Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Wir würdigen die Unterstützung durch den NIH Shared Instrumentation Grant für das TripleTOF-System am Buck Institute (1S10 OD016281). Diese Arbeit wurde auch vom National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 bis B.S.) und dem National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 an Eric Verdin; R01 DK090242 an Eric Goetzman). X.X. wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIH-Stipendium T32GM8806, an Judith Campisi und Lisa Ellerby) unterstützt, N.B. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der Glenn Foundation for Medical Research unterstützt.

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V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Technik zur gleichzeitigen mehrfachen PTM-Anreicherung, um PTM-Übersprechen effektiver zu verstehen. Alternative Methoden zur Erreichung dieses Ziels sind in der Regel unerschwinglich zeitaufwändig und teuer, und sie erfordern große Mengen an Protein, um erfolgreich zu sein11,13. Dieses Protokoll stellt einen Multi-PTM-Anreicherungsworkflow dar, der die Inkubation in antikörperkonjugierten Perlen für zwei PTMs gleichzeitig beinhaltet, um die Gesamteffizienz des Experiments zu verbessern. Diese Methode beinhaltet auch die Verwendung von DDA für die Erzeugung von Spektralbibliotheken und DIA MS-Erfassungen, um die Peptide zu erkennen und zu quantifizieren, die mit reduzierten Interferenzen von Fragmentionen22,23vorhanden sind. Softwareprogramme, wie z. B. MS-Datenbanksuchmaschinen, werden verwendet, um Daten aus DDA-Akquisitionen zu analysieren und zu quantifizieren, während quantitative Proteomics Software24 und spezifische DIA Quantitative Analysis Software25 notwendig sind, um die komplexen Spektren zu interpretieren, die durch DIA-Akquisitionen erzeugt werden.
Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls, die sorgfältig befolgt werden sollten. Da das Hauptziel des Protokolls darin besteht, mehrere PTMs gleichzeitig anzureichern, ist der Anti-Antikörper-Affinitätsanreicherungsschritt (Abschnitt 2) entscheidend für den Erfolg des Experiments. Bei der Durchführung von Wärteilen an den Perlen ist es notwendig, sicherzustellen, dass keine der Perlen versehentlich angesaugt wird. Es ist auch notwendig, dass die Harnstoffkonzentration vor der Verdauung mit Trypsin (Schritt 1.8) auf 1 M verdünnt wurde. Obwohl 8 M Harnstoff früher im Protokoll zur Proteinlöslichkeit benötigt wird, hemmen Harnstoffkonzentrationen über 1 M die enzymatische Aktivität von Trypsin. Darüber hinaus ist es wichtig, den pH-Wert der Probe im gesamten Protokoll konsequent zu überprüfen. Dies ist besonders wichtig vor der Verdauung. Wenn der pH-Wert der Probe und die Trypsin-Lösung vor der Inkubation nicht angemessen neutralisiert werden, kann dies zu einer ineffizienten Verdauung führen, bei der viele Dekolleté-Stellen übersehen werden können, was zu weniger Peptid-Identifikationen führen kann.
Einige Änderungen am Protokoll können beim Vorbereiten von Beispielen hilfreich sein. Für ein Proteinlysat, das aus 1 mg Ausgangsmaterial beschafft wird, kann ein Viertel der in jedem PTM-Scanrohr enthaltenen Antikörperperlen als kostengünstige Alternative verwendet werden. Eine größere Menge an Ausgangsmaterial kann für bessere Ergebnisse verwendet werden, solange die Menge der verwendeten Antikörperperlen proportional erhöht wird. Eine weitere Änderung, die den Workflow verbessern kann, ist, Proben mit einer anderen Protease zusätzlich zu Trypsin zu verdauen. Diese Änderung würde zu einer größeren Variabilität der geklammerten Peptide führen und eine erhöhte Abdeckung von Proteinrückständen bieten. Obwohl nicht notwendig, wird empfohlen, dass Trypsin eines der Enzyme für die PTM-Analyse aufgrund seiner hohen Spaltungssspezifität26sein sollte.
Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die untersuchten PTMs ähnliche Chemikalien benötigen, um gleichzeitig angereichert zu werden14. Die Verfahren für die verschiedenen Antikörperkonjugatierten Perlen müssen ähnlich sein und ähnliche Lösungsmittel und Lösungen, einschließlich ähnlicher Elutionsbedingungen, und vorzugsweise vom gleichen Anbieter verwenden. Aus diesem Grund verwendet die hier skizzierte Methode konsequent Acetylierung und Prägnantierung als Beispiel, die beide antikörperkonjugierte Perlen verwenden (Cell Signaling Technology, Inc). Obwohl diese Methode theoretisch auf eine beliebige Anzahl von PTM angewendet werden kann, wären zusätzliche Studien erforderlich, um die genaue Einschränkung des Protokolls in dieser Hinsicht zu bewerten. Da es sich um eine Antikörper-basierte Anreicherungsmethode handelt, kann die Methode nur eine relative Quantifizierung von PTM-Standorten ermöglichen.
