Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Vi anerkender støtten fra NIH's delte instrumenteringslegat til TripleTOF-systemet på Buck Institute (1S10 OD016281). Dette arbejde blev også støttet af National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 til B.S.) og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 to Eric Verdin; R01 DK090242 til Eric Goetzman). X.X. blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, til Judith Campisi og Lisa Ellerby), NB blev støttet af en postdoc stipendium fra Glenn Foundation for Medical Research.

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach.">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li><li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+level+of+complexity:+crosstalk+of+posttranslational+modifications.">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li><li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways.">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks.">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li><li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne protokol beskriver en ny teknik til samtidig flere PTM berigelse til mere effektivt at forstå PTM krydstale. Alternative metoder til at nå dette mål har tendens til at være uoverkommeligt tidskrævende og dyre, og de kræver , at store mængder protein lykkes11,13. Denne protokol præsenterer en multi-PTM berigelse workflow, der indebærer inkubation i antistof-konjugerede perler til to PTMs på én gang for at forbedre den samlede effektivitet af forsøget. Denne metode indebærer også anvendelse af DDA til spektral biblioteksgenerering og DIA MS-opkøb til at opdage og kvantificere de tilstedeværende peptider med reduceret interferens fra fragmentioner22,23. Softwareprogrammer, såsom MS database søgemaskiner bruges til at analysere og kvantificere data fra DDA opkøb, mens kvantitative Proteomics Software24 og specifikke DIA kvantitative analyse Software25 er nødvendige for at fortolke de komplekse spektre produceret af DIA opkøb.
Der er flere kritiske trin i denne protokol, som bør følges nøje. Da hovedformålet med protokollen er at berige for flere PTMs samtidigt, antistof-affinitet berigelse trin (afsnit 2) er afgørende for succes eksperimentet. Når du udfører vasker på perlerne, er det nødvendigt at sikre, at ingen af perlerne er indsugning ved et uheld. Det er også nødvendigt at sikre, at urinstofkoncentrationen er fortyndet til 1 M før fordøjelsen med trypsin (trin 1.8). Selv om 8 M urea er påkrævet tidligere i protokollen for protein opløselighed, urea koncentrationer over 1 M vil hæmme trypsin's enzymatiske aktivitet. Desuden er det vigtigt konsekvent at kontrollere prøvens pH-pc i hele protokollen. Dette er især vigtigt før fordøjelsen. Hvis prøvens pH-pH og trypsinopløsningen ikke neutraliseres korrekt før inkubationen, kan det resultere i en ineffektiv fordøjelse, hvor mange spaltningssteder kan gå glip af, hvilket resulterer i færre peptididentifikationer.
Et par ændringer af protokollen kan være nyttige, når du forbereder prøver. For et protein lysate indkøbt fra 1 mg udgangsmateriale, en fjerdedel af antistof perler ne i hvert PTM scanningsrør kan bruges som et omkostningseffektivt alternativ. En større mængde udgangsmateriale kan bruges til bedre resultater, så længe mængden af anvendte antistofperler øges forholdsmæssigt. En anden ændring, der kan forbedre arbejdsgangen er at fordøje prøver med en anden protease ud over trypsin. Denne ændring ville resultere i større variation i peptider kløvet, hvilket giver øget dækning af proteinrester. Selvom det ikke er nødvendigt, anbefales det, at trypsin være et af de enzymer, der anvendes til PTM analyse på grund af sin høje kavalergang specificitet26.
En begrænsning af denne protokol er, at de ptms, der undersøges , skal have lignende kemifor at blive beriget samtidig14. Procedurerne for de forskellige antistofkonjugerede perler skal være ens, idet lignende opløsningsmidler og opløsninger, herunder lignende elueringsbetingelser, og helst fra samme leverandør. Af denne grund, den metode, der er skitseret her konsekvent bruger acetylation og kortfattetlation som et eksempel, som begge bruger antistof-konjugerede perler (Cell Signaling Technology, Inc). Selv om denne metode teoretisk set kan anvendes på et vilkårligt antal PTM'er, vil der være behov for yderligere undersøgelser for at vurdere protokollens nøjagtige begrænsning i denne henseende. Da dette er en antistofbaseret berigelsesmetode, kan metoden desuden kun give en relativ kvantificering af PTM-steder.
