Name: simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

אנו מכירים בתמיכה מתוך מענק מכשור משותף NIH עבור מערכת הטריפלתוף במכון באק (1S10 OD016281). עבודה זו הייתה נתמכת גם על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (R01 AI108255 to בולשיט) והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R24 DK085610 לאריק Verdin; R01 DK090242 לאריק גועצממן). X.X. היה נתמך על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות (NIH גרנט T32GM8806, לג Campisi ו ליסה Ellerby), N.B. היה נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקרן גלן למחקר רפואי.

<ol>
	<li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Protein+Acetylation:+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions.">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).</li><li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+in+signal+integration.">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li><li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases.">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation.">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms.">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control.">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li><li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer.">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li><li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination.">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li><li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach.">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li><li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+level+of+complexity:+crosstalk+of+posttranslational+modifications.">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li><li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+'One-Pot'+Affinity+Enrichment.">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation.">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways.">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks.">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li><li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Acylome+Emerges:+Proteomics,+Regulation+by+Sirtuins,+and+Metabolic+and+Disease+Implications.">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li><li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function.">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li><li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility,+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry.">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH((R))+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF((R))+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques.">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides,+but+assess+only+the+ones+they+care+about.">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מתאר טכניקה מקורית של העשרה PTM בו מרובים כדי להבין בצורה יעילה יותר את הוצלב PTM. שיטות חלופיות להגיע למטרה זו נוטות להיות מצרך ארוך ויקר בזמן, והם דורשים כמויות גדולות של חלבון כדי להצליח11,13. פרוטוקול זה מציג את זרימת העבודה העשרה PTM המערבת הדגירה של הנוגדן חרוזים מצודים עבור שני לפטין בו כדי לשפר את היעילות הכוללת של הניסוי. שיטה זו כרוכה גם השימוש דה עבור הדור הספריה ספקטרלית ורכישות DIA MS כדי לזהות ולכמת את פפטידים נוכח הפרעה מופחתת מיוני קטע22,23. תוכנות, כגון מנועי החיפוש של MS מסד נתונים משמשים לניתוח ומכמת נתונים מרכישות לוד, בעוד תוכנת פרוטאומניקס כמותית24 ו ניתוח מסוים כמותי התוכנה25 יש צורך לפרש את ספקטרום מורכב המיוצר על ידי הרכישות דיה.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה שיש לעקוב אחריהם בזהירות. ככל שהמטרה העיקרית של הפרוטוקול היא להעשיר עבור מספר רב של מונים בו, השלב ההעשרה של הנוגדן (סעיף 2) הוא קריטי להצלחת הניסוי. בעת ביצוע שוטף על החרוזים, זה הכרחי כדי להבטיח שאף אחד החרוזים לא מנושב בטעות. הבטחת ריכוז אוריאה כבר מדולל ל 1 M לפני העיכול עם טריפסין (שלב 1.8) הוא גם הכרחי. למרות 8 M אוריאה נדרש קודם לכן בפרוטוקול עבור מסיסות חלבון, ריכוזי אוריאה מעל 1 M לעכב את פעילות אנזימטית של טריפסין. בנוסף, חשוב לבדוק בעקביות את ה-pH של המדגם לאורך כל הפרוטוקול. זה חשוב במיוחד לפני העיכול. אם ה-pH של המדגם ואת התמיסה טריפסין אינם מנוטרלים כראוי לפני הדגירה, זה יכול לגרום לעיכול לא יעיל שבו אתרי מחשוף רבים עלולים להיות מחמיץ, וכתוצאה מכך פחות שמות פפטיד.
כמה שינויים בפרוטוקול עשויים להועיל בעת הכנת דגימות. עבור חלבון ליפוסט מתוך 1 מ"ג של חומר התחלתי, רבע של חרוזי נוגדנים המסופקים בכל צינור סריקה PTM ניתן להשתמש כחלופה חסכונית. כמות גדולה יותר של חומר התחלתי ניתן להשתמש לתוצאות טובות יותר, כל עוד כמות של חרוזי נוגדן המשמשים מוגברת באופן פרופורציונלי. שינוי נוסף שיכול לשפר את זרימת העבודה הוא לעכל דגימות עם פרוטאז אחר בנוסף לטריפסין. שינוי זה יגרום להשתנות יותר הפפטידים ביקבו, מתן כיסוי מוגבר של שאריות חלבון. למרות שאין צורך בכך, מומלץ להשתמש בטריפסין כאחד מהאנזימים המשמשים לניתוח PTM בשל המחשוף הגבוהשלה.