Im Vergleich zu bestehenden Multi-PTM-Anreicherungsmethoden ist dieser Workflow eine praktikablere und kostengünstigere Alternative. Aus diesem Experiment wurde festgestellt, dass die Wirksamkeit dieser Methode sehr gut mit alternativen Methoden wie individuellen oder seriellen Anreicherungen verglichen wird. Abbildung 2B zeigt, dass der mediane CV für modifizierte Peptidspitzenbereiche im Ein-Topf-Verfahren im Vergleich zu Ein-PTM-Anreicherungen und seriellen PTM-Anreicherungen13tatsächlich verringert wurde. Wir analysierten weiter die experimentellen Ergebnisse, die Quantifizierungen auf Standortebene für Acetylierung oder Präsination bewerten. Darüber hinaus zeigte die Spearman-Korrelationsanalyse (Abbildung 2C,D) , dass die PTM-Anreicherung mit einem Topf ähnlich wie die Single-PTM-Anreicherungs-Workflows abspielte. Dies galt auch für die Peptid- und Fragment-Korrelationen. Die gleiche Beobachtung wurde für alle drei Korrelationen beim Vergleich von Ein-Topf mit serieller PTM-Anreicherung durchgeführt.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, faszinierende biologische Einblicke in PTM-Übergespräche auf schnelle und kostengünstige Weise zu machen. Die DIA-Komponente des Workflows ermöglicht es Forschern, mehr über PTMs zu verstehen, da sie Informationen über die Standortlokalisierung liefert und Herausforderungen wie die geringe Auslastung von PTMs vor Ort bewältigt. Vorläuferionen werden mit DDA tendenziell ausgeschlossen, was besonders wichtig ist, wenn ptMs untersucht werden, da die Auslastung der Standorte oft so niedrig ist, dass diese Peptide nicht für MS/MS ausgewählt werden, aber dennoch wichtige Informationen enthalten. Nachholexperimente könnten durchgeführt werden, um die Obergrenze zu bewerten, wie viele PTMs mit dieser Methode gleichzeitig angereichert werden können. Eine zukünftige Verbesserung dieses Workflows kann die Entwicklung fortschrittlicherer Softwareplattformen umfassen, um die Analyse der Standortlokalisierung und der Auslastung der PTM-Standorte weiter zu automatisieren.

Eine Vielzahl von post-translationalen Modifikationen regulieren dynamisch Proteine und Bahnen durch Effekte auf die Aktivität1, Signalisierung2und Umsatz3,4. Zum Beispiel werden Proteinkiinasen durch Zugabe von Phosphatgruppen5aktiviert oder deaktiviert, und Histonacetylierung und andere Modifikationen bieten einen Mechanismus, um die Chromatinstruktur zu ändern und als transkriptionelle Regulierungsmechanismen6,7zu dienen. In den letzten Jahren hat sich der Beweis, dass mehrere PTMs arbeiten in Konzert oder konkurrieren, um Proteinfunktion oder Aktivität zu regulieren8,9,10,11. Daher ist das Verständnis von PTM-Crosstalk ein aufkommender Bedarf in der PTM-Forschung. Die meisten verfügbaren proteomischen Workflows zum Identifizieren und Quantifizieren von PTM-Sites konzentrieren sich jedoch auf einzelne Modifikationen und nicht auf das Zusammenspiel mehrerer Änderungen. Der beschriebene Workflow korreliert spezifische Proteinmodifikationen "Hot-Spots" und Lysinrückstände, die durch mehrere verschiedene PTMs modifiziert werden.
In der wissenschaftlichen Gemeinschaft wächst der Bedarf an praktikablen Methoden, um mehrere PTMs gleichzeitig zu untersuchen12. Die meisten Methoden zur globalen Identifizierung und Quantifizierung der Standorte mehrerer Arten von PTMs sind aufgrund der hohen Kosten und der menge des erforderlichen Gewebes eine Herausforderung12,13. Multi-PTM-Anreicherungsexperimente sind nicht nur zeitaufwändig in Bezug auf Probenvorbereitung, Datenerfassung und Datenanalyse, sondern diese Studien erfordern in der Regel große und oft unerschwingliche Mengen an Protein11. Hier wird ein Protokoll zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse mehrerer PTMs beschrieben, das auch mehrere dieser Barrieren anspricht und eine groß angelegte PTM-Profilerstellung und Diebewertung von Crosstalk zwischen verschiedenen PTMs14ermöglicht. Dieser Ein-Topf-Workflow skizziert eine praktische Möglichkeit für biomedizinische Forscher, mehrere PTMs global zu profilieren, co-modifizierte Peptide zu identifizieren und PTM-Übersprechen auf effiziente und kostengünstige Weise zu untersuchen14,15.