Sammenlignet med eksisterende multi-PTM berigelse metoder, denne arbejdsgang er et mere realistisk og omkostningseffektivt alternativ. Ud fra dette eksperiment blev det bemærket, at effekten af denne metode er meget godt sammenlignet med alternative metoder, såsom individuelle eller serielle berigelser. Figur 2B viser , at median-CV'et for modificerede peptidpeakområder faktisk blev nedsat i onepotmetoden sammenlignet med enkelt-PTM-berigelser og seriePTM-berigelser13. Vi analyserede yderligere de eksperimentelle resultater, der vurderede kvantificeringer på site-niveau for acetylation eller korthedsopning. Desuden viste Spearman-korrelationsanalysen (figur 2C,D),at enpotptionsberigelsen udførte på samme måde som arbejdsgangene for enkelt-PTM-berigelse. Dette var også tilfældet for peptid- og fragment-niveau korrelationer. Den samme observation for alle tre korrelationer, når man sammenligner en pot med seriel PTM berigelse.
Denne protokol giver forskerne mulighed for at gøre fascinerende biologisk indsigt i PTM krydstale på en hurtig og omkostningseffektiv måde. DIA-komponenten i arbejdsgangen giver forskerne mulighed for at forstå mere om PTMs, da det giver oplysninger om lokalisering af webstedet og overvinder udfordringer såsom lav belægning af PTM'er. Prækursorer har tendens til at blive udelukket med DDA, hvilket er særlig vigtigt, når man studerer PTMs, da belægningen på stedet ofte er lav til det punkt, hvor disse peptider ikke bliver udvalgt til MS/MS, men stadig indeholder vigtige oplysninger. Der kan udføres opfølgende forsøg for at vurdere den øvre grænse for, hvor mange PTM'er der kan beriges samtidigved hjælp af denne metode. En fremtidig forbedring af denne arbejdsgang kan omfatte udvikling af mere avancerede softwareplatforme for yderligere at automatisere analysen af lokalisering af webstedet og PTM-webstedsbelægning.

Et utal af post-translationelle ændringer dynamisk regulere proteiner og veje gennem virkninger på aktiviteten1, signalering2, og omsætning3,4. F.eks. aktiveres eller deaktiveres proteinkinaser ved tilsætning af fosfatgrupper5, og histoneacetylation og andre ændringer giver en mekanisme til at ændre kromatinstrukturen og fungere som transskriptionelle reguleringsmekanismer6,7. I de senere år har der været dokumentation for , at flere PTM'er arbejder i fællesskab eller konkurrerer om at regulere proteinfunktion eller aktivitet8,9,10,11. Derfor forståelse PTM krydstale er et nyt behov i PTM forskning. De fleste tilgængelige proteomiske arbejdsgange til at identificere og kvantificere PTM-websteder fokuserer dog på enkelte ændringer i stedet for samspillet mellem flere ændringer. Den beskrevne arbejdsgang korrelerer specifikke proteinmodifikation "hot-spots" og lysinrester, der er modificeret af flere forskellige PTMs.
Der er et stigende behov i det videnskabelige samfund for gennemførlige metoder til at studere flere PTMs samtidig12. De fleste metoder til globalt at identificere og kvantificere lokaliteterne for flere typer PTM 'er udfordrende på grund af de høje omkostninger og mængden af væv , der kræves12,13. Ikke alene er multi-PTM berigelse eksperimenter tidskrævende med hensyn til prøve forberedelse, dataindsamling, og dataanalyse, men disse undersøgelser kræver typisk store og ofte uoverkommelige mængder af protein11. Beskrevet her er en protokol for samtidig berigelse og analyse af flere PTMs, som også omhandler flere af disse barrierer og muliggør storstilet PTM profilering og vurdering krydstale mellem forskellige PTMs14. Denne one-pot workflow skitserer en praktisk måde for biomedicinske forskere til globalt profil flere PTMs, identificere co-modificerede peptider, og studere PTM krydstale i en effektiv og omkostningseffektiv måde14,15.