הגבלה של פרוטוקול זה היא כי לומדים לחקור את הצורך בchemistries דומים כדי להיות מועשר בו זמנית14. ההליכים עבור מחרוזת נוגדנים שונים החרוזים חייב להיות דומה, ניצול ממיסים ופתרונות דומים, כולל תנאי הימנעות דומים, ורצוי מאותו ספק. מסיבה זו, השיטה המתוארים כאן משתמשת באופן עקבי באצטלציה ובסורחון כדוגמה, שניהם משתמשים בכלי השימוש בנוגדנים בחרוזים (תא איתות טכנולוגיה, Inc). למרות ששיטה זו יכולה תיאורטית להיות מוחלת על כל מספר של פטין, מחקרים נוספים יהיו נחוצים כדי להעריך את המגבלה המדויקת של הפרוטוקול בהקשר זה. יתרה מזו, מאחר שזוהי שיטת העשרה המבוססת על נוגדן, השיטה יכולה לספק רק קוונפיקציה יחסית של אתרי PTM.
בהשוואה לשיטות העשרה הקיימות של מולטי-PTM, זרימת עבודה זו היא חלופה אפשרית וחסכונית יותר. מתוך ניסוי זה, נצפתה כי היעילות של שיטה זו משווה בצורה מאוד טובה עם שיטות חלופיות, כגון enrichments בודדות או טוריות. איור 2B מראה כי קורות חיים חציון עבור שונה אזורי השיא פפטיד הצטמצמה למעשה בשיטה אחת-סיר בהשוואה ל יחיד ptm enrichments ו-serial-ptm enrichments13. ניתחנו עוד את התוצאות הנסיוניות הערכת כימות ברמת האתר לאצטלציה או לסורחון. בנוסף, ניתוח מתאם ספיטמן (איור 2ג, ד) הראה כי העשרת הסיר ptm האחד הופיע באופן דומה לזרימות העבודה העשרה בודדות. הדבר נכון גם לגבי יחסי המין הפפטיד-וברמת הרסיס. אותה התבוננות שנערכה עבור כל שלושת הקשרים בעת השוואת סיר אחד עם העשרה טורית PTM.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להפוך תובנות ביולוגיות מרתקות לתוך הוצלב PTM באופן מהיר וחסכוני. רכיב ה-DIA של זרימת העבודה מאפשר לחוקרים להבין יותר אודות האזור, כפי שהוא מספק מידע על הלוקליזציה של האתר ומתגבר על אתגרים כגון תפוסת האתר הנמוכה של לפטין. יוני מקודמן נוטים להיות כלולים עם דה, אשר חשוב במיוחד כאשר לימוד האתר הפרטי, כאשר תפוסת אתרים היא לעתים ניתן לבצע ניסויים מעקב כדי להעריך את הגבול העליון של כמה מילישניות ניתן להעשיר בו זמנית באמצעות שיטה זו. שיפור עתידי של זרימת עבודה זו עשוי לכלול פיתוח של פלטפורמות תוכנה מתקדמות יותר כדי להפוך עוד יותר את הניתוח של לוקליזציה באתר ותפוסת האתר PTM.

מספר עצום של שינויים שלאחר המעבר באופן דינאמי להסדיר חלבונים ומסלולים באמצעות אפקטים על הפעילות1, איתות2, ומחזור3,4. לדוגמה, מופעלות החלבונים מופעלים או מנוטרלים על-ידי הוספת קבוצות פוספט5, ומרחרחון ושינויים אחרים מספקים מנגנון לשינוי מבנה כרומטין ומשמשים כמנגנוני הרגולציה הטרנססוניים6,7. בשנים האחרונות, הראיות נטען כי עבודה מרובים לפטין בקונצרט או להתחרות כדי להסדיר את תפקוד החלבון או פעילות8,9,10,11. לכן, הבנת הצלבות PTM היא הצורך המתעוררים במחקר PTM. עם זאת, מרבית זרימות העבודה הזמינות לזיהוי ולכמת אתרי PTM להתמקד בשינויים בודדים, ולא הגומלין של שינויים מרובים. זרימת העבודה המתוארת מתאמת שינוי מסוים בחלבון "נקודות חמות" ושאריות ליזין שהשתנו על-ידי מספר מרובה של מיליפטין.
יש צורך הולך וגובר בקהילה המדעית בשביל שיטות שונות ללמוד במקביל בו12. רוב השיטות כדי לזהות ולכמת באופן כללי את האתרים של סוגים מרובים של לפטין הם מאתגרים בשל העלויות הגבוהות וכמות הרקמות הנדרשות12,13. לא רק הם ניסויים העשרה multi-PTM הזמן צורכת מבחינת ההכנה לדוגמה, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, אבל מחקרים אלה דורשים בדרך כלל גדול ולעתים קרובות כמויות של חלבון11. המתואר כאן הוא פרוטוקול להעשרה וניתוח בו של מספר מיני מדינות, אשר גם מטפל בכמה מחסומים אלה ומאפשר יצירת פרופיל PTM בקנה מידה גדול והערכת הצלבות בין שונות לפטין14. זו זרימת העבודה של סיר אחד מתווה דרך מעשית עבור חוקרים ביורפואיים לפרופיל גלובלי מרובים לפטין, לזהות פפטידים שונו, וללמוד ptm הוצלב בדרך יעילה וחסכונית14,15.