Hier wird diese Methode durch die Untersuchung der mitochondrialen Proteinacylierung gezeigt, die erstmals vor über 50 Jahren untersucht wurde16. Es konzentriert sich speziell auf Lysin-Acetylierung17 und Präsinylierung18, einschließlich des Ko-Vorkommens dieser Modifikationen an Proteinen und sogar Co-Modifikation auf Peptidebene. Da die Studie ein Sirtuin 5 (SIRT5) Knockout-Maus-Modell verwendet, wurde es ausgewählt, sich auf die Anreicherung von Acetylierungs- und Bernstein-Sites zu konzentrieren. Diese Entscheidung wurde getroffen, weil Prägnsalverfahren Ziele von SIRT5 Desuccinylase sind und daher erwartet werden, dass sie bei KO-Mäusen eine signifikante Upregulation aufweisen, was sie in diesem Fall zu den relevantesten PTMs macht. Beide PTMs sind biologisch relevant, wie kürzlich von Carrico et al.19zusammengefasst. Im Allgemeinen zeigt acetylierung wichtige Auswirkungen auf die Genexpression und den Stoffwechsel, und Succinylierung wurde berichtet, um den Herzstoffwechsel und Die Funktion zu regulieren20.
Das beschriebene Protokoll kann mit einer geringen Menge an Protein-Eingangsmaterial (z. B. 1 mg Proteinlysat) durchgeführt werden und reduziert die Gesamtdauer des Experiments, indem die Fürlange für die Probenverarbeitung, MS-Erfassung und Datenanalyse reduziert wird. Ein Workflowschema ist in Abbildung 1angegeben. Wir haben auch noch geringere Mengen an Ausgangsmaterial verwendet (bis zu 100 g Proteinlysat, das die entsprechend verwendeten Perlenmengen reduziert), was erwartungsgemäß die Gesamtausbeute der identifizierten azylaten Peptide reduziert; Es liefert jedoch immer noch sehr wertvolle Ergebnisse und quantifizierbare acylated Peptide.
Während so genannte Top-Down- oder Middle-Down-Workflows in der Regel keine proteolytischen Verdauungsansätze verwenden (und somit die Konnektivität mehrerer PTMs innerhalb eines Proteins beibehalten), konzentriert sich dieses Protokoll auf einen Peptid-basierten Affinitätsanreicherungsansatz, um zusätzliche Tiefe und Empfindlichkeit für die PTM-Identifikation und -Quantifizierung zu erhalten (Abbildung 1). Darüber hinaus nutzt dieser peptidzentrierte Workflow moderne Massenspektrometriemethoden, einschließlich 1) einer Kombination aus datenabhängiger Erfassung (DDA) zur Erzeugung von Spektralbibliotheken und 2) datenunabhängiger Erfassung (DIA) für eine genaue PTM-Quantifizierung in einem etikettenfreien Workflow.
DIA-Workflows überwinden die Sampling-Stochasticity typischer DDA-Scanschemata, indem alle Peptidsignale innerhalb des abgetasteten m/z-Bereichs21umfassend fragmentiert werden. Diese Funktion ist auch äußerst vorteilhaft in Bezug auf die Lokalisierung der Site, weil es einfacher ist, Informationen darüber zu erhalten, welche spezifischen Fragmentionen innerhalb des Peptids modifiziert werden. Darüber hinaus ermöglichen DIA-Workflows die Identifizierung und Quantifizierung kleinerptamischer Peptid-Isoformen mit identischen Vorläuferionen. DIA-Methoden können auch eine spezifische PTM-Standortlokalisierung innerhalb eines Peptids auf der Grundlage spezifischer entsprechender Fragmentionen bestimmen, die jederzeit umfassend gemessen werden. DDA-Ansätze verwenden jedoch häufig "dynamische Ausschluss"-Funktionen, die eine mehrfache Probenahme von MS/MS für dasselbe Vorläuferion ausschließen, wodurch kleinere PTM-Isoformen fehlen.
Die hier beschriebene Strategie zur gleichzeitigen Anreicherung eignet sich ideal für Studien, die von der globalen Profilierung und Quantifizierung mehrerer PTMs, der Untersuchung von PTM-Crosstalk und dem Verständnis der dynamischen Wechselwirkungen posttranslationaler Modifikationen profitieren. Die Identifizierung mehrerer angereicherter PTMs in einem kombinierten Workflow wurde beschrieben durch: globale, serielle oder parallele Anreicherung von PTM, das proteolytische Peptide enthält, oder alternativ durch die Analyse intakter Proteine. Im direkten Vergleich mit der seriellen Anreicherung von Acetylierung und Präsination wurde die Effizienz der Ein-Topf-Methodik als sehr ähnlich14festgelegt. Diese alternativen Protokolle erfordern erhebliche Mengen an Ausgangsmaterial und Zeit und können unerschwinglich teuer sein. Im Gegensatz dazu bietet das One-Pot-Protokoll eine kostengünstige und effiziente Methode zur Anreicherung von mehr als einem PTM mit anschließender Analyse und Identifikation.