Her er denne metode fremvist ved at undersøge mitokondriel protein acylation, som først blev undersøgt over 50 år siden16. Det koncentrerer sig specifikt om lysin acetylation17 og kortfattetlation18, herunder co-forekomst af disse ændringer på proteiner og endda co-modifikation på peptid niveau. Da undersøgelsen bruger en sirtuin 5 (SIRT5) knockout mus model, blev det valgt at fokusere på berigelse af acetylation og kortfattetlation steder. Denne beslutning blev truffet, fordi korthedslokaliteter er mål for SIRT5 desuccinylase og derfor forventes at udvise betydelig opregulering i KO-mus, hvilket gør dem til de mest relevante PTM'er i dette tilfælde. Begge PTM'er er biologisk relevante som for nylig opsummeret af Carrico et al.19. Generelt, acetylation viser vigtige virkninger på genekspression og stofskifte, og kortfattetlation er blevet rapporteret til at regulere hjertemetabolisme og funktion20.
Den beskrevne protokol kan udføres med en lav mængde proteininputmateriale (f.eks. 1 mg proteinlysat) og reducerer forsøgets samlede varighed ved at reducere den tid, der bruges til prøvebehandling, MS-erhvervelse og dataanalyse. Der findes en arbejdsgangsskemai figur 1. Vi har også brugt endnu lavere mængder udgangsmateriale (ned til 100 μg protein lysat, skalering ned de mængder af perler, der anvendes i overensstemmelse hermed), hvilket som forventet reducerer det samlede udbytte af identificerede acylated peptider; men, Det giver stadig meget værdifulde resultater og kvantificerbare acylated peptider.
Mens såkaldte top-down eller midt-down arbejdsgange typisk ikke bruger proteolytiske fordøjelse tilgange (og dermed opretholde tilslutning af flere PTMs inden for et protein), denne protokol fokuserer på en peptid-baseret affinitet berigelse tilgang til at få ekstra dybde og følsomhed for PTM identifikation og kvantificering (Figur 1). Desuden anvender denne peptid-centreret arbejdsgang moderne massespektrometrimetoder, herunder 1) en kombination af dataafhængig erhvervelse (DDA) til at generere spektralbiblioteker og 2) datauafhængige anskaffelse (DIA) til nøjagtig PTM-kvantificering i en etiketfri arbejdsgang.
DIA-arbejdsgange overvinder prøveudtagning af typiske DDA-scanningsordninger ved at fragmentere alle peptidsignaler inden for det samplede m/z-område21. Denne funktion er også yderst gavnligt med hensyn til lokalisering af webstedet, fordi det er lettere at få oplysninger om, hvilke specifikke fragmentioner der ændres i peptidet. Desuden tillader DIA-arbejdsgange identifikation og kvantificering af mindre PTM-peptidisoformer med identiske forløberioner. DIA metoder kan også bestemme en bestemt PTM site lokalisering i et peptid baseret på specifikke tilsvarende fragment ioner, der er omfattende målt på alle tidspunkter. DDA-tilgange anvender dog ofte "dynamiske udelukkelsesfunktioner", der udelukker flere prøveudtagninger af MS/MS for den samme forløber, og mangler dermed mindre PTM-isoformer.
Den samtidige berigelsesstrategi, der er beskrevet her, er ideel til undersøgelser, der vil drage fordel af den globale profilering og kvantificering af flere PTM'er, undersøge PTM-krydstale og forstå de dynamiske interaktioner mellem posttranslationelle ændringer. Identifikation af flere berigede PTM'er i én kombineret arbejdsgang er beskrevet ved: global, seriel eller parallel berigelse af PTM indeholdende proteolytiske peptider eller alternativt ved analyse af intakte proteiner. I direkte sammenligning med seriel berigelse af acetylation og korthedsopning blev effektiviteten af one-pot-metoden fastslået som meget ens14. Disse alternative protokoller kræver betydelige mængder af udgangsmateriale og tid og kan være uoverkommeligt dyre. I modsætning hertil giver one-pot-protokollen en billig og effektiv metode til berigelse af mere end én PTM med efterfølgende analyse og identifikation.
