方法都是具有挑战性的，因为高成本和数量所需的组织12，13。多PTM浓缩实验不仅在样品制备、数据采集和数据分析方面非常耗时，而且这些研究通常需要大量且往往令人望而却步的蛋白质11。此处描述的是同时丰富和分析多个 PTM 的协议，该协议还解决了其中的几个障碍，并支持大规模 PTM 分析和评估各种 PTM14之间的串扰。这个单罐工作流程概述了生物医学研究人员在全球范围内分析多个PTM、识别共修改肽以及以高效且经济高效的方式研究PTM串扰的实用方法。
在这里，这种方法是通过检查线粒体蛋白消融来展示的，这是50多年前首次研究的。它特别集中在裂化乙酰化17和琥珀化18，包括这些修饰在蛋白质上的共同发生，甚至在肽水平上共同修饰。由于该研究使用sirtuin 5（SIRT5）敲除小鼠模型，因此选择该模型侧重于乙酰化浓缩和渗化位点。作出这一决定是因为渗出位点是SIRT5解奇酶的目标，因此预计在KO小鼠中会显示出显著的调节，使它们成为本案中最相关的PTM。正如Carrico等人最近总结的那样，这两种PTM在生物学上都相关。一般来说，乙酰化对基因表达和代谢有重要影响，而渗氧体菌被报告调节心脏代谢和功能20。
所述协议可以使用少量的蛋白质输入材料（例如 1 mg 的蛋白质莱沙）执行，并通过减少样品处理、MS 采集和数据分析所花费的时间来缩短实验的总持续时间。图 1中提供了工作流原理图。我们还使用了更低数量的起始材料（降低100μg的蛋白质裂化物，相应减少使用的珠子量），这降低了已识别的囊化肽的总体产量;然而，它仍然提供非常有价值的结果和可量化的化囊化肽。
虽然所谓的自上而下或中下工作流程通常不使用蛋白解体消化方法（从而维持一种蛋白质内多个 PTM 的连接），但该协议侧重于基于肽的亲和扩增方法，以获得 PTM 鉴定和定量的额外深度和灵敏度（图 1）。此外，这种以肽为中心的工作流程采用现代质谱法，包括 1） 数据依赖性采集 （DDA） 组合以生成光谱库，2） 数据无关采集 （DIA），用于在无标签工作流中精确进行 PTM 量化。
DIA工作流程通过全面分割采样m/z范围内的所有肽信号21，克服了典型DDA扫描方案的采样分析。此功能在站点定位方面也非常有益，因为它更容易获得有关肽内哪些特定片段离子被修饰的信息。此外，DIA工作流程允许识别和定量具有相同前体离子的轻微PTM-肽等形。DIA 方法还可以根据在任何时候都全面测量的特定相应片段离子确定肽内的特定 PTM 位点定位。然而，DDA方法通常利用"动态排除"功能，排除同一前体子的MS/MS的多个采样，从而缺少轻微的PTM等形。
此处描述的同步扩充策略非常适合受益于多个 PTM 的全球分析和量化、检查 PTM 串扰和理解翻译后修改的动态交互的研究。在一个组合工作流程中，多个富集的PTM的识别已经描述通过：含有蛋白解酶肽的PTM的全局、串行或平行富集，或者通过分析完整的蛋白质。与乙酰化、渗化的连续富集直接比较，将单锅法的效能确定为非常相似的14。这些替代协议需要大量的起始材料和时间，而且成本可能过高。相反，单罐协议提供了一种廉价而高效的方法，用于通过后续分析和识别来浓缩多个 PTM。
小鼠肝脏组织从SIRT5敲除小鼠获得，并在这里用作起始材料。该协议也可以执行蛋白质乳酸从不同的组织或细胞培养实验。该协议可应用于从组织或细胞培养颗粒获得的蛋白质乳酸。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