כאן, שיטה זו היא לראווה על ידי בחינת אכלציה חלבון מיטוכונדריאלי, אשר נחקרו לראשונה לפני 50 שנים16. זה מתמקד במיוחד על ליזין מרחלציה17 ו סורחון18, כולל המופע המשותף של שינויים אלה על חלבונים ואפילו שיתוף השינוי ברמת פפטיד. מאז המחקר משתמש sirtuin 5 (SIRT5) הסתרה מודל העכבר, זה נבחר להתמקד על העשרה של מרחלציה ואתרי סורחון. החלטה זו נעשתה מכיוון שאתרי הסולציה הם מטרות של SIRT5 דסוינילאז, ולכן הם צפויים להראות upregulation משמעותיים בעכברים קו, מה שהופך אותם לחלק הרלוונטי ביותר במקרה זה. שתי מילישניות הן רלוונטיות ביולוגית כפי שמסוכם לאחרונה על ידי קאריקו ואח '19. באופן כללי, מרחלציה מראה השפעות חשובות על ביטוי גנים ומטבוליזם, וסורחון דווח לווסת את חילוף החומרים של הלב ותפקוד20.
הפרוטוקול המתואר ניתן לבצע עם כמות נמוכה של חומר קלט חלבון (g., 1 מ ג של חלבון ליפוסט) ומפחית את המשך הכולל של הניסוי על ידי הפחתת הזמן שהושקע עבור עיבוד דגימת, MS הרכישה, וניתוח נתונים. תרשים שרטוט של זרימת עבודה מסופק באיור 1. השתמשנו גם כמויות נמוכות יותר של חומר התחלתי (עד 100 μg של חלבון ליפוסט, להקטין את כמויות החרוזים בשימוש בהתאם), אשר כצפוי, מפחית את התשואה הכוללת של פפטידים acylated מזוהה; עם זאת, הוא עדיין מספק תוצאות בעלות ערך רב ופפטידים acylated הניתנות לכימות.
בעוד זרימות עבודה מלמעלה-למטה או הביניים למטה בדרך כלל לא להשתמש בגישות לעיכול פרוטחרדה (ובכך לשמור על הקישוריות של מספר לפטין בתוך חלבון אחד), פרוטוקול זה מתמקד בגישה מבוססת פפטיד העשרה כדי לצבור עומק נוסף רגישות עבור זיהוי PTM וכימות (איור 1). בנוסף, זו זרימת העבודה פפטיד-ממוקד מנצל שיטות מודרניות ספקטרומטר המסה, כולל 1) שילוב של רכישה תלוי נתונים (דה) כדי ליצור ספריות ספקטרליות, ו 2) לרכוש עצמאית נתונים (DIA) עבור כימות PTM מדויק בתהליך עבודה ללא תווית.
זרימות עבודה של DIA להתגבר על מערכת הדגימה של מערכות הסריקה האופייניות של דה-לוד באמצעות מקטעים מגוונים באופן מקיף את כל האותות הפפטיד בטווח של21שנדגמו. תכונה זו גם מועילה מאוד מבחינת הלוקליזציה של האתר, כי קל יותר לקבל מידע לגבי אילו יוני קטעים ספציפיים משתנים בתוך הפפטיד. בנוסף, זרימות עבודה של DIA מאפשרות זיהוי וכימות של מקטין PTM-פפטיד איזוטפסים עם יונים מקודמן זהה. שיטות DIA יכולות גם לקבוע לוקליזציה מסוימת של אתר PTM בתוך פפטיד המבוססת על יוני קטעים מתאימים ספציפיים הנמדדים בכל עת. עם זאת, גישה לעתים קרובות לנצל "הדרה דינמית" תכונות שאינן כוללות דגימה מרובים של MS/MS עבור אותו יון מקודמן, ובכך חסר PTM מינורי.
אסטרטגיית ההעשרה הזמנית המתוארת כאן מתאימה באופן אידיאלי למחקרים שיפיקו תועלת מפרופיל עולמי וככמת של מספר רב של מדים לפטין, בחינת מוצלב PTM, והבנת האינטראקציות הדינמיות של שינויים שלאחר ההעברה. זיהוי של מספר לפטין מועשר בזרימת עבודה אחת משולבת תוארה על ידי: גלובל, סדרתי או מקביל העשרה של PTM המכיל פפטידים בחרדה, או לחילופין על ידי ניתוח של חלבונים שלמים. בהשוואה ישירה עם העשרה סדרתיים של מרחלציה וסורחון, היעילות של מתודולוגיית הסיר החד הוקמה כדומה מאוד ל-14. פרוטוקולים חלופיים אלה דורשים כמויות משמעותיות של חומר התחלתי וזמן יכול להיות יקר באופן גמיש. לעומת זאת, פרוטוקול חד-סיר מספק שיטה זולה ויעילה להעשרה של יותר מ-PTM אחד עם הניתוח והזיהוי הבאים.