Mus levervæv er fremstillet af SIRT5 knockout mus og bruges her som udgangsmateriale. Denne protokol kan også udføres for protein lysater fra forskellige væv eller cellekultur eksperimenter. Denne protokol kan anvendes på proteinlysater fremstillet af væv eller cellekulturpiller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

Undersøgelse af flere post-translationelle ændringer (PTMs) af proteiner er et afgørende skridt til at forstå PTM krydstale og få mere holistisk indsigt i protein funktion. På trods af betydningen af multi-PTM berigelse undersøgelser, få undersøgelser undersøge mere end én PTM ad gangen, dels på grund af udgifter, tid og store proteinmængder, der kræves for at udføre flere globale proteomiske analyse af PTM' er. Den "one-pot" affinitetberigelse, der er beskrevet i denne protokol, overvinder disse hindringer ved at tillade samtidig identifikation og kvantificering af peptider med lysinrester indeholdende eddikeog korttidsopblandingPT'er med lave mængder prøve Input. Protokollen indebærer forberedelse af protein lysat fra muselever af SIRT5 knockout mus, udførelse af trypsin fordøjelse, berigelse for PTMs, og udførelse n af massespektrometrisk analyse ved hjælp af en data-uafhængig erhvervelse (DIA) workflow. Da denne arbejdsgang gør det muligt at tilsaøse to PTMs fra samme prøve samtidig, giver den et praktisk redskab til at studere PTM krydstale uden at kræve store mængder prøver, og det reducerer i høj grad den tid, der kræves til prøveforberedelse, data erhvervelse og analyse. DIA-komponenten i arbejdsprocessen indeholder omfattende PTM-specifikke oplysninger. Dette er især vigtigt, når man studerer PTM site lokalisering, som DIA giver omfattende sæt af fragment ioner, der kan beregningsmæssigt dechifreres at skelne mellem forskellige PTM lokalisering isoformer.

Figur 1 viser et generelt diagram over arbejdsgangen, herunder høst af vævet fra muselever, ved hjælp af 1 mg protein til nedbrydning af proteinlysat med trypsin, inkuberende peptider med antistofkonjugerede perler, erhvervelse af prøverne på MS og endelig dia/swath-analyse af dataene ved hjælp af forskellige kvantitative proteomics softwarepakker (akademiske og kommercielle).
Figur 2A viser, hvordan arbejdsgangens tidsplan og mængden af prøve og protein kræves sammenlignet med alternative metoder, der i øjeblikket anvendes til multi-PTM-berigningsundersøgelser. Den one-pot metode kan udføres i halvt så meget tid og med halvdelen af antallet af prøver som disse alternative metoder. Sammenlignet med den to enkelt-PTM berigelse metode, en-pot protokol kræver også halvdelen af mængden af protein.
Denne protokol har vist sig at være et gennemførligt og omkostningseffektivt alternativ. Figur 2B viser, at medianvariationskoefficienten for modificerede peptidområder var lavere i one-pot-metoden end i single-PTM- og seriePTM-berigelserne. Figur 2C,D viser, at selv om de sammenlignede ptm-værdien med én pot og enptm-berigelsesmetoder, var der ingen bemærkelsesværdige forskelle mellem korrelationerne mellem kvantificeringer på lokalitetsniveau for de to ændringer. Dette var også tilfældet for peptid-niveau og fragment-niveau korrelationer. Den samme observation for alle tre korrelationer, når man sammenligner one-pot og serial-PTM berigelser. Alle underliggende MS-rådata og behandlede Excel-resultatark, der er knyttet til en nylig rapport fra Basisty et al.14, er tilgængelige og kan downloades fra MassIVE (MSV00081906) og ProteomeXchange (PXD008640).
Generelt er de antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse, blandinger af uafhængigt genererede kloner og dermed give bredere Særtræk.
Eksperimentelle resultater dokumenterer muligheden for at opdage og vurdere PTM krydstale. Figur 3 viser data fra en vellykket berigelse og illustrerer et eksempel for et peptid, der indeholder flere og forskellige acylmodifikationer, der visualiserer PTM krydstale. Figur 3A viser et peptid, der acetylateres på den ene lysinrester og er kortfattet på den anden side, og figur 3B viser det samme peptid, der er kortfattet ved begge lysiner. Dette viser, at den samme lysinrester kan ændres med begge acylationsgrupper, og der er mulighed for krydstale på dette sted. Figur 4 viser antallet af lysinrester, der blev identificeret som beskrevet i punkt 7.1-7.3 til at bære begge ændringer, der også peger mod mulige PTM krydstale.