研究蛋白质的多种翻译后修饰 （PTM） 是了解 PTM 串扰和获得对蛋白质功能更全面的见解的关键步骤。尽管多PTM浓缩研究很重要，但很少有研究一次调查一个以上PTM，部分原因是对PTM进行多个全球蛋白质组分析所需的费用、时间和大量蛋白质。本议定书中详述的"单锅"亲亲浓缩克服了这些障碍，允许同时识别和定量含有乙酰化基质和琥珀化的样品含量低的裂解物残留物的肽输入。该协议涉及从SIRT5敲除小鼠小鼠肝脏制备蛋白质解结物、胰蛋白酶消化性能、PTM富集以及使用数据独立采集（DIA）工作流程进行质谱分析。由于此工作流允许同时从同一样品中丰富两个 PTM，因此它提供了一个实用的工具，无需大量样品即可研究 PTM 串扰，并大大减少了样品制备、数据所需的时间采集和分析。工作流的 DIA 组件提供特定于 PTM 的全面信息。这在研究 PTM 站点定位时尤其重要，因为 DIA 提供了全面的片段离子集，这些片段离子可以计算破译，以区分不同的 PTM 定位等形。

图1显示了工作流程的一般图，包括从小鼠肝脏中采集组织，使用1毫克蛋白质与胰蛋白酶消化蛋白裂解物，用抗体结合的珠子孵化肽，获取MS上的样品，最后使用各种定量蛋白质组学软件包（学术和商业）对数据进行DIA/SWATH分析。
图 2A显示了与目前用于多 PTM 浓缩研究的替代方法相比，工作流程的时间线以及所需的样品和蛋白质量。单罐法可以执行一半的时间和一半的样本数量作为这些替代方法。与两种单PTM浓缩法相比，单罐方案还需要一半的蛋白质。
该协议已被证明是一种可行和具有成本效益的替代方案。图2B显示，在单锅法中，修饰肽区的变异系数（CV）低于单PTM和串行-PTM富集。图2C、D显示，在比较单罐PTM和单PTM扩充方法时，两次修改的站点级定量相关性之间没有明显的差异。肽级和片段级相关性也是如此。在比较单罐和串行-PTM扩充时，所有三个相关性都持有相同的观察。与 Basisty 等人最近报告关联的所有基础 MS 原始数据和已处理的 Excel 结果表均可用，可从 MassIVE （MSV00081906） 和 ProteomeXchange （PXD008640） 下载。
一般来说，虽然抗体浓缩策略可能表现出某些限制，如潜在的表位遮挡或有限的特异性，本研究中使用的抗体是独立生成的克隆的混合物，从而提供更广泛的范围特 异性。
实验结果记录了检测和评估PTM串扰的可能性。图 3显示了成功扩充的数据，并说明了一个肽示例，该肽包含多个和不同的丙基修饰，以可视化 PTM 串扰。图3A显示了一种在一种裂氨酸残留物上乙酰亚比的肽，另一种酶基残留物上是琥珀分的，图3B显示了两种裂氨酸上相同的肽。这表明相同的莱氨酸残留物可以修改与两个消融组，并有可能在该地点发生串扰。图 4显示了第 7.1-7.3 节中描述的用于进行这两种修改的流酶残留物数量，也指向可能的 PTM 串扰。
如图5所示，使用定量蛋白质组学软件处理 DIA PTM 数据集使我们能够精确定位哪些特定的流膜残留物被修改。这是一个称为站点本地化的概念，这是确定可能的 PTM 串扰分析的重要步骤。图 5显示了两个潜在的等形，以及每个可以可视化和评估的离子的确认和反驳，如第 8.1-8.3 节（具体步骤 8.3.2 和 8.3.3）中所述。基于这些信息，我们能够自信地确定原始样本中存在两个等形中的哪一个。已确认的等形KQYGeAFEKacR的MS/MS光谱清楚地显示，含有乙酰化裂解物残留物的y离子（y2-y5）偏移42m/z（乙酰组的增量质量），证实了被修饰的肽中特定的裂氨酸残留物。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> 图 1：一罐浓缩 PTM 的典型工作流。组织（这里，肝脏）从SIRT5 KO和野生型（WT）小鼠中收获，蛋白质被裂解，胰蛋白酶消化成肽，并脱盐。