רקמות הכבד של העכבר מתקבלים מ SIRT5 הסתרה עכברים ומשמשים כאן כחומר מתחיל. פרוטוקול זה יכול גם להתבצע לקבל חלבון lysates מרקמות שונות או ניסויים בתרבות התא. פרוטוקול זה יכול להיות מוחל על lysates חלבונים המתקבלים מרקמות או כדורי תרבות התא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>36XL66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonicator</td>
			<td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#181;m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>5015841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mapDIA</td>
			<td></td>
			<td>web link</td>
			<td>software for interference removal of DIA datasets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89204-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mProphet in Skyline</td>
			<td></td>
			<td>incorporated in Skyline</td>
			<td>integrated statistical algorithms for FDR assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB SPE cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT094225</td>
			<td>cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot 5.0 - &#39;MS database search engine&#39;</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download SCIEX</td>
			<td>MS database search engine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13764</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13416</td>
			<td>antibody beads for affinity enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyline - &#39;Quantitative Proteomics Software&#39;</td>
			<td>MacCoss lab (academic)</td>
			<td>open source software</td>
			<td>Quantitative Proteomics Software (academic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut - &#39;DIA Quantitative Analysis Software&#39;</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td>DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td>instrument to concentrate liquid volume of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>85300</td>
			<td>instrument for efficient lysis of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T6508-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Per quote</td>
			<td>high resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>Model #845</td>
			<td>chromatographic separation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>600-30-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td>
			<td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td>C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous affinity enrichment of two post-translational modifications for quantification and site localization

לימוד שינויים מרובים שלאחר ההעברה (לפטין) של חלבונים הוא צעד מכריע כדי להבין הצלבות PTM ולקבל תובנות הוליסטי יותר לתפקוד חלבון. למרות החשיבות של מחקרים העשרה מרובי PTM, מחקרים מעטים לחקור יותר PTM אחד בכל פעם, בשל חלקית על ההוצאות, זמן, וכמויות חלבון גדול נדרש לבצע ניתוח פרוטמית גלובלי מרובים של לפטין. "אחד הסיר" הקרבה המפורטת בפרוטוקול זה גוברת על המחסומים הללו על ידי המתיר זיהוי סימולטני וקוונפיקציה של פפטידים עם שאריות ליזין המכילים מרחרחון וסורחון בכמות נמוכה של דגימה קלט. הפרוטוקול כולל הכנת מחלת חלבון מתוך כבדי העכבר של SIRT5 הסתרה, הביצועים של טריפסין העיכול, העשרה לפטין, וביצועים של ניתוח ספקטרומטרי מסה באמצעות הרכישה עצמאית נתונים (DIA) זרימת עבודה. מאחר שזרימת עבודה זו מאפשרת העשרה של שתי מילישניות ממדגם זהה בו זמנית, היא מספקת כלי מעשי לחקר הוצלב PTM מבלי לדרוש כמויות גדולות של דגימות, וזה מפחית מאוד את הזמן הנדרש עבור הכנה לדוגמה, נתונים רכישה וניתוח. רכיב ה-DIA של זרימת העבודה מספק מידע מקיף הספציפי ל-PTM. זה חשוב במיוחד כאשר לימוד לוקליזציה של האתר PTM, כמו DIA מספק סטים של יוני קטעים שיכולים להיות מפוענח מבחינה חישובית כדי להבדיל בין לוקליזציה שונים PTM isoforms.

איור 1 מציג דיאגרמה כללית של זרימת העבודה, כולל קצירת הרקמה מתוך כבדי העכבר, באמצעות 1 מ ג של חלבון לעכל את החלבון ליפוסט עם טריפסין, פפטידים דגירה עם נוגדן מעלה חרוזים, רכישת דגימות על MS, ולבסוף ביצוע הניתוח DIA/הרצועה של הנתונים באמצעות חבילות תוכנה שונים פרוטאומניקס כ
איור 2A מציג כיצד ציר הזמן של זרימת העבודה וכמויות המדגם והחלבון נדרשים, בהשוואה לשיטות חלופיות המשמשות כיום ללימודי העשרה מרובי-ממדי. ניתן לבצע את שיטת הסיר החד בחצי מהזמן ובמחצית ממספר הדגימות כשיטות חלופיות אלה. בהשוואה לשתי שיטות העשרת היחידות, פרוטוקול חד-סיר דורש גם חצי מכמות החלבון.
פרוטוקול זה הוכח כחלופה אפשרית וחסכונית. איור 2B מראה כי המקדם החציוני של וריאציה (קורות חיים) עבור אזורים פפטיד שונה היה נמוך יותר בשיטה אחת מאשר ב-ptm יחיד ו-serial-ptm enrichments. איור 2ג, D מראה כי, בזמן השוואת ptm בסיר אחד ושיטות העשרה חד-שנתיים, אין הבדלים ראויים לציון בין יחסי הגומלין של ברמת האתר לבין שני השינויים. הדבר נכון גם לגבי יחסי הגומלין ברמת הפפטיד וברמת הרסיס. אותה התבוננות שנערכה עבור כל שלושת הקשרים בעת השוואת הסיר אחד ו-serial PTM enrichments. כל הנתונים הבסיסיים MS raw ועיבוד גליונות תוצאות Excel המשויכים הדו ח האחרונות על ידי בסיסה et al.14 זמינים וניתן להוריד מ מסיבית (MSV00081906) ו-פרוטאוצ'יינג (PXD008640).