Som figur 5 viser, giver behandling af DIA PTM-datasæt med kvantitativ proteomics software os mulighed for at lokalisere, hvilke specifikke lysinrester der ændres. Dette er et begreb kendt som site lokalisering, som er et vigtigt skridt for enhver analyse for bestemmelse af mulige PTM krydstale. Figur 5 viser to potentielle isoformer sammen med bekræftelses- og tilbagevisningsionerne for hver, der kan visualiseres og vurderes som beskrevet i afsnit 8.1-8.3 (specifikt trin 8.3.2 og 8.3.3). På grundlag af disse oplysninger kunne vi trygt identificere, hvilken af de to isoformer der var til stede i den oprindelige prøve. MS/MS-spektret af den bekræftede isoform KQYGEAFEKacR viser klart, at y ionerne (y2-y5),der indeholder den acetylerede lysinrester, som skiftede med 42 m/z (en acetylgruppes forøgelsesmasse), bekræftede den specifikke lysinrester i peptidet, der blev ændret.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> Figur 1: Typisk arbejdsgang for berigelse af PTM'er med én pot. Væv (her, lever) høstes fra SIRT5 KO og vilde-type (WT) mus, og proteiner er lysed, trypsin-fordøjet i peptider, og afsaltet. Peptider beriges derefter ved immunaffinitet med kombinationer af succinyl- og acetyl-antistofperler. Parallelle MS-arbejdsgange måler både 1) små aliquots af hele lysate proteinudtryksændringer (for proteinnormalisering) og 2) berigede acylholdige peptider til identifikation af acylationswebsted (DDA-MS) og lokalisering af lokaliteter på stedet efterfulgt af kvantificering (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> Figur 2: Sammenligning af arbejdsgangen med én pulje med alternative metoder. (A) Sammenligning af tid, omkostninger og materialer, der kræves til arbejdsgangen med én pulje, serie-PTM-berigelse og to enkelt-PTM-berigelser. (B) Sammenligning af CV'er mellem arbejdsgangen med én gryde, en enkelt PTM-berigelse af acetyllysin og enkelt ptm-berigelse. Spearman korrelationsanalyse sammenligne acyl peptid peak områder opnået fra en-pot arbejdsgang, og single-PTM berigelser: tilsvarende parceller af log2 peak område resultater for (C) acetylation sites og (D) kortfattetlation steder. Regressionsskråninger og korrelationsfaktorer er angivet i de enkelte paneler14. To uafhængige biologiske replikater blev behandlet for hver af betingelserne. Dette tal er blevet ændret fra Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> Figur 3: Krydstale mellem acetylation og kortfarvning af lysinrester. MS/MS spektre af tryptatiske peptider fra mitokondrial 3-ketoacyl-CoA thiolase, der viser den samme aminosyre sekvens, men er blevet ændret ved to lysinrester med forskellige PTMs. (A) MS/MS af peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK ogB) MS/MS af peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Dette tal er blevet ændret fra Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> Figur 4: Overlap og krydstale mellem de acetylerede og succinylated lysinrester–specifikke eksempler på proteinkomplekser. (A) Venn-diagram med overlap mellem 2.235 acetylation og 2.173 kortgørelsessteder. Heraf var 943 lokaliteter både acetylerede og succinylated. Lever fra en SIRT5 (de-succinylase) knockout mus blev analyseret, og mange kortfattetlation steder blev identificeret. Faktisk var de mere rigelige end normalt observeret i muselever (modificerede peptider blev filtreret til en Q-værdi på <0,05). (B) Proteinkomplekser, der viser procentdelen af deres underenheder, der indeholder både acetilerede og succinylated sites (fed rød linje repræsenterer betydningen som bestemt af Fishers nøjagtige test). (C) Diagram over ATP syntase kompleks: protein underenheder i rødt skildrer de underenheder, der indeholder både acetylated og succinylated sites. Dette tal er blevet ændret fra Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> Figur 5: Kvantitative proteomics software dechifrere peptid site lokalisering af PTMs. Baseret på MS/MS fragmentering af peptidet er det muligt at give oplysninger om de specifikke