Mauslebergewebe werden von SIRT5 Knockout-Mäusen gewonnen und hier als Ausgangsmaterial verwendet. Dieses Protokoll kann auch für Proteinlysate aus verschiedenen Geweben oder Zellkulturexperimenten durchgeführt werden. Dieses Protokoll kann auf Proteinlysate angewendet werden, die aus Geweben oder Zellkulturpellets gewonnen werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

Das Studium mehrerer posttranslationaler Modifikationen (PTMs) von Proteinen ist ein entscheidender Schritt, um PTM-Übersprachung zu verstehen und ganzheitlichere Einblicke in die Proteinfunktion zu gewinnen. Trotz der Bedeutung von Multi-PTM-Anreicherungsstudien untersuchen nur wenige Studien mehr als ein PTM gleichzeitig, was teilweise auf die Kosten, die Zeit und die großen Proteinmengen zurückzuführen ist, die für die Durchführung mehrerer globaler proteomischer Analysen von PTM erforderlich sind. Die in diesem Protokoll beschriebene "Ein-Topf"-Affinitätsanreicherung überwindet diese Barrieren, indem sie die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Peptiden mit Lysinrückständen ermöglicht, die Acetylierungs- und Präsinylierungs-PTM mit geringen Probenmengen enthalten. Eingabe. Das Protokoll umfasst die Herstellung von Proteinlysat aus Mauslebern von SIRT5-Knockout-Mäusen, die Leistung der Trypsin-Verdauung, die Anreicherung für PTMs und die Durchführung von Massenspektrometrie-Analysen mit einem datenunabhängigen Erfassungsworkflow (DIA). Da dieser Workflow die gleichzeitige Anreicherung von zwei PTMs aus derselben Probe ermöglicht, bietet er ein praktisches Werkzeug, um PTM-Übersprechen zu untersuchen, ohne dass große Probenmengen erforderlich sind, und reduziert den Zeitaufwand für die Probenvorbereitung und -daten erheblich. Akquisition und Analyse. Die DIA-Komponente des Workflows bietet umfassende PTM-spezifische Informationen. Dies ist besonders wichtig, wenn die PTM-Standortlokalisierung untersucht wird, da DIA umfassende Sätze von Fragmentionen bereitstellt, die rechnerisch entschlüsselt werden können, um zwischen verschiedenen PTM-Lokalisierungsisoformen zu unterscheiden.

Abbildung 1 zeigt ein allgemeines Diagramm des Arbeitsablaufs, einschließlich der Entnahme des Gewebes aus Derlebern, der Verwendung von 1 mg Protein zur Verdauung des Proteinlysats mit Trypsin, der Inkubation von Peptiden mit antikörperkonjugierten Perlen, dem Erwerb der Proben auf der MS und schließlich der Durchführung einer DIA/SWATH-Analyse der Daten unter Verwendung verschiedener quantitativer Proteomik-Softwarepakete (akademische und kommerzielle).
Abbildung 2A zeigt, wie die Zeitachse des Workflows und die Menge an Proben und Proteinen im Vergleich zu alternativen Methoden, die derzeit für Multi-PTM-Anreicherungsstudien verwendet werden, verglichen sind. Die Ein-Topf-Methode kann in der Hälfte der Zeit und mit der Hälfte der Anzahl der Proben als diese alternativen Methoden durchgeführt werden. Im Vergleich zur zwei Single-PTM-Anreicherungsmethode benötigt das One-Pot-Protokoll auch die Hälfte der Proteinmenge.
Dieses Protokoll hat sich als praktikable und kostengünstige Alternative erwiesen. Abbildung 2B zeigt, dass der Mittlere Variationskoeffizient (CV) für modifizierte Peptidbereiche bei der Ein-Topf-Methode niedriger war als bei den Anreicherungen für Einzelne-PTM und serielle PTM. Abbildung 2C,D zeigt, dass beim Vergleich der Ein-Topf-PTM- und der Ein-PTM-Anreicherungsmethoden keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Korrelationen der Quantifizierungen auf Standortebene für die beiden Modifikationen erkennbar waren. Dies galt auch für die Peptid-Ebene und Fragment-Ebene Korrelationen. Die gleiche Beobachtung wurde für alle drei Korrelationen beim Vergleich der Ein-Topf- und Derserien-PTM-Anreicherung engt. Alle zugrunde liegenden MS-Rohdaten und verarbeiteten Excel-Ergebnisblätter, die einem aktuellen Bericht von Basisty et al.14 zugeordnet sind, sind verfügbar und können von MassIVE (MSV00081906) und ProteomeXchange (PXD008640) heruntergeladen werden.
Im Allgemeinen können Antikörperanreicherungsstrategien zwar bestimmte Einschränkungen aufweisen, wie z. B. potenzielle Epitopverschluss oder begrenzte Spezifität, aber die in dieser Studie verwendeten Antikörper sind Mischungen unabhängig erzeugter Klone und bieten somit Besonderheiten.