באופן כללי, בעוד אסטרטגיות העשרה הנוגדן עשוי להראות מגבלות מסוימות, כגון כאפיפי פוטנציאל הסגר או ספציפיות, הנוגדנים המשמשים במחקר זה הם תערובות של שיבוטים שנוצר באופן עצמאי ובכך לספק טווחים רחבים יותר של . מיוחד למדי
תוצאות נסיוניות מתעד את האפשרות של זיהוי והערכה של הוצלב PTM. איור 3 מציג נתונים מתוך העשרה מוצלחת וממחיש דוגמה עבור פפטיד המכיל שינויים מרובים acyl שונים והמחשה הצלבות ptm. איור 3מראה פפטיד הacetylated על שארית ליזין אחת ומסופחת מצד שני, ואיור 3ב' מראה את הפפטיד המקביל בשני הסינוסים. הדבר ממחיש כי אותו שארית ליזין ניתן לשנות עם שתי קבוצות האקלציה, ויש אפשרות של הוצלב המתרחשים באתר זה. איור 4 מציג את מספר שאריות ליזין שזוהו כמתואר בסעיפים 7.1-7.3 כדי לבצע את שני השינויים, גם הצבעה לקראת הוצלב אפשרי ptm.
כמו איור 5 מדגים, עיבוד הנתונים DIA ptm עם תוכנת פרוטקומניקס כמותית מאפשר לנו להצביע על שאריות מסוימים ליזין משתנים. זהו קונספט הידוע כלוקליזציה של האתר, שהוא צעד חיוני עבור כל ניתוח לקביעת הצלבות של PTM אפשרי. איור 5 מציג 2 איזוטפסים פוטנציאליים יחד עם היונים המאשרים והתדלוק עבור כל אחד שיכול להיות מדומה ומוערך כמתואר בסעיפים 8.1-8.3 (במיוחד צעדים 8.3.2 ו-8.3.3). בהתבסס על מידע זה, הצלחנו לזהות בביטחון מי מבין שני איזוטפסים היה נוכח במדגם המקורי. הספקטרום MS/MS של isoform המאושר Kqygeafe, מדגים בבירור כי y יונים (y2-y5) המכיל את שאריות acetylated ליזין, אשר הוזז על ידי 42 m/z (המסה הקבועה של קבוצת מרחקסיל), אישר את שאריות ליזין ספציפיים ב פפטיד שהשתנה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> איור 1: זרימת עבודה אופיינית עבור העשרת הסיר של פטין. הרקמה (כאן, כבדים) נקצרו מ SIRT5 KO ו פראי סוג (WT) עכברים, וחלבונים הם הפכו, טריפסין-מתעכל לתוך פפטידים, ו התפלה. פפטידים הם מועשרים לאחר מכן על ידי זיקה חיסונית עם שילובים של חרוזים סוקסיל ומרחפי-נוגדן. מקבילים MS זרימות עבודה למדוד את שניהם 1) קטן של ביטוי חלבון מלאה הביטוי שינויים (עבור נרמול חלבון) ו 2) פפטידים מועשר המכילים מכיל המכיל מזהה acyl האתר (דה-MS) ולוקליזציה של האתר, ואחריו ככמת (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> איור 2: השוואת זרימת עבודה של סיר אחד עם שיטות חלופיות. (א) השוואה של זמן, עלויות, וחומרים הנדרשים עבור זרימת העבודה של סיר אחד, העשרה טורית ptm, ושני ptm יחיד enrichments. (ב) השוואת קורות חיים בין זרימת העבודה החד, העשרה בודדת ליזין ptm, והעשרה בודדת ליזין ptm. ניתוח מתאם ספיטמן השוואת אזורי הפסגה של האקקסיל המתקבלים מזרימת העבודה של סיר אחד, ו-PTM יחיד enrichments: מגרשים המקביל של תוצאות אזור שיא log2 עבור (C) מרחלציה אתרים ו-(ד) סורחון אתרים. מדרונות הרגרסיה וגורמי המתאם מצוינים בלוחות הבודדים14. שני משכפל ביולוגי עצמאי עובדו עבור כל אחד מהתנאים. דמות זו השתנתה מתוך בסיליסטי ואח '14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> איור 3: הוצלב בין מרחלציה וסורחון שינויים של שאריות ליזין. MS/MS ספקטרום של פפטידים טריפטיים מ מיטוכונדריאלי 3-באקקסיל-CoA thiolase כי להראות את אותו רצף חומצות אמינו, אבל שונו על שני שאריות ליזין עם שונה לפטין. (א) MS/ms של פפטיד (ב) טרשת נפוצה (ב) ms/ms של פפטיד לאחר מפיייב כפיר k 'הג המאביק. דמות זו השתנתה מתוך בסיליסטי ואח '14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> איור 4: חפיפה והצלבות בין שאריות ליזין הacetylated והתמציתית-דוגמאות ספציפיות למערכות חלבונים. (א) דיאגרמת חיתוך-קבוצותהמציגהחפיפה בין 2,235 מרחלציה ו-2,173 אתרי