然后，通过微糖和乙酰抗体珠的组合，通过免疫亲和力来丰富肽。并行 MS 工作流程测量全裂解蛋白表达变化（用于蛋白质规范化）和 2）的丰度含丙基肽，用于抗化位点识别 （DDA-MS） 和位点定位，然后进行定量 （DIA-MS）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> 图2：单罐工作流与替代方法的比较。（A） 单罐工作流程、串行-PTM 浓缩和两个单 PTM 浓缩所需的时间、成本和材料的比较。（B） 单罐工作流程、单乙酰裂氨酸PTM浓缩和单一羟基-裂氨酸PTM浓缩之间的CV比较。斯皮尔曼相关分析比较了从单罐工作流程中获得的丙烯肽峰区和单PTM富集：对数2峰区结果（C）乙酰化位点和（D）渗化位点的相应图。回归斜率和相关因素在个别小组14中指明。为每个条件处理了两个独立的生物复制。这个数字已由Basisty等人第14号修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> 图3：乙酰化与渗化改性对流氨酸残留物的串扰。线粒体 3-酮-CoA 硫拉酶的胰体肽的 MS/MS 光谱，显示相同的氨基酸序列，但在两种裂解残留物中进行了改性，具有不同的 PTM.（A） 肽的 MS/MS AANEGYFINMAPIEVKsuccTKacK 和 （B） 肽的 MS/MS这个数字已由Basisty等人第14号修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> 图4：乙酰化基氨酸和琥珀化的流氨酸残留物之间的重叠和串扰-蛋白质复合物中特异性的例子。（A） 维恩图显示 2，235 个乙酰化点和 2，173 个渗化位点之间的重叠。其中，943个部位同时进行了乙酰亚比和琥珀酸盐。从SIRT5（去琥珀酶）敲除小鼠的肝脏进行分析，并确定了许多渗出位点。事实上，它们比在小鼠肝脏中通常观察到的更丰富（修饰肽以 <0.05 的 Q 值进行过滤）。（B） 蛋白质复合物显示其亚单位中同时含有乙酰酸度和琥珀质分位的百分比（粗体红线表示费舍尔精确测试确定的重要性）。（C） ATP合成酶复合物图：红色蛋白质亚单位描述同时含有乙酰酸酯和琥珀分位的亚单位。这个数字已由Basisty等人第14号修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> 图5：定量蛋白质组学软件破译了PTM的肽位定位。基于肽的MS/MS碎片，可以提供有关乙酰组正在修改的特定裂氨酸残留物的信息。这展示了软件提供PTM现场本地化的宝贵信息的能力. （A） 裂化残留物修改和PTM站点本地化的两种可能性：KQYGEAFEKacR（左）和KacQYGEAFEKR（右）。显示每个潜在的位点定位等形肽的"确认"和"拒绝"片段离子。根据此信息，将分配确认分数和反驳分数，确认样本中是否存在等形 KQYGEAFEKacR。（B） MS/MS 光谱对应于已确认的等形 KQYGeAFEKacR，指示所有 y 离子（包括乙酰化的液化液化残留物（y2及更高）的增量质量为 +42 m/z，对应于乙酰改性。观测到的 b 离子不包含修饰。（C） 提取的离子色谱图 （XIC） 具有丰富的峰区，由 y2和 y3离子产生，两者构成已确认的等形 KQYGEAFEKacR 中的乙酰化位点<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">。请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

此工作流程描述了用于定量全球蛋白质组分析的多个蛋白质转化后修饰 （PTM） 的及时且经济高效的扩充性能。该协议利用肽级PTM富集与多个结合抗体，然后数据独立的采集质谱分析，以获得对PTM串扰的生物见解。