Experimentelle Ergebnisse dokumentieren die Möglichkeit, PTM-Übersprechen zu erkennen und zu bewerten. Abbildung 3 zeigt Daten aus einer erfolgreichen Anreicherung und zeigt ein Beispiel für ein Peptid, das mehrere und verschiedene Acylmodifikationen enthält, die PTM-Übersprache visualisieren. Abbildung 3A zeigt ein Peptid, das auf einem Lysinrückstand acetyliert und auf dem anderen prägnant ist, und Abbildung 3B zeigt dasselbe Peptid, das bei beiden Lysinen prägnant ist. Dies zeigt, dass derselbe Lysinrückstand mit beiden Acylationsgruppen modifiziert werden kann, und es besteht die Möglichkeit, dass an dieser Stelle ein Übersprechen auftritt. Abbildung 4 zeigt die Anzahl der Lysinrückstände, die wie in den Abschnitten 7.1-7.3 beschrieben identifiziert wurden, um beide Modifikationen zu tragen, was auch auf ein mögliches PTM-Übersprechen hindeutet.
Wie Abbildung 5 zeigt, können wir bei der Verarbeitung von DIA PTM-Datensätzen mit quantitativer Proteomik-Software ermitteln, welche spezifischen Lysinrückstände modifiziert werden. Dies ist ein Konzept, das als Standortlokalisierung bekannt ist, was ein wesentlicher Schritt für jede Analyse zur Bestimmung eines möglichen PTM-Überlaufs ist. Abbildung 5 zeigt zwei potentielle Isoformen zusammen mit den bestätigenden und widerbbenden Ionen für jede, die visualisiert und bewertet werden könnte, wie in den Abschnitten 8.1-8.3 beschrieben (insbesondere die Schritte 8.3.2 und 8.3.3). Auf der Grundlage dieser Informationen konnten wir sicher feststellen, welche der beiden Isoformen in der Originalprobe vorhanden war. Das MS/MS-Spektrum der bestätigten Isoform KQYGEAFEKacR zeigt deutlich, dass die y-Ionen (y2-y5), die den acetylierten Lysinrückstand enthalten, der sich um 42 m/z (die Inkrementmasse einer Acetylgruppe) verschoben hat, den spezifischen Lysinrückstand im modifizierten Peptid bestätigten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> Abbildung 1: Typischer Workflow für die Anreicherung von PTMs mit einem Topf. Gewebe (hier Lebern) werden von SIRT5 KO und Wildtyp (WT) Mäusen geerntet, und Proteine werden lysiert, Trypsin-verdaut in Peptide, und entsalzt. Peptide werden dann durch Immunaffinität mit Kombinationen von Succinyl- und Acetyl-Antikörperperlen angereichert. Parallele MS-Workflows messen sowohl 1) kleine Aliquots von Veränderungen der ganzen Lysatproteinexpression (zur Proteinnormalisierung) als auch 2) angereicherte acylhaltige Peptide zur Identifizierung der Acylierungsstelle (DDA-MS) und der Standortlokalisierung, gefolgt von der Quantifizierung (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> Abbildung 2: Vergleich des Ein-Topf-Workflows mit alternativen Methoden. (A) Vergleich von Zeit, Kosten und Materialien, die für den Ein-Topf-Workflow, die serielle PTM-Anreicherung und zwei Einzel-PTM-Anreicherungen erforderlich sind. (B) Vergleich von Lebensläufen zwischen dem Ein-Topf-Workflow, der einmaligen Acetyllysin-PTM-Anreicherung und der einzelnen Succinyllysin-PTM-Anreicherung. Spearman-Korrelationsanalyse zum Vergleich der Acylpeptid-Spitzenbereiche, die aus dem Ein-Topf-Workflow gewonnen wurden, und der Ein-PTM-Anreicherung: entsprechende Diagramme der log2-Spitzenflächenergebnisse für (C) Acetylierungsstellen und (D) Prägnannylierungsstellen. Regressionsneigungen und Korrelationsfaktoren sind in den einzelnen Panels14angegeben. Für jede der Bedingungen wurden zwei unabhängige biologische Repliken verarbeitet. Diese Zahl wurde von Basisty et al.14geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> Abbildung 3: Crosstalk zwischen Acetylierung und Präsinylierungsmodifikationen von Lysinrückständen. MS/MS-Spektren tryptischer Peptide aus mitochondrialen 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, aber bei zwei Lysinrückständen mit unterschiedlichen PTMs modifiziert wurden. (A) MS/MS des Peptids AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK und (B) MS/MS des Peptids AANEAGY Diese Zahl wurde von Basisty et al.14geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> Abbildung 4: Überlappung und Übersprechen zwischen den acetylierten und prägnanten Lysinrückständen – spezifische Beispiele in Proteinkomplexen. (A) Venn-Diagramm mit Überlappung zwischen 2.235 Acetylierung und 2.173 Präsinylierungsstellen. Davon wurden 943 Standorte