סורחון. מתוך אלה, 943 האתרים היו acetylated ומסובטים. הכבד מתוך SIRT5 (דה סוסוקלז) העכבר היה מנותח, ואתרי סורחון רבים זוהו. למעשה, הם היו יותר בשפע מאשר בדרך כלל נצפתה בכבד העכבר (פפטידים שונו היו מסוננים בערך Q של < 0.05). (ב) מתחמי חלבונים המראים את אחוז היחידות המשנה שלהם, המכילים גם acetylated ואתרים מסווניים (קו אדום מודגש מייצג את המשמעות כפי שנקבע במבחן המדויק של פישר). (ג) דיאגרמת מורכבות של ATP: יחידות המשנה של החלבון באדום מתארות את יחידות המשנה המכילות הן acetylated והן אתרים מסורזים. דמות זו השתנתה מתוך בסיליסטי ואח '14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> איור 5: תוכנת פרוטקומניקס כמותית הוא את הלוקליזציה של אתר פפטיד. בהתבסס על פיצול MS/MS של פפטיד, ניתן לספק מידע על השאריות ליזין ספציפי הקבוצה מרחלקסיל משנה. זה מציג את היכולת של התוכנה להציע מידע רב ערך על הלוקליזציה של האתר של לפטין (א) שתי אפשרויות של שינוי ליזין שאריות ו PTM האתר לוקליזציה: KQYGEAFEkacR (משמאל) ו kacqygeafekr (מימין). "מאשרת" ו-"התדלוק" יונים קטעים מוצגים עבור כל אחד מאתרי הלוקליזציה של האתר הפוטנציאלי של הפפטיד. בהתבסס על מידע זה, מאשרים ציונים ותוצאות התדלוק מוקצים, המאשר את הנוכחות של איזוטופס KQYGEAFEKacבמדגם. (ב) MS/ms הספקטרום המתאים האיזוטופס מאושר KQYGEAFEkacR המציין כי כל יוני y כולל שאריות acetylated ליזין (y2 ומעלה) לשאת מסה תוספת של + 42 m/z, אשר מתאים לשינוי מרחקסיל. יונים שנצפו b אינם מכילים את השינוי. (ג) מחולץ יון כרומאטוגרמה (XIC) עם אזורים שיא שופע הנובע y2 ו-y3 יונים, שניהם מהווים את האתר מרחרחון ב ISOFORM המאושר KqygeafekacR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization at JoVE.com

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה החדשה להעשרה בו זמנית של PTMs מרובים עם נוגדנים ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה רכישה עצמאית נתונים כדי לקבל תובנה ביולוגית על לוקליזציה באתר ו שיחה צולבת. זוהי טכניקה זמן וחסכונית המאפשרת זיהוי וכמות בו זמנית של פפטידים עם חיתוך המכיל אצטילציה ו PTMs succinylation עם כמויות קטנות בלבד של קלט מדגם. מעקב אחר שינויים לאחר התרגום הוא צעד חשוב באפיון ומאבק במצבי מחלה שונים.אנחנו כבר מודעים לכך ש סוגי סרטן וסוכרת מסוימים מוסדרים מאוד באמצעות שינויים אלה בחלבון. שיטה זו יכולה תיאורטית להחיל על כל PTMs עם נוגדנים להעשרה כגון בכל מקום, זרחון ואחרים. זה יכול לחול גם על סוגי רקמות אחרים או מודלים של תרבות התא.המפתח להשגת נתונים בעלי ערך באמצעות טכניקה זו הוא רבייה. זה יכול להיות מושגת על ידי הבטחת כל השלבים מבוצעים בזהירות רבה במיוחד את הצעדים מעורבים גם פדילי הנוגדנים. כדי להתחיל, להשיג מחסניות המכילות C18 שף כי בשילוב עד 10 מיליגרם של חלבון.התאם מחסניות אלה לתוך מנגנון ואקום. הוסיפו 800 מיקרוליטרים של 80% אצטוניטריל ו-0.2% חומצה פורמית למחסניות עם 19.8% מים והתחלו יניקת ואקום כדי למשוך את הנוזל. חזור על שלב זה פעם אחת הימנעות ייבוש של המחסניות לחלוטין.יש לצייד את המחסניות על ידי הוספת 800 מיקרוליטרים של 0.2% חומצה פורמית במים עם שאיבת ואקום. חזור על זה פעמיים. טען פפטידים של מיליגרם אחד בתמיסה של כ- 1,000 מיקרוליטר על המחסניות עם יניקת ואקום.לשטוף את הפפטידים פעמיים עם 800 microliters של 0.2% חומצה פורמית במים תחת יניקה ואקום. לאחר מכן מסדרים צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר מתחת לכל מחסנית כדי לאסוף את הפפטיד. תחת שאיבת ואקום, יש לשאוב פפטידים ממחסניות תחילה עם 800 מיקרוליטרים של 80% אצטוניטריל וחומצה פורמית של 0.2% ב-19.8% מים ולאחר מכן עם 400 מיקרוליטרים של אותו פתרון.