lysinrester, som acetylgruppen ændrer. Dette viser softwareens evne til at tilbyde værdifulde oplysninger om lokalisering af PTM'er. (A) To muligheder for lysinrestermodifikation og LOKALISERING af PTM-stedet: KQYGEAFEKacR (til venstre) og KacQYGEAFEKR (til højre). "Bekræfter" og "tilbagevise" fragment ioner er vist for hver af de potentielle site lokalisering isoformer af peptid. Baseret på disse oplysninger tildeles bekræftelse af scorer og tilbagevise resultater, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af isoform KQYGEAFEKacR i prøven. B) MS/MS-frekvenser svarende til den bekræftede isoform KQYGEAFEKacR, der angiver, at alle y ioner, herunder de acetylerede lysinrester (y2 og højere), bærer en stigningsmasse på +42 m/z, hvilket svarer til acetylændringen. Observerede b-ioner indeholder ikke ændringen. (C)Udvundet ionkromatogramme (XIC) med rigelige topområder som følge af y2 og y3 ioner, som begge udgør acetylationsstedet i det bekræftede isoform KQYGEAFEKacR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Denne arbejdsgang beskriver ydeevnen af tids- og omkostningseffektiv berigelse af flere proteinændringer efter oversættelser (PTM)samtidig til kvantitativ global proteomisk analyse. Protokollen udnytter peptid-niveau PTM berigelse med flere konjugerede antistoffer, efterfulgt af data-uafhængige erhvervelse massespektrometri analyse for at få biologisk indsigt i PTM krydstale.

Samtidig affinitetberigelse af to ændringer efter oversættelser til kvantificering og lokalisering af lokaliteter på stedet

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Denne protokol beskriver den nye teknik til samtidig berigelse af flere PtMs med antistoffer efterfulgt af data uafhængig erhvervelse massespektrometri analyse for at få biologisk indsigt i lokalisering og krydstale. Dette er en tids- og omkostningseffektiv teknik, som muliggør samtidig identifikation og kvantificering af peptider med udskæring indeholdende acetylation og succinylation-PtM'er med kun små mængder prøveinput. Sporing post-translationelle ændringer er et vigtigt skridt i at karakterisere og bekæmpe forskellige sygdom stater.Vi er allerede klar over, at visse kræftformer og diabetes er stærkt reguleret gennem disse protein ændringer. Denne metode kan teoretisk anvendes på alle PTMs med antistoffer til berigelse såsom allestedsnærværelse, fosforylering og andre. Det kan også gælde for andre vævstyper eller cellekulturmodeller.Nøglen til at opnå værdifulde data ved hjælp af denne teknik er reproducerbarhed. Dette kan opnås ved at sikre, at alle trin udføres meget omhyggeligt, især de trin, der involverer antistofperlerne. Til at begynde, få patroner, der indeholder C18 harpiks, der tilsammen op til 10 milligram protein.Sæt disse patroner i et vakuumapparat. Tilsæt 800 mikroliter på 80% acetonitril og 0,2% myresyre til patronerne med 19,8% vand og start vakuumsugning for at trække væsken igennem. Gentag dette trin én gang undgå tørring af patronerne helt.Ligevægt patronerne ved at tilsætte 800 mikroliter af 0,2% myresyre i vand med vakuumsugning. Gentag dette to gange. Læg en milligram peptider i omkring 1.000 mikroliter opløsning på patronerne med vakuumsugning.Peptiderne vaskes to gange med 800 mikroliter på 0,2% myresyre i vand under vakuumsuge. Derefter arrangere 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør under hver patron til at indsamle peptid. Under vakuumsugning, elute peptider fra patroner først med 800 mikroliter på 80% acetonitril og 0,2% myresyre i 19,8% vand derefter med 400 mikroliter af samme opløsning.De afsaltede peptidprøver tørres helt i en vakuumkoncentrator i to til tre timer. Nu, resuspend de tørrede peptider i 1,4 milliliter af kold 1X immunoaffinity rensning buffer. Vortex at blande og sikre en pH-værdi på ca 7.Centrifuge prøverne ved 10,000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Der vises en lille pille. Sæt peptiderne til side på is, mens du forbereder antistofperler.Der tilsættes en milliliter kold 1X PBS til et rør, der indeholder 100 mikroliter K-acetylantistofperle og et rør indeholdende 100 mikrotolikker K-succinylantistofperlege og blandes ved pipettering. Hele opløsningen overføres til nye 1,5 milliliterrør, og der drejes i en miniaturecentrifuge i 30 sekunder ved stuetemperatur. Aspirere PBS og pas på for at undgå at aspirere eventuelle perler af.Gentag vasken tre gange. Dernæst resuspenderede perlerne i omkring 440 mikroliter af PBS. Pipette perlerne flere gange for at blande godt.Med 200 microliter precut tips, overføre 100 mikroliter af hver acetyllysin antistof perler og succinyllysin antistof perler i et nyt rør. Drej ned i 30 sekunder i en miniaturecentrifuge og aspirere medierne af med en gellæsserspids. Perlerne bliver nu hvide.Pipette det resuspenderede peptid direkte på de vaskede perler og inkubere peptiderne med perler ved fire grader Celsius natten over med omrøring. Om morgenen drejes peptidprøverne ved 2.000 gange g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Fjern supernatant, der indeholder ubundne peptider, og gem til fremtidige eksperimenter, hvis det ønskes.Tilføj en milliliter kold 1X immunoaffinity rensning buffer til perlerne til at vaske og blandes ved at vende fem gange. Spin ved 2,000 gange g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Aspirere immunafinarisk rensningsopløsning af og gentag immunafinaitetsrensningsskæretrinnet en gang mere.Tilsæt derefter en milliliter koldt HPLC-vand til perlerne og bland ved at vende fem gange. Spin ved 2,000 gange g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Aspirere vandet af og gentag vandvasktrinnet to gange.Drej en ekstra gang ved 2,000 gange g i 30 sekunder ved fire grader Celsius for at indsamle eventuelt resterende vand i bunden af røret. Med flade spids gel læssetips, aspirere off ekstra vand, der har indsamlet. Vær omhyggelig med at undgå at aspirere perlerne.Tilsæt 55 mikroliter på 0,15% trifluorætsyre i vand til perlerne. Inkuber perlerne i 10 minutter ved stuetemperatur, mens du lejlighedsvis trykker på bunden af røret for at blande. Drej perlerne ved stuetemperatur i 30 sekunder i en miniaturecentrifuge.Brug en flad spids gel loading tip til at overføre eluted peptider i et nyt rør. Tilsæt 45 mikroliter af 0,15% trifluoretsyre i vand til perlerne. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, mens du banker på bunden af røret lejlighedsvis at blande.Drej perlerne ved stuetemperatur i 30 sekunder i miniaturecentrifugen. Fjern den anden eluering ved hjælp af en flad spids gel loading tip og kombinere det med den første elution. Drej de kombinerede eluterede peptider ved 12.000 gange g i fem minutter ved stuetemperatur for at pellete eventuelle perler, der bærer over.Peptidprøveopløsningen overføres til et nyt 500 mikroliterrør. Byg belastningsmetoden for at indlæse de berigede peptidblandinger på en C18 præ-kolonne chip og afsalt peptiderne igen ved vask med mobile fase A på to mikroliter i minuttet i 10 minutter. Byg kromatografimetoden sådan, at peptider overføres til en analytisk kolonne og elute med en strømningshastighed på 300 nanolitere i minuttet med en to til tre timers gradient ved hjælp af mobile faser A og B.Specifikt skal du bruge en lineær gradient fra 5% mobil fase B til 35% mobil fase B over 80 minutter.Derefter rampe den mobile fase B til 80% over fem minutter derefter holde på 80% B i otte minutter, før du vender tilbage til 5% B for en 25-minutters re-ækvilibrering. Derefter skal du opbygge en MS-instrumentmetode til dataafhængig anskaffelse. Til eksperiment 1 skal du oprette MS1-prækursionsscanning fra M/Z 400 til 1, 500.Indstil varigheden til 120 minutter. Opret et IDA-eksperiment, og klik på OK. Under fanen switch-kriterier skal du angive intensitetstærsklen for at udløse MS/MS-scanninger for ioner af opkrævede tilstande mellem to til fem og 200 tællinger pr. sekund. Indstil den dynamiske udelukkelse af prækursorioner til 60 sekunder.For eksperiment to skal du indstille