sowohl acetyliert als auch prägnant. Leber aus einer SIRT5 (De-Succinylase) Knockout-Maus wurde analysiert, und viele Präsinationsstellen wurden identifiziert. Tatsächlich waren sie häufiger als normalerweise in der Mausleber beobachtet (modifizierte Peptide wurden mit einem Q-Wert von <0,05 gefiltert). (B) Proteinkomplexe, die den Prozentsatz ihrer Untereinheiten zeigen, die sowohl acetylierte als auch prägnante Stellen enthalten (fette rote Linie stellt die Bedeutung dar, die durch Fishers genauen Test bestimmt wird). (C) Diagramm des ATP-Synthase-Komplexes: Protein-Untereinheiten in Rot stellen die Untereinheiten dar, die sowohl acetylierte als auch prägnante Stellen enthalten. Diese Zahl wurde von Basisty et al.14geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> Abbildung 5: Quantitative Proteomik-Software entschlüsselt die Lokalisierung der Peptid-Site von PTMs. Basierend auf der MS/MS-Fragmentierung des Peptids ist es möglich, Informationen über die spezifischen Lysinrückstände bereitzustellen, die die Acetylgruppe ändert. Dies zeigt die Fähigkeit der Software, wertvolle Informationen vor Ort Lokalisierung von PTMs bieten. (A) Zwei Möglichkeiten der Lysin-Rückstandsmodifikation und PTM-Standortlokalisierung: KQYGEAFEKacR (links) und KacQYGEAFEKR (rechts). "Bestätigen" und "Widerlegung" Fragmentionen werden für jede der potenziellen Standortlokalisierung isoformen des Peptids gezeigt. Basierend auf diesen Informationen werden bestätigende Und widerlegende Ergebnisse zugewiesen, was das Vorhandensein von Isoform KQYGEAFEKac Rin der Probe bestätigt. (B) MS/MS-Spektrum entsprechend der bestätigten Isoform KQYGEAFEKacR, was darauf hinweist, dass alle y-Ionen einschließlich des acetylhaltigen Lysinrückstands (y2 und höher) eine Inkrementmasse von +42 m/z aufweisen, was der Acetylmodifikation entspricht. Beobachtete b-Ionen enthalten die Modifikation nicht. (C) Extrahiertes Ionenchromatogramm (XIC) mit reichlich Spitzenflächen aus y2 und y3 Ionen, die beide die Acetylierungsstelle in der bestätigten Isoform KQYGEAFEKacR <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Dieses Protokoll beschreibt die neuartige Technik zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTMs mit Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in die Standortlokalisierung und Cross-Talk zu gewinnen. Dies ist eine zeit- und kosteneffektive Technik, die die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Peptiden mit Schneiden ermöglicht, die Acetylierungs- und Präsinylierungs-PTMs mit nur geringen Mengen an Probeneingaben enthalten. Das Nachverfolgen von post-translationalen Modifikationen ist ein wichtiger Schritt bei der Charakterisierung und Bekämpfung verschiedener Krankheitszustände.Wir sind uns bereits bewusst, dass bestimmte Krebsarten und Diabetes durch diese Proteinmodifikationen stark reguliert sind. Diese Methode kann theoretisch auf alle PTMs mit Antikörpern zur Anreicherung wie Ubiquitination, Phosphorylierung und andere angewendet werden. Es kann auch auf andere Gewebetypen oder Zellkulturmodelle angewendet werden.Der Schlüssel zur Gewinnung wertvoller Daten mit dieser Technik ist die Reproduzierbarkeit. Dies kann erreicht werden, indem sichergestellt wird, dass alle Schritte sehr sorgfältig durchgeführt werden, insbesondere die Schritte mit den Antikörperperlen. Zu Beginn erhalten Sie Kartuschen, die C18-Harz enthalten, die bis zu 10 Milligramm Protein kombiniert.Montieren Sie diese Patronen in ein Vakuumgerät. Fügen Sie 800 Mikroliter 80%Acetonitril und 0,2% Ameisensäure zu den Kartuschen mit 19,8% Wasser hinzu und starten Sie die Vakuumabsaugung, um die Flüssigkeit durchzuziehen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um eine vollständige Trocknung der Patronen zu vermeiden.Ausgleichen Sie die Patronen, indem Sie 800 Mikroliter 0,2% Ameisensäure in Wasser mit Vakuumabsaugung hinzufügen. Wiederholen Sie dies zweimal. Ein Milligramm Peptide in ca. 1.000 Mikroliter Lösung mit Vakuumabsaugung auf die Kartuschen laden.Waschen Sie die Peptide zweimal mit 800 Mikrolitern 0,2% Ameisensäure in Wasser unter Vakuumabsaugung. Dann 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre unter jeder Patrone anordnen, um das Peptid zu sammeln. Unter Vakuumabsaugung werden die Peptide von Kartuschen zuerst mit 800 Mikrolitern 80%acetonitril und 0,2% Ameisensäure in 19,8% Wasser und dann mit 400 Mikrolitern derselben Lösung.Trocknen Sie die entsalzten Peptidproben zwei bis drei Stunden lang vollständig in einem Vakuumkonzentrator. Setzen Sie nun die getrockneten Peptide in 1,4 Milliliter kaltem 1X Immunaffinitätsreinigungspuffer wieder auf. Wirbel zu mischen und einen pH-Wert von ca. 7 zu gewährleisten.Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Ein kleines Pellet erscheint. Legen Sie die Peptide beiseite auf Eis, während Sie Antikörperperlen vorbereiten.Fügen Sie einen Milliliter kalte 1X PBS in ein Rohr mit 100 Mikroliter K-Acetyl-Antikörper-Perlenschlämme und eine Tube mit 100 Mikroliter K-Succinyl-Antikörper-Perlenschlämme und mischen Sie durch Pipettiern. Übertragen Sie die gesamte Lösung auf neue 1,5-Milliliter-Rohre und drehen Sie sie in einer Miniaturzentrifuge 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die PBS darauf, keine Perlen abzusehen.Wiederholen Sie die Wäsche dreimal. Als nächstes, resuspendieren Sie die Perlen in etwa 440 Mikroliter PBS. Pipette die Perlen mehrmals gut mischen.Mit 200 Mikroliter Vorschnitten 100 Mikroliter jeder Acetyllysin-Antikörperperlen und Succinyllysin-Antikörperperlen in ein neues Rohr geben. Drehen Sie 30 Sekunden in einer Miniaturzentrifuge nach unten und aspirieren Sie die Medien mit einer Gelladerspitze ab. Die Perlen werden jetzt weiß.Das resuspendierte Peptid direkt auf die gewaschenen Perlen pfeifen und die Peptide mit Perlen bei vier Grad Celsius über Nacht mit Aufregung bebrüten. Am Morgen drehen Sie die Peptidproben bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, der ungebundene Peptide enthält, und speichern Sie ihn bei zukünftigen Experimenten, falls gewünscht.Fügen Sie einen Milliliter kalten 1X Immunaffinitätsreinigungspuffer zu den Perlen hinzu, um sie zu waschen und zu mischen, indem Sie fünfmal invertieren. Drehen Sie bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Die Immunaffinitätsreinigungslösung absaugen und den Reinigungsschritt der Immunoaffinität noch einmal wiederholen.Dann fügen Sie einen Milliliter kaltes HPLC-Wasser in die Perlen und mischen, indem Sie fünfmal invertieren. Drehen Sie bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Das Wasser absaugen und den Wasserwaschschritt zwei weitere Male wiederholen.Drehen Sie eine zusätzliche Zeit bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius, um das verbleibende Wasser im Boden der Röhre zu sammeln. Mit flach gekippten Gel-Ladespitzen, aspirieren Sie jedes zusätzliche Wasser, das gesammelt haben. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu beaspirieren.55 Mikroliter 0,15% Trifluoressigsäure in Wasser zu den Perlen geben. Inkubieren Sie die Perlen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, während gelegentlich tippen Sie auf den Boden des Rohres zu mischen. Drehen Sie die Perlen bei Raumtemperatur für 30 Sekunden in einer Miniaturzentrifuge.Verwenden Sie eine flache gekippte Gel-Ladespitze, um die eluierten Peptide in ein neues Rohr zu übertragen. 45 Mikroliter 0,15% Trifluoressigsäure in Wasser zu den Perlen geben. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, während Sie gelegentlich auf den Boden des Rohres tippen, um sie zu mischen.Drehen Sie die Perlen bei Raumtemperatur für 30 Sekunden in der Miniaturzentrifuge. Entfernen Sie die zweite Elution mit einer flachen gekippten Gel-Ladespitze und kombinieren Sie sie mit der ersten Elution. Drehen Sie die kombinierten eluierten Peptide bei 12.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um alle Perlen, die übertragen, zu pellet.Übertragen Sie die Peptid-Probenlösung in eine neue 500-Mikroliter-Röhre. Bauen Sie die Lademethode auf, um die angereicherten Peptidmischungen auf einen C18-Vorsäulenchip zu laden und die Peptide wieder zu entsalzen, indem Sie mit der mobilen Phase A mit zwei Mikrolitern pro Minute 10 Minuten waschen. Erstellen Sie die Chromatographie-Methode so, dass Peptide in eine analytische Säule übertragen werden und mit einer Durchflussrate von 300 Nanolitern pro Minute mit einem zwei- bis dreistündigen Gradienten mit den mobilen Phasen A und B eine geschwindigkeit von 35 % betragen.Anschließend wird die mobile Phase B über fünf Minuten auf 80 % hochgefahren und dann acht