יבש את דגימות הפפטיד המותפלות לחלוטין במרכז ואקום למשך שעתיים עד שלוש שעות. עכשיו, תן שימוש חוזר בפפטידים המיובשים ב-1.4 מיליליטר של חיץ טיהור חיסוני קר פי 1. מערבולת לערבב ולהבטיח pH של כ 7.צנטריפוגה הדגימות ב 10, 000 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. גלולה קטנה מופיעה. מניחים את הפפטידים בצד על קרח בזמן הכנת גם גם נוגדנים.הוסיפו מיליליטר אחד של PBS 1X קר לצינור המכיל 100 מיקרוליטרים של תרחיף חרוזים נוגדן K-אצטיל וצינור המכיל 100 מיקרוליטרים של תרחיף פרעוזי נוגדנים K-succinyl ומערבבים על ידי צינור. מעבירים את כל הפתרון לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר ומסובבים בצנטריפוגה מיניאטורית למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. שאף PBS דואג להימנע שאספירה את כל חרוזים.חזור על לשטוף שלוש פעמים נוספות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר לחרוזים בכ-440 מיקרוליטרים של PBS. פיפטה את חרוזים מספר פעמים כדי לערבב היטב.עם 200 טיפים מיקרוליטר precut, להעביר 100 microliters של כל בחנות נוגדן אצטיליסין וחרוזי נוגדנים succinyllysine לתוך צינור חדש. סובבו למטה במשך 30 שניות בצנטריפוגה מיניאטורית ושאוף את התקשורת עם קצה מטעין ג'ל. חרוזים עכשיו להפוך לבן.פיפטה הפפטיד המתומשך ישירות אל חרוזים שטופים להידגר פפטידים עם חרוזים בארבע מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה. בבוקר, לסובב את דגימות פפטיד ב 2, 000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את העל-טבעי המכיל פפטידים לא מאוגדים ושמור לניסויים עתידיים במידת הרצוי.מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ טיהור אימונואפינטיות קר פי 1 אל חרוזים כדי לשטוף ולערבב על ידי היפוך חמש פעמים. סובב ב 2,000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את פתרון טיהור האימונואפינטיות וחזרו על שלב הטיהור האימונואפינטי פעם נוספת.לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מי HPLC קרים לחבילות ומערבבים על ידי היפוך חמש פעמים. סובב ב 2,000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו מהמים וחזרו על שלב שטיפת המים פעמיים נוספות.לסובב זמן נוסף ב 2, 000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כל המים הנותרים בתחתית הצינור. עם טיפים שטוחים להעמסת ג'ל, שאפו את כל המים הנוספים שאספו. היזהרו להימנע מחשיפת חרוזים.הוסיפו 55 מיקרוליטרים של 0.15% חומצה טריפלואורואצטית במים לקדוזים. הדגירה את חרוזים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך הקשה מדי פעם על החלק התחתון של הצינור לערבב. לסובב את חרוזים בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות בצנטריפוגה מיניאטורית.השתמשו בקצה טעינת ג'ל שטוח כדי להעביר את הפפטידים האלודים לצינור חדש. הוסיפו 45 מיקרוליטרים של 0.15% חומצה טריפלואורואצטית במים לקדוזים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך הקשה על החלק התחתון של הצינור מדי פעם לערבב.סובבו את החמרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות בצנטריפוגה המיניאטורית. מוציאים את האלוטיון השני בעזרת קצה טעינת ג'ל שטוח ומשלבים אותו עם האלוטיון הראשון. סובבו את הפפטידים האלודים המשולבים ב-12,000 פעמים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לסלק את כל החמוזים שנושאים.