MS/MS-produktionscanning med et MS2-scanningsområde fra M/Z 100 til 1.500. Klik på redigerparametre, og indstil kollisionsenergispredningen til fem, og vælg den højfølsomhedsproduktscanningstilstand. Til sidst skal du placere prøven i autosampleren.Indsend eksempelkøen, og start anskaffelsesmetoder for LC-MS/MS, der opbygger en MS-instrumentmetode til dataindsamlingsafhængig anskaffelse og definition af to instrumentscanningsforsøg. Udfør MS1-prækursorionscanninger fra 400 til 1, 250 masse for at oplade og indstille varigheden til 120 minutter. Indstil kollisionsenergispredningen til 10 og akkumuleringstid til 45 millisekunder, og vælg derefter den højfølsomme produktionscanningstilstand.Dernæst skal du importere en tekstfil, der indeholder 64 variable vindue DIA SWATH erhvervelse ordning for at udfylde SKÅR erhvervelse vinduer i metoden. I denne erhvervelse ordning, variable vinduer spænder fra fem til 90 masse til opladning og bredde er bestået i trinvise trin over hele massen vifte af 400 til 1, 250 masse til opladning med i alt 64 SWATH segmenter hver med en 45 millisekund akkumuleringstid. Juster MS1-akkumuleringstiden til 0,25 sekunder.Tilsammen skulle MS1-scanningen og 64 MS2-scanninger nu give en samlet cyklustid på 3,2 sekunder. I denne undersøgelse dokumenterede eksperimentelle resultater muligheden for at opdage og vurdere PTM cross-talk. Denne tabel viser, hvordan tidslinjen for arbejdsprocessen og de mængder af prøve og protein, der kræves.One-pot-metoden kan udføres på halvt så lang tid og med halvdelen af antallet af prøver som disse alternative metoder. Mediankoefficienten for variation for de modificerede peptidområder var lavere i en-pot-metoden end i enkelt PTM- og seriel PTM-berigelse. Mens man sammenlignede en-pot PTM-berigelsesmetoderne, var der ingen bemærkelsesværdige forskelle mellem korrelationerne mellem kvantificeringen af lokalitetsniveauet for de to ændringer.Dette tal viser data fra en vellykket berigelse og illustrerer et eksempel for et peptid, der indeholder flere og forskellige acyl modifikationer visualisere PTM cross-talk. Et peptid blev acetyleret på den ene lysinrester og succilynated på den anden, mens her samme peptid blev kortfattet på begge lysiner. Dette viser, at de samme lysinrester kan ændres med begge acylationgrupper, og der er mulighed for krydstale på det pågældende sted.Det er vigtigt at sikre, at hver prøve indeholder den samme mængde perler og sørg for, at ingen af perlerne aspireret ved et uheld, når du vasker peptidbindingsperler. Massespektrometri baseret profilering og dataanalyse i software-værktøjer såsom Spectronaut udføres efter denne procedure for at identificere, kvantificere og udføre lokalisering af PTMs. Denne data-uafhængige erhvervelse workflow i kombination med samtidig PTM berigelse vil åbne veje til mere effektivt at vurdere PTM cross-talk og give bedre indsigt i relevansen af PTM signalering.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Samtidig Multicolor Imaging af biologiske strukturer med Fluorescence Fotoaktivering Lokalisering Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gær Protein ekstraktion og oprensning for Studiet af Function, Interactions og post-translationelle modifikationer

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifikation af post-translationelle modifikationer til planteprotein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantificering af krystallinsk cellulose Ophobning i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots til Monitor Tissue-specifikke Cell Wall Ændringer

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplet Workflow for Analyse af Histon post-translationelle modifikationer Brug Bottom-up-massespektrometri: Fra Histon Extraction til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantificering af lokationsspecifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometrisk ved hjælp af Data-uafhængig erhvervelse massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...