Minuten lang bei 80 %B halten, bevor sie für eine 25-minütige Wiederabgleich auf 5%B zurückkehrt. Erstellen Sie als Nächstes eine MS-Instrumentmethode für die datenabhängige Erfassung. Richten Sie für Versuch 1 den MS1-Vorläuferionenscan von M/Z 400 bis 1, 500 ein.Stellen Sie die Dauer auf 120 Minuten ein. Erstellen Sie ein IDA-Experiment, und klicken Sie auf OK. Legen Sie unter der Registerkarte Schalterkriterien den Intensitätsschwellenwert fest, um MS/MS-Scans für Ionen geladener Zustände zwischen zwei und fünf bis 200 Zählungen pro Sekunde auszulösen. Stellen Sie den dynamischen Ausschluss von Vorläuferionen auf 60 Sekunden ein.Für Versuch zwei stellen Sie ms/MS-Produktionenscan mit einem MS2-Scanbereich von M/Z 100 bis 1, 500 ein. Klicken Sie auf Parameter bearbeiten, und stellen Sie die Kollisionsenergiestreuung auf fünf ein, und wählen Sie den Hochempfindlichkeits-Produkt-Ionen-Scan-Modus aus. Platzieren Sie die Probe schließlich im Autosampler.Senden Sie die Beispielwarteschlange und starten Sie LC-MS/MS-Erfassungsmethoden, indem Sie eine MS-Instrumentenmethode für die datenunabhängige Erfassung erstellen und zwei Instrumentenscanexperimente definieren. Führen Sie MS1-Vorläuferionenscans von 400 bis 1, 250 Masse aufundladen und stellen Sie die Dauer auf 120 Minuten ein. Stellen Sie die Kollisionsenergieausbreitung auf 10 und die Akkumulationszeit auf 45 Millisekunden ein und wählen Sie dann den Hochempfindlichkeits-Produkt-Ionen-Scan-Modus aus.Importieren Sie anschließend eine Textdatei mit dem 64-Variablenfenster DIA SWATH-Erfassungsschema, um SWATH-Erfassungsfenster in die Methode aufzufüllen. In diesem Erfassungsschema werden variable Fenster von fünf bis 90 Masse bis Ladung und Breite in schrittweisen Schritten über den gesamten Massenbereich von 400 bis 1, 250 Masse mit insgesamt 64 SWATH-Segmenten mit einer Akkumulationszeit von 45 Millisekunden übertragen. Passen Sie die MS1-Akkumulationszeit auf 0,25 Sekunden an.Zusammen sollen der MS1-Scan und 64 MS2-Scans nun eine Gesamtzykluszeit von 3,2 Sekunden ergeben. In dieser Studie dokumentierten experimentelle Ergebnisse die Möglichkeit, PTM-Cross-Talk zu erkennen und zu bewerten. Diese Tabelle zeigt, wie die Zeitachse des Workflows und die Menge an Proben und Protein enthont werden.Die Ein-Topf-Methode kann in der Hälfte der Zeit und mit der Hälfte der Anzahl der Proben als diese alternativen Methoden durchgeführt werden. Der mittlere Variationskoeffizient für die modifizierten Peptidbereiche war bei der Ein-Topf-Methode niedriger als bei der einzelnen PTM- und seriellen PTM-Anreicherung. Beim Vergleich der Ein-Topf-PTM- und der einzelnen PTM-Anreicherungsmethoden waren keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Korrelationen der Quantifizierung auf Standortebene für die beiden Modifikationen erkennbar.Diese Abbildung zeigt Daten aus einer erfolgreichen Anreicherung und veranschaulicht ein Beispiel für ein Peptid, das mehrere und verschiedene Acylmodifikationen enthält, die PTM-Cross-Talk visualisieren. Ein Peptid wurde auf einem Lysinrückstand acetylaced iert und auf dem anderen prägnant, während hier das gleiche Peptid bei beiden Lysinen prägnant war. Dies zeigt, dass der gleiche Lysinrückstand mit beiden Acylationsgruppen modifiziert werden kann und es die Möglichkeit gibt, an dieser Stelle Zusprechgespräche zu führen.Es ist wichtig, sicherzustellen, dass jede Probe die gleiche Menge an Perlen enthält und sicherzustellen, dass keine der Perlen versehentlich beim Waschen von Peptid-Bindungsperlen angesaugt wird. Massenspektrometrie-basierte Profilerstellung und Datenanalyse in Software-Tools wie Spectronaut werden nach diesem Verfahren durchgeführt, um die Standortlokalisierung von PTMs zu identifizieren, zu quantifizieren und durchzuführen. Dieser datenunabhängige Erfassungsworkflow in Kombination mit gleichzeitiger PTM-Anreicherung wird Wege eröffnen, PTM-Cross-Talk effizienter zu bewerten und bessere Einblicke in die Relevanz der PTM-Signalisierung zu geben.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Principles of ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Forschung

Biologie

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Technik zur Analyse von Zelltyp-spezifischen Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...