מעבירים את פתרון דגימת הפפטיד לצינור חדש של 500 מיקרוליטר. בנו את שיטת הטעינה כדי לטעון את תערובות הפפטיד המועשרות על שבב C18 לפני העמודה והתפלת הפפטידים שוב על ידי שטיפה עם שלב A נייד בשני מיקרוליטרים לדקה למשך 10 דקות. בנה את שיטת הכרומטוגרפיה כך שפפטידים יועברו לעמודה אנליטית ויתרחקו בקצב זרימה של 300 ננוליטר לדקה עם מעבר הדרגתי של שעתיים עד שלוש שעות באמצעות שלבים ניידים A ו- B.באופן ספציפי, השתמש במילוי הדרגתי ליניארי מ- 5%mobile phase B ל- 35%mobile phase B במשך 80 דקות.לאחר מכן, שיפוע את השלב הנייד B ל-80% במשך חמש דקות ולאחר מכן החזק ב- 80%B למשך שמונה דקות לפני שתחזור ל- 5%B לשווי משקל מחדש של 25 דקות. לאחר מכן, בנה שיטת כלי MS עבור רכישה תלוית נתונים. לניסוי ראשון, הגדר סריקת יון מבשר MS1 מ- M/Z 400 עד 1, 500.הגדר את משך הזמן ל- 120 דקות. צור ניסוי IDA ולחץ על אישור. תחת הכרטיסיה קריטריוני מתג, הגדר את סף העוצמה להפעלת סריקות MS/MS לאיתור יונסים של מדינות טעונות בין שניים לחמישה עד 200 ספירות לשניה. הגדר את ההחרגה הדינמית של היונים המבשרים ל- 60 שניות.לניסוי שני, הגדר סריקת יון מוצר MS/MS עם טווח סריקת MS2 מ- M/Z 100 עד 1, 500. לחץ על עריכת פרמטרים והגדר את התפשטות אנרגיית ההתנגשות לחמש ובחר את מצב סריקת היונים של המוצר בעל הרגישות הגבוהה. לבסוף, מקם את הדגימה לתוך הדגימה האוטומטית.שלח את התור לדוגמה והתחל את שיטות הרכישה של LC-MS/MS בבניית שיטת מכשיר MS לרכישה עצמאית של נתונים ולהגדרת שני ניסויים בסריקת מכשירים. בצע סריקות יון מבשר MS1 מ 400 ל 1, 250 מסה כדי לטעון ולהגדיר את משך הזמן ל 120 דקות. הגדר את התפשטות אנרגיית ההתנגשות ל- 10 ותזמן הצטברות ל- 45 אלפיות שניה ולאחר מכן בחר את מצב סריקת היונים של המוצר בעל הרגישות הגבוהה.לאחר מכן, יבא קובץ טקסט המכיל את ערכת הרכישה DIA SWATH של חלון משתנה 64 כדי לאכלס חלונות רכישת SWATH בשיטה. בתכנית רכישה זו, חלונות משתנים הנעים בין חמש ל -90 מסה לטעינה ורוחב מועברים בצעדים מצטברים על פני טווח המסה המלא של 400 עד 1, 250 מסה כדי לטעון עם סך של 64 מקטעי SWATH כל אחד עם זמן הצטברות של 45 אלפיות שנייה. התאם את זמן הצבירה של MS1 ל- 0.25 שניות.יחד, סריקת MS1 וסריקות MS2 64 אמורות להניב כעת זמן מחזור כולל של 3.2 שניות. במחקר זה, תוצאות הניסוי תיעדו את האפשרות של גילוי והערכת PTM cross-talk. טבלה זו מראה כיצד ציר הזמן של זרימת העבודה ואת כמויות הדגימה והחלבון הנדרשים.השיטה של סיר אחד יכולה להתבצע במחצית הזמן ועם מחצית ממספר הדגימות כמו שיטות חלופיות אלה. מקדם הווריאציה החציוני עבור אזורי הפפטיד ששונו היה נמוך יותר בשיטת הסיר האחד מאשר בהעשרת PTM יחידה ו- PTM טורית. תוך השוואת שיטות העשרת PTM בסיר אחד ו- PTM יחיד, לא היו הבדלים בולטים בין המתאמים של כימות ברמת האתר עבור שני השינויים.איור זה מציג נתונים מהעשרה מוצלחת וממחיש דוגמה לפפטיד המכיל שינויים מרובים ושונים ב-acyl המדמיין דיבור צולב של PTM. פפטיד היה אצטילציה על שאריות ליזין אחד ותמציתי על השני ואילו כאן אותו פפטיד היה מרוטש בשתי ליזינים. זה מדגים כי אותו שאריות ליזין ניתן לשנות עם שתי קבוצות acylation ויש אפשרות של שיחה צולבת המתרחשים באתר זה.זה חיוני כדי לוודא כי כל מדגם מכיל את אותה כמות של חרוזים ולוודא כי אף אחד חרוזים הם שאפו בטעות בעת שטיפת חרוזים פפטיד. פרופיל מבוסס ספקטרומטריית מסה וניתוח נתונים בכלי תוכנה כגון Spectronaut מבוצעים בעקבות הליך זה כדי לזהות, לכמת ולבצע לוקליזציה של אתרים של PTMs. זרימת עבודה זו של רכישה עצמאית לנתונים בשילוב עם העשרת PTM בו זמנית תפתח אפיקים כדי להעריך ביעילות רבה יותר את הדיבור הצולב של PTM ולספק תובנות טובות יותר לגבי הרלוונטיות של איתות PTM.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...