量化和站点本地化两个翻译后修改的同步亲和力丰富

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

该协议描述了与抗体同时富集多个PTM的新技术，然后进行数据独立采集质谱分析，以获得对位点定位和相声的生物洞察。这是一种具有时间和成本效益的技术，能够同时识别和定量多肽，切片含有乙酸和吸碱PTM，只有少量的样品输入。跟踪翻译后修改是描述和防治不同疾病状态的重要步骤。我们已经知道，某些癌症和糖尿病通过这些蛋白质的修饰受到高度控制。该方法理论上可应用于任何具有富集抗体的PTM，如泛化、磷酸化等。它也可以应用于其他组织类型或细胞培养模型。使用此技术获取有价值的数据的关键是可重复性。这可以通过确保所有步骤非常仔细地执行，特别是涉及抗体珠的步骤来实现。首先，获取含有C18树脂的墨盒，这些树脂结合到高达10毫克的蛋白质。将这些墨盒安装到真空装置中。在19.8%的水中加入800微升80%乙酰酸和0.2%甲酸，开始真空吸气，将液体拉过。重复此步骤一次，避免完全干燥墨盒。通过真空吸附在水中加入 800 微升 0.2% 甲酸，使墨盒与墨盒进行均衡。重复两次。将一毫克多肽在约1000微升溶液中装到真空吸气的墨盒上。在真空吸水下用800微升0.2%的甲酸洗涤两次肽。然后在每个墨盒下方排列 1.5 毫升微离心管，以收集肽。在真空吸气下，首先从墨盒中去除800微升的80%乙酰酸和0.2%的甲酸，在19.8%的水中，然后用400微升相同的溶液。在真空浓缩器中完全干燥脱盐肽样品两到三个小时。现在，将干燥的肽重新在1.4毫升的冷1X免疫仿纯缓冲液中重新填充。涡流混合，确保pH值约为7。将样品以10，000倍g离心，在4摄氏度下10分钟。出现一个小颗粒。在准备抗体珠时，将肽放在冰上。将一毫升冷1X PBS加入含有100微升K-乙酰抗体珠浆的管子和含有100微升K-succinyl抗体珠浆的管子，通过移液混合。将整个溶液转移到新的 1.5 毫升管中，并在微型离心机中旋转 30 秒，在室温下。吸气PBS小心，避免吸走任何珠子。重复洗涤三次。接下来，将珠子重新在大约440微升PBS中重新发送。移液珠子几次混合好。使用200微升预切技巧，将每个乙酰氨酸抗体珠和苏辛利氨酸抗体珠的100微升转移到一个新的管中。在微型离心机中旋转 30 秒，然后用凝胶装载机尖端吸气介质。珠子现在变白了。将重新悬浮的肽直接放在洗涤的珠子上，在四摄氏度下一夜之间用珠子孵育肽。早晨，在4摄氏度下，在2000次g下旋转肽样品，30秒。取出含有未绑定肽的上能物质，如果需要，保存用于将来的实验。在珠子中加入一毫升冷1X免疫仿纯液，通过倒置五次进行洗涤和混合。在4摄氏度下以2000倍g旋转30秒。吸掉免疫仿纯溶液，再重复免疫仿纯洗涤步骤。然后将一毫升冷 HPLC 水加入珠子中，并反转五次。在4摄氏度下以2000倍g旋转30秒。吸水，再重复两次水洗步骤。在4摄氏度下以2000次g旋转一次，30秒，收集管底中剩余的水。与平翻凝胶加载提示，吸走任何额外的水已经收集。小心避免吸珠子。在水中加入55微升0.15%的三氟乙酸。在室温下孵育珠子10分钟，同时偶尔敲击管子底部进行混合。在室温下在微型离心机中旋转珠子30秒。使用扁平的倾斜凝胶加载尖端将洗洗的肽转移到新管中。在水中加入45微升0.15%三氟乙酸。在室温下孵育10分钟，偶尔敲击管底混合。在室温下在微型离心机中旋转珠子30秒。使用扁平的倾斜凝胶加载尖端拆下第二个洗脱，并将其与第一个洗脱相结合。在室温下将组合的洗出肽以12，000次g旋转5分钟，以将任何携带的珠子粒出。将肽样品溶液转移到新的500微升管中。构建加载方法，将富集的肽混合物加载到 C18 预列芯片上，然后通过移动 A 阶段每分钟两微升洗涤 10 分钟，再次对肽脱盐。构建色谱法，使多肽以每分钟300纳米的流速转移到分析柱，使用移动相 A 和 B 的 2 到 3 小时梯度。随后，将移动阶段 B 在五分钟内提升至 80%，然后在 80%B 下保持 8 分钟，然后返回 5%B 进行 25 分钟的重新平衡。接下来，构建一种 MS 仪器方法，用于数据相关采集。对于实验一，将MS1前体离子扫描从M/Z 400设置为1500。将持续时间设置为 120 分钟。创建 IDA 实验，然后单击"确定"。在开关条件选项卡下，设置强度阈值以触发 MS/MS 扫描，以在 2 到 5 到 200 个计数之间触发 MS/MS 扫描。将前体离子的动态排除设置为 60 秒。对于实验二，将 MS/MS 产品离子扫描设置为 MS2 扫描范围从 M/Z 100 到 1，500。单击编辑参数，将碰撞能量扩散设置为五，并选择高灵敏度产品离子扫描模式。最后，将样品放入自动采样器中。提交示例队列并开始 LC-MS/MS 采集方法，构建 MS 仪器方法，用于数据独立采集并定义两个仪器扫描实验。执行 MS1 前体离子扫描从 400 到 1，250 质量充电，并设置持续时间为 120 分钟。将碰撞能量扩散设置为 10，累积时间设置为 45 毫秒，然后选择高灵敏度产品离子扫描模式。接下来，导入包含 64 个变量窗口 DIA SWATH 采集方案的文本文件，以将 SWATH 采集窗口填充到方法中。在此采集方案中，从 5 到 90 质量到充电的可变窗口以增量步骤传递，在 400 到 1，250 质量的完全质量范围内充电，每个段总共有 64 个 SWATH 段，累积时间为 45 毫秒。将 MS1 累积时间调整为 0.25 秒。MS1 扫描和 64 次 MS2 扫描现在应总共产生 3.2 秒的总周期时间。在这项研究中，实验结果记录了检测和评估PTM相声的可能性。此表显示工作流的时间表以及所需的样品和蛋白质量。单锅方法可以在一半的时间执行，样本数的一半可以作为这些替代方法执行。在单锅法中，改性肽区域的中值变异系数低于单一PTM和串行PTM富集。在比较单锅PTM和单一PTM浓缩方法时，两种修改的站点级定量相关性没有明显差异。此图显示成功浓缩的数据，并说明了包含多个和不同交流修饰的肽示例，该修饰图显示 PTM 相声。一种肽在一个裂氨酸残留物上乙酰化，并在另一个裂谷素上被苏奇林化，而在这里，同样的肽在两个裂酸被苏奇林化。这表明，相同的Lysine残留物可以同时使用两个同化组进行修饰，并且有可能在该站点发生相声。必须确保每个样品都含有相同数量的珠子，并确保在洗涤肽键珠时，没有一个珠子意外吸气。在软件工具（如 Spectronaut）中，基于质谱的分析和数据分析按照此过程执行，以识别、量化和执行 PPTM 的站点定位。这种独立于数据的采集工作流与同时进行 PTM 扩充相结合，将打开途径，更高效地评估 PTM 相声，并提供有关 PTM 信令相关性的更好见解。

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

特定地点的重组酶（SSR）技术的原则

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

科研

生物学

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

异核技术的细胞类型特异性定位分析

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

检测采用ELISA法的母语完整的核小体的翻译后修饰

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

加上质谱肽免疫亲和富集的蛋白质定量

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

芽殖酵母蛋白质的提取和纯化功能研究，交互和翻译后修饰

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

植物蛋白复合体的翻译后修饰的鉴定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

结晶纤维素积累高分辨率的量化<em&gt;拟南芥</em&gt;根监视特定组织细胞壁修改

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

完整的工作流程为组蛋白翻译后修饰的分析采用自下而上质谱法：从组蛋白提取数据分析

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

用数据无关采集质谱法定量测定点特异蛋白赖氨酸乙酰化和琥珀